저자 zebrafish 그들의 관심과 유지 보수를 위해 Zebrafish 연구 직원 Freimann 생명 과학 센터와 센터를 감사드립니다.

1. Resuspend Morpholino <ol><li> 약 3 밀리미터 솔루션을 만들기 위해 nuclease없는 물 100 μl로 플루오레신-태그를 morpholino 300 NM을 희석. morpholino 솔루션은 여러 파라핀 - 밀봉된 microcentrifuge 튜브로 aliquoted 및 실내 온도에서 그리고 멀리 빛과 저장됩니다. </li><li> 정확한 morpholino 농도를 확인하려면, 0.1 N HCL의 95 μl에 morpholino 용액 5 μl (또는 빈과 같은 물) 희석. 물의 빈과 265 nm의에서 분광 광도계에 대한 기준을 설정하고 희석 morpholino 솔루션의 독서를 결정한다. μl / NG의 농도를 결정하기 위해 결정 상수 의해 희석 요소별로 morpholino의 흡광도를 곱하면됩니다. morpholino의 상수로 계산됩니다 : Morpholino 상수 morpholino X 1000/molar의 흡광도의 = 분자량. morpholino 대한 분자량과 어금니 흡광도가 &quot;에서 찾을 수 있습니다제품과 함께 제공 Oligo 등록 정보 &quot;시트. MM의 농도를 결정하기 위해 분자량에 의해, μl / NG. morpholino을 희석 필요한 경우 작업 농도로, 일반적으로 1.2 밀리미터에서 morpholino 농도를 나누십시오. </li></ol> 2. 지느러미 절단 <ol><li> Tricaine 또는 탱크 물 속에 1.0 밀리그램 / ML에서 2 phenoxyethanol 어느 성인 zebrafish를 마취. </li><li> 첫 lepidotrichial 분기 지점 근위 무균 메스이나 면도기 칼날을 사용하여 지느러미를 절단. 이것은 각각의 동물에서 같은 말초 / 근위 위치 (지느러미 띠에서 말초 예 : 7 골질 세그먼트)에서 수행되어야합니다. 중요 : 동물의 후부 / 앞부분은 비행기로 완벽하게 수직 절단해야합니다. 각도 인하는 지느러미 지느러미와 복부 반쪽의 고르지 지느러미 가지가 높아집니다. </li><li> 탱크에 물고기를 반환합니다. 우리는 일반적으로 33에서 물고기를 유지 ° C의 재생 속도를 증가합니다. W, 실험 설계에 따라지느러미 재생을위한 호수 가운데의 작은 섬 0~2일 포스트 절단이 (DPA) morpholino을 도입하기 전에 시작합니다. 대체 접근법은 아래의 토론에서 논의됩니다. </li></ol> 3. Morpholino 분사 <ol><li> 이전 morpholino을 주입에 하루, 사출 플레이트 (그림 2)를 확인하십시오. microinjection 절차 물고기를 안정화하는 데 도움이 글쎄, 한 끝에 노치 잘라해야합니다. </li><li> 이 DPA에서 마이크로 사출 장치와 morpholino 솔루션을 준비합니다. </li><li> 5 분, 적절한 농도 (1.2 밀리미터로 시작하는 것이 좋습니다)와 65 ° C의 물을 욕조에있는 곳으로 플루오레신 태그가 추가된 morpholino을 희석. </li><li> 바늘 풀러를 사용하여 마이크로 사출을 위해 유리 바늘을 당기세요. </li><li> morpholino 같이 바늘을로드합니다 (참고 : 귀하의 바늘을하면 바늘이 처음로드, 또는 먼저 끝을 잘라 여부를 확인하는 것입니다 당신이 채울 또는 프론트로드했는지 여부에 따라). </li><li> 에서 바늘 오프 팁을 잘라N 각도. </li><li> 사출 당 morpholino의 약 5 NL 기포를 주입하기 위해 마이크로 분사 시스템의 지시를 따릅니다. morpholino의 더 큰 볼륨 조직을 방해 수 있습니다. </li><li> 사출 접시의 생선과 장소​​를 마취. 모든 과잉 액체와 적절한 위치에 동양 바늘, 골질 레이 (그림 3)에 단지 말초를 제거합니다. morpholino 주사 (특정 시약의 표 참조)에 적합한 현미경과 microinjection 장치를 사용하여 그림 3에서와 같이 사후에 앞부분의 지느러미로 morpholino 투입. 앞부분에 후부에서 주입하면 지느러미 조직은 주사하는 동안 잠깐 붙였다 인해 매우 어렵습니다. </li><li> 각 뼈다귀 레이 단지 말초 재생 휴지, (그림 3에서 &quot;1&quot;표시)에 부드럽게 바늘을 삽입하고 (그림 3에서 &quot;2&quot;로 표시) 아체에 위치까지 밀어 distally. EN을 통해 바늘을 밀어하지 않도록주의타이어 지느러미. 바늘이 제대로 현지되면 (즉, 한 번 클릭) morpholino 투입. 1.2 밀리미터에서 플루오레신 태그가 추가된 morpholino 솔루션은 심지어 정상적인 빛 조건에서 황록색 나타납니다. 각 주사로 morpholino 솔루션의 노란색 &quot;퐁퐁&quot;는 시각이 될 수있는가 아체에 주사를 집중하는 데 도움이됩니다. morpholino 솔루션의 약 75 NL (10-15 클릭수는) 뼈다귀 선 당 주입해야합니다. 일시 정지 ~ 클릭 사이의 1 초. 우리는 electroporation 전용 컨트롤로 복부를 사용하여 지느러미 측면만을 주입. 양자 택일로, 하나는 지느러미 복부 이분의 일에 컨트롤 morpholino를 사용하여이 모든 절차를 반복 수 있습니다. </li></ol> 4. Morpholino의 Electroporation <ol><li> 즉시 morpholino의 주입에 따라, 마이크로 분사 장치에서 분사 판을 제거합니다. 물고기 빠져들 때까지 마취 용액과 잘 사출 접시를 채우십시오. electroporation은 물 선 아래 수행됩니다. </li> &lt;리&gt; 3mm 직경 플래티넘 플레이트 트위터 전극은 (CUY 650-P3 족집게, Protech 국제) 지느러미의 약 절반에 펄스를 localizes. 지느러미 조직에 전극을 만지지 않도록주의하십시오. 전극은 지느러미 조직을 건드리지 않도록하려면 해당 지느러미쪽으로 물고기를 회전하고 바로 electroporation을위한 중간선에 깔고. </li><li> Electroporate 양쪽 지느러미와 복부 지느러미 측면 CUY21 스퀘어 웨이브 Electroporator을 (Protech 인터내셔널 주식 회사)를 사용하여 (비 특정 electroporation 효과를위한 조종하는). 형성했을 수있는 모든 거품을 제거하기 위해 각 electroporation 후 젖은 KimWipe으로 전극을 닦아주십시오. 그들이 제거되지 않으면 미니 수수료가 발생하고, 전극쪽으로 조직을 유치할 수 있습니다. electroporation 매개 변수는 펄스 사이의 1 초의 일시 정지와 15 V에서, 열 연속 50 밀리초 펄스로 설정되어야합니다. </li><li> N을 확인하고, 유리 슬라이드 또는 배양 접시에 생선과 빠르게 이미지 지느러미를 배치지느러미 / 복부 방향을 ote. 이 이미지는 다음 날에 regrowth 분석에 사용됩니다. 탱크에 물고기를 반환합니다. </li></ol> 5. 분석 <ol><li> 식에 무너 뜨 렸어되었다 타겟 단백질이 적절한 지느러미 재생에 필요한 경우, 지느러미 지느러미와 복부 반쪽 사이 극적인 차이는 분명해야 일일 포스트 electroporation (그림 5B). </li><li> 3 DPA에서는 각 물고기의 지느러미의 다른 사진을 가지고 대응이 DPA 이미지 (그림 5B)으로 해당 이미지를 매치할. 동물 사이에 지느러미 착색 패턴의 자연스러운 변화는 정확하게 각각의 물고기를 식별할 수 있습니다. </li><li> NIH 이미지를 사용하여 양쪽 지느러미와 복부 반쪽 (그림 5B)의 2 DPA와 3 DPA 영역을 추적. </li><li> 지느러미 대 복부 사용 다음 수식의 % 면적 확인하려면 : (- 지느러미 2dpa 지느러미 3dpa) /을 (3dpa 복부 -<html> 복부 2dpa) X 100 = % 지역 </li></ol> 6. 대표 결과 <ol><li> 3 DPA, 24 hpe (시간 포스트 electroporation)에서 지느러미 파생물에 대해 우리는 항상 분석. 이때 플루오레신 태그가 추가된 morpholino는 지느러미 지느러미 이분의 일 (보충 그림 1과 그림 6A)에 존재해야합니다. 그것은 일부가 절단 수준 아래로 후행보고 정상입니다. </li><li> 주입 및 제어 morpholinos (그림 6B)와 electroporated 지느러미의 지느러미와 복부 양측 사이에 차이점이 없어야합니다. </li><li> 실험 morpholino는 지느러미 파생물을위한 필수적인 단백질을 대상으로하는 경우 지느러미와 복부 양측 간의 극적인 차이는 (그림 6C) 관찰해야합니다. </li><li> 전극은 electroporation 동안 지느러미를 건드리지 않으면 조직은 갈색 (거의 외모에 소실)과 괴사가 나타납니다. </li></ol>&quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 지느러미 재생하는 동안 발생하는 다양한 이벤트의 도식. 각 이벤트에 대한 기본 시간은 시간 후 절단 (고전력 증폭기)에 주어진 33의 탱크 온도에 대응 ° C를하고 있습니다 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> 그림 2. A. 아가로 오스에서 만들어 morpholino의 microinjection 동안 물고기를 잡아 두 기엔 잘 소형을 포함하는 사출 접시의 개략도. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> 그림 3. morpholino의 microinjection의 도식. A.이 장소 노치에서 생선 머리 접시에 물고기가 물고기가 안정적으로 유지하는 데 도움이됩니다 자, 밖으로 했네요. B. 낮은 배율에서 바늘을 마련 그러세요 그것은 지느러미 재생 조직 가까운 거리에 있습니다. C.이 </stro높은 배율에서 NG&gt;는 각 골질 지느러미 선 (각 아체의 예)에 말초 morpholino 투입. 바늘은 골질 레이 (1) 단지 말초 조직을 입력한 다음 아체 (2)의 위치를​​ 계속해야합니다. 참고 : 회로도에서 녹색 동그라미에만 분사의 위치를​​ 보여주기위한 것입니다. morpholino 간단히 각 분사에 따라 노란색 / 녹색 &quot;퐁퐁&quot;로 시각이 될 수 있으며, 설계도를 같이하지만, 이것은 유지되지 않습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> 그림 4. 지느러미 electroporation의 개략도. A. microinjection 따라 마취 가득찬 배양 접시에있는 생선을 배치하고 지느러미 및 복부 반쪽을 모두 electroporate. 하군요 지느러미 조직을 건드리지해야합니다. 전극은 조직에서 ~ 1mm를 배치해야합니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; 그림 5. 지느러미 가지 억제를 계산하는 데 사용되는 방법의 도식. A. 2 DPA, 바로 앞 또는 뒤에 중 morpholino 주입과 electroporation 각 물고기의 지느러미 사진 찍어봐. 지느러미 (녹색)와 3 DPA에서 NIH 이미지 (검정색 점선 라인). B를 사용하여 지느러미 복부 (파란색) 반쪽 모두의 재생 조직을 추적하고, 각 지느러미의 또 다른 사진을 찍을 다시 지느러미와 복부 부분을 더듬다 NIH 이미지를 사용 regrowth으로. C.는 지느러미와 복부 분리 모두 3 DPA에서 총 regrowth에서 2 DPA에서 regrowth의 영역을 뺍니다. 지느러미 대 재 성장 복부의 퍼센트 영역은 수식을 사용하여 계산할 수 : ((D 3dpa - D DPA 2) / (V 3dpa - V 2dpa)) X 100. %의 억제 = 100 - 퍼센트 지역. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> 기대의 그림 6. 예결과. 지느러미 지느러미 반으로 플루오레신 태그가 추가된 컨트롤 morpholino을 보여주는 A. 형광 이미지, 지느러미 반으로 주입 및 제어 morpholino로 electroporated되었다 지느러미 24 시간 이후 electroporation (hpe). B. Brightfield 이미지 . 이미지는 지느러미, 24 hpe의 지느러미와 복부 반쪽 모두 동등 regrowth를 보여줍니다. 지느러미 반으로 실험 morpholino 주사와 electroporated되었다 지느러미 C. Brightfield 이미지입니다. 이미지 주입 / 지느러미쪽에 regrowth의 억제를 보여줍니다. 라인은 morpholino 주입과 electroporation ~ 2 DPA, 즉시 이전의 regrowth의 양을 보여줍니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> 그림 7. 상처 치유와 아체 형성에 관여 대상 단백질에 대한 대체 분사와 electroporation 절차 도식. 대답 morpholino을 주사지느러미 지느러미 이분의 일의 각 골질 지느러미 선 사이. B.는 정상에 따라 morpholino을 Electroporate. C.는 주사 사이트 (~ 1 골질 세그먼트) 즉시 근위 지느러미를 절단. 디 플루오레신 태그가 추가된 morpholino을 볼 수 있습니다 24 hpe의 상처 상피와 아체 인치 <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> 지느러미의 바로 전에 절단에 주입 및 제어 morpholino로 electroporated되었다 24 고전력 증폭기의 지느러미 그림 8. 상처 상피와 아체 형성을 타겟으로하는 기술을 사용합니다. A. Brightfield 이미지입니다. B. 형광 이미지는 패널 A. 참고로 표시 지느러미의 주입 지느러미 절반 재생 조직의 morpholino을 잘 이해를 보여줍니다. C -. 패널에 표시된 지느러미 지느러미 절반 C &quot;를 높은 배율와 B 사출 사이트는 종종 여전히 볼 수 있습니다 (화살촉)하지만, 많은 타겟 세포는 상처의 상피와 아체 형성 (화살표)에 참여하도록 마이 그 레이션했습니다. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> 그림 9. 아체. A. 형광등과 지느러미와 복부 반쪽 모두에서 주입하고 morpholino 함께 electroporated 지느러미를 보여주 brightfield 삽입된 페이지 이미지를 형성하도록 마이 그 레이션하는 세포를 대상으로 기술을 사용합니다. 지느러미 그런 다음 두 비행기에서 절단되었다. 지느러미 절반 복부 절반 사출 사이트에 대한 말초 9-10 골질 세그먼트를 잘라 어디로로 주입 사이트에 즉시 말초 절단되었다. B. 24 고전력 증폭기에서 형광 및 brightfield 삽입된 페이지 이미지 morpholino가 지느러미으로 이전했음을 보여주 (1)하지만, 복부 재생 (2), 컷 사이트에 즉시 근위만이 세포 아체 형성에 참여한다는 의미가 아닌 재생. 하얀 화살촉의 두 세트는 각 절단의 수준을 보여비행기. 패널은 각각 지느러미 지느러미와 복부 반쪽의 높은 배율의 전경을 보여주 이미지의 맨 오른쪽에 1과 2를 표시했습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">보충 그림 1.</a> 주입 및 제어 morpholino로 electroporated 지느러미에있는 아체의 위치에 해당하는 지역의 공촛점 Z-스택의 비디오. 이미지 24 hpe에서 찍은. 단일 플루오레신 분자를 시각적으로 될 수 있기 때문에 모든 morpholino 중 시각적으로 계량이 될 수 있습니다. 그러나 이러한 이미지는 형광등 morpholino의 전체 전체 세포에 대한 개별적인 작은 반점이있는 점들의 세포에서 시각이 될 수있는 이해의 괴팍한도 몇 가지 아이디어를 제공합니다. 정지 영상에서 오리 엔테이션이 나타납니다. 스케일 바 : 25 마이크론.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기서는 성인 zebrafish의 지느러미 재생 중에 관심 조건부 최저의 단백질에 대한 강력한 손실 함수 접근법을 설명합니다. 이 기술은 재생 지느러미 파생물 16, 20-22시 수용체, 전사 요인과 microRNAs 신호, 갭 접합 유전자를 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는이 기법도 기법을 채택하여 상처 치유와 아체 형성에 필요한 유전자를 연구하는 데 사용될 수 있다고 기대하고 있습니다. 예를 들어, 우리는 주입하고 (그림 7) 이전에 절단까지 지느러미 지느러미 이분의 일에 골질 지느러미 선 사이의 공간에서 컨트롤 morpholino을 electroporated. 그러면 주사 비행기로 즉시 말초 지느러미를 절단. 24 고전력 증폭기, 우리는 중생의 이러한 초기 단계 동안에 세포는 또한 targ 수 나타내는 morpholino 타겟 세포가 상처의 상피와 아체 (그림 8)을 모두 형성 distally 마이 그 레이션 것을 관찰eted. 기술은 몇 가지 중요한 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 플루오레신 태그의 형광은 불가능 세포에 존재 morpholino의 금액으로 특정 세포 표현형 (예 : 세포 증식) 신원을 확인하도록하게 immunohistochemistry을 위해 다음과 같은 고정 및 처리를 유지하지 않습니다. 이전 그룹 지느러미 조직 23로 DNA의 성공적인 electroporation을 신고했지만 이외에도, 우리는 일관되게 재생 꼬리 지느러미에 plasmids의 electroporation을 달성하지 못하고 있어요. 마지막으로, 우리는 morpholino가 ~ 48시간 새로운 세포 유형의 분화에 관련된 유전자를 테스트하기 위해 현재의 형태로이 기술을 사용 금지 포스트 electroporation 21에만 효과가 있다고 지적했습니다. 절차의 추가적인 테스트와 수정이 현재의 한계를 극복 있습니다. 또한,이 기술이 사용될 수있는 가능성이기본 조직에서 아체까지 셀 마이 그 레이션과 관련된 단백질을 테스트합니다. 예를 들어, 주입 및 절단 이전 지느러미의 양쪽합니다 (그림 7에 설명되어)로 제어 morpholino을 electroporated. 그러면 주사 비행기로 즉시 말초 지느러미 지느러미 절반을 절단하고 우리는 훨씬 더 distally 복부 지느러미를 절단. 24 고전력 증폭기에서 지느러미쪽에 morpholino-긍정 세포 주사 사이트에서 overlying 상처의 상피와 아체로 마이 그 레이션했다. 그러나, 복부 측면 (그림 9)에서 사건 아니었어요. 이것은 절단 평면을 기초에만 세포가 재생 반응에 참여한다는 생각을 지원합니다. 이러한 데이터는 또한 세포 마이 그 레이션 요구하는 가상 단백질이이 기술을 사용하여 테스트할 수있는 것이 좋습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT 또는 CUY21-SC 광장 물결 electroporator </td><td> Protech 국제 </td><td> CUY21EDIT 또는 CUY21SC </td><td> 두 단위는이 프로토콜을 위해 일하는 </td></tr><tr><td> 3 밀리미터 직경 패들 전극 </td><td> Protech 국제 </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino은 관심의 단백질에 맞춤 설계되어야 </td></tr><tr><td> 2 - Phenoxyethanol </td><td> 시그마 </td><td> 77861-1L </td><td> 마취; 절차 생선 시스템 물에 묽은 1:1000, 안락사에 대한 1:500 </td></tr><tr><td> 마이크로 injecti펌프에서 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> PV830 공압 PicoPump </td><td> 다양한 microinjection 시스템은 사용할 수 </td></tr><tr><td> 마이크로 조작하는 사람 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> MMJR </td><td> 오른손잡이 (왼손잡이를위한 MMJL) </td></tr><tr><td> 미세 분사 바늘, 직경 외부 1.0 mm </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B100F-4 </td><td> 이들은 주사 바늘로 뽑았 borosilicate 유리 모세관입니다 </td></tr><tr><td> 니들 홀더 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 5430 - ALL </td><td> 피코 노즐 키트, 삽입된 페이지 1.0 mm 피펫 가스켓으로 확인 </td></tr><tr><td> 니들 풀러 </td><td> 셔터 </td><td> P-97 </td><td> 기타 micropipette / 바늘 pullers도 작동합니다 </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> Leica, 니콘, Zeis의 </td><td> 숫자는 제조 업체에 따라 다름 </td><td> 20X 광학을 가진 stereomicroscope과 마이크로 작업할 수있는 능력 </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

urodeles 및 teleost 생선의 일부 종족은 그들의 조직을 재생하실 수 있습니다. Zebrafish는 심장 1, 망막 2, 척수 3, 시신경 4, 감각 세포 5, 지느러미 6 등 성인 조직의 자발적인 재생을 연구하기 위해 널리 사용되는 모델이되었습니다. zebrafish 지느러미는 쉽게 epimorphic 재생에 여러 단계를 공부하기 위해 조작되는 비교적 간단한 부위요입니다. 상처 치유, 아체 형성하고, 지느러미 파생물 : 고전, 지느러미 재생은 세 개의 서로 다른 단계의 특징되었습니다. 지느러미의 일부를 자르기 후, 주변의 상피는 proliferates과 상처를 통해 마이 그 레이션합니다. 33 ° C에서이 프로세스는 6,7 (고전력 증폭기, 그림 1B) 육시간 포스트 절단 내에 발생합니다. 다른 lineages (예 뼈, 피, glia, fibroblast)에서 다음, 기본 전지는 다시 입력해야 세포주기 proliferative 아체, W를 형성overlying의 표피는 (그림 1D) 8 분아 따위에 의해 중식 계속 hile. 아체에 근위 세포가 새로운 세포 (그림 1E) 8을 형성 각각 lineages로 다시 차별화로 가지가 발생합니다. 절단의 수준에 따라 모든 중생은 한달에 일주일 만에 완료됩니다. wnt, hox, fgf, MSX, retinoic 산성, 쉬, 노치, BMP 및 activin - 베타 유전자를 포함한 유전자 가정의 큰 숫자의 표현이 지느러미 재생 9-16의 특정 단계 동안 최대 - 규제입니다. 단백질에 대한 특정 억제제가 13 존재하지 않는 그러나, 재생하는 동안이 유전자와 그 인코딩된 단백질의 역할은 평가하기 어려울되었습니다, 온도에 민감한 돌연변이가 존재하거나 유전자 변형 동물 (중 overexpressing은 야생 형 단백질 또는 지배 - 부정적인 단백질)은 7,12가 생성되었습니다. 우리 developed는 반대로 유전 기법을 빠르고 쉽게 지느러미 재생 중에 어떤 유전자의 기능을 테스트합니다. Morpholino의 oligonucleotides 널리 zebrafish, Xenopus, 여자, 및 마우스 개발 17-19시 특정 단백질의 손실을 공부하는 데 사용됩니다. 블록 사전 mRNA의 접합 또는 mRNA 번역 중으로 보완 RNA 시퀀스로 Morpholinos의 basepair. 우리는 효율적으로 타겟 단백질의 분해가되는 표현까지 재생 zebrafish의 지느러미로 플루오레신 태그가 추가된 안티 센스 morpholinos을 소개하는 방법을 설명합니다. morpholino는 재생 zebrafish 꼬리 지느러미의 각 아체에 마이크로 주입 및 주변 세포에 electroporated있다. 플루오레신는 morpholino을 electroporate하고 지느러미 조직에서 morpholino을 시각화하기 위해 요금을 제공합니다. 이 프로토콜은 재생 지느러미 가지 중 특정 단백질의 역할을 검토하는 조건부 단백질 분해를 허용합니다. Discussio에서N, 우리는이 접근 방식은 상처 치유 또는 아체 형성뿐만 아니라, 아체 형성시 세포 이주의 잠재적인 마커 중에 특정 단백질의 역할을 공부하고 적응하는 방법을 설명합니다.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

in-vivo-electroporation-morpholinos-into-regenerating-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.9K 조회수.  University of Notre Dame. 우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 Electroporation

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Mycobacteria의 Electroporation

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.