이 작품은 재정적으로 화학 디자인 (NRSC-촉매)에 의해 제어 네덜란드 국가 연구 학교 겸용, 촉매에서 연구비에 의해 지원되었다. 박사 HY Steensma과 라이덴 대학에서 박사 GPH 반 Heusden는 S의 재조합 발현과의 지원 인정 cerevisiae의 Nar1.

설치 및 솔루션 1. 준비 <ol><li> 100 mM 트리스, pH가 8.5에서 250 mM의 NaCl을 10 % 글리세롤을 포함하는 완충 용액을 준비합니다. 아르곤으로 플러싱 버퍼의 배기. 혐기성 챔버로 버퍼를 소개합니다. </li><li> 두 부분에서 버퍼를 나눈다. 한 부분 (버퍼)가 1 mM의 DL-디티을 추가하려면 1 밀리미터 L 시스테인 (DTT, M은 154.25 g / 몰 R). 다른 부분 (버퍼 B)는 환원제가 포함되어 있지 않습니다. </li><li> 산화제 및 환원제 솔루션을 준비합니다. 1 ML의 2의 솔루션, 20, 200 mM의 페리 시안화 칼륨을 확인 (FIC, M은 329.26 g / 몰 R) 및 혐기성 버퍼 B.에서 온산 나트륨 (SD, M은 174.11 g / mol 인 R)의 </li><li> 다음과 같이 매개 믹스를 준비합니다 <ol><li> B 버퍼는 아래의 산화 환원 매개 제 및 50 mM의 NaCl을 각각 160 μM 추가 : N, N, N &#39;, N&#39;테트라 메틸 -p- phenylendediamine (TMPD, M은 237.17 g / 몰, R, E &#39;0 0.276 V) 2,6- 디클로로 페놀 인도 페놀(DCIP, M은 290.08 g / 몰, E R, 메틸렌 블루 (M r에 &#39;(0 0.055 V, 페나 ethosulphate 0 0.217 V)를 PES, M은 334.4 g / 몰, E R&#39;) 319.85 g / 몰, E &#39; 0 0.011 V), 레조 루핀 (resorufin) (M 연구 235.17 g / mol이고, E &#39;0 -0.051 V) Indigodisulphonate (M 연구 466.35 g / mol이고, E&#39;0 -0.125 V), 2- 히드 록시 -1,4- naphtaquinone ( R의 M 174.15 g / mol이고, E &#39;0 -0.145 V), 안트라 퀴논 -2- 술폰산 (M 연구 328.28 g / mol이고, E&#39;0 -0.225 V) Phenosafranin (M R 322.8 g / 몰, E &#39;0 -0.252 V), Safranin O (M r에 350.84 g / 몰, E &#39;0 -0.280 V), 중립 빨간색 (M r에 288.8 g / 몰, E&#39;0 -0.340 V), 벤질 비올로 겐 (M R 409.4 g / 몰, E &#39;0 -0.350 V) 및 메틸 비올로 겐 (M은 257.16 g / mol이고, E, R&#39;을 0 -0.440 V). </li><li> 중재자를 보호하기 위해 알루미늄 호일에 병을 감싸빛으로부터의. </li></ol></li><li> 준비 10 ㎎ / ㎖ S. cerevisiae의 연쇄상 구균-태그 Nar1 단백질 버퍼 A. 익스프레스 S.에서 (181 μM, M은 55.2 kDa의 R) E.에서 cerevisiae의 Nar1 대장균은 연쇄상 구균 단백질로서 태깅 pET24A 발현 벡터를 이용. 연쇄상-tactin 크로마토 매체 (IBA)를 사용하여 혐기성 챔버에서 단백질을 정제 및 악타 청정기 (GE 헬스 케어)으로 단백질 정제 시스템을 사용하여 정제. </li><li> 다음 혐기 챔버에서 산화 환원 적정​​ 설치 준비 : <ol><li> Ag / AgCl 기준 전극과 적정 용기에 백금 와이어 전극을 연결한다. V.까지 MV에서 측정 할 수있는 전압계에 두 전극을 연결 </li><li> 작은 교반 막대를 삽입합니다. </li><li> 자석 교반기 위의 적정 용기를 놓습니다. </li><li> 완충액 B, 즉, 72 μM의 최종 단백질 농도를 최대 2 ㎖, 각각 38 μM의 매개체로 혼합 용액 및 단백질 용액으로 적정 용기를 채우기중재자. 주 : 단백질 농도에 의존하고 필요한 매개체가 조정되어야 세 용액의 양 농도. </li><li> 30 분 동안 저어 전압계에 전환합니다. </li></ol></li><li> 10 깨끗한 석영 유리 EPR 튜브를 준비합니다. 혐기성 챔버 내에 도입 관. </li><li> 액체 질소로 작은 (200 ㎖ 년경) 액체 질소 듀어를 입력합니다. </li></ol> 2. 산화 환원 적정​​을 수행 <ol><li> 용액의 전위가 안정 될 때까지 기다립니다. 주 :이 실제로 전위가 분당 1 mV 미만 드리프트 것을 의미한다. </li><li> 전압계에 의해 주어진 잠재력을합니다. </li><li> 200 μL의 첫 번째 샘플을 그리고 EPR 튜브에 주입. </li><li> 고무 마개로 튜브를 캡과 혐기성 챔버에서 튜브를 제거합니다. </li><li> 다음과 같이 액체 질소에 튜브를 고정 :주의! 이것은 그렇지 않으면 관이 끊어집니다, 천천히 수행해야합니다. <ol><li> 먼저 t을 삽입액체 질소에서의 IP 튜브. </li><li> 치찰음의 소리가 될 수있을 때까지 기다립니다. 참고 :이 10 초까지 걸릴 수 있습니다. </li><li> 샘플 파트가 완전히 잠기도록 천천히 튜브의 나머지 부분을 삽입한다. </li></ol></li><li> -0.6 V로 용액의 전위를 낮추기 위해 적정 용기 내의 용액에 2 mM의 SD 용액의 작은 분취 1-2 μl를 추가 참고 : 10 개 이상의 μL 첨가되어야한다면, 20mM의​​ 용액으로 전환. 그것이 특정 전위 값 포이즈 매우 어렵 기 때문에, 전압계에 기록 된 실제 값이 적어 및 적정 곡선을 구성하는 데 사용된다. </li><li> 단계 2.3-2.5의 설명에 따라 샘플을 그린다. </li><li> 전압계에 의해 주어진 실제 가능성을합니다. </li><li> 가능성이 약 50 MV 증가 할 때까지 산화제를 추가합니다. 2 mM의 FIC 용액의 작은 분취 1-2 μl를 첨가하여 시작한다. 이상 10 μL를 추가해야 할 경우, 20mM의​​ 용액으로 전환. </li><li> 호를 참고와트 솔루션의 대부분이 추가되었습니다. 주 : 이것은 적정 기간 동안 시료 희석을 교정 할 필요가있다. </li><li> 단계 2.3-2.5의 설명에 따라 샘플을 그린다. </li><li> 전압계에 의해 주어진 실제 가능성을합니다. </li><li> 반복 덮여있다 -0.6 V 0.2에 V에서 잠재적 인 범위까지 2.9 및 2.12 단계를 모두 10 EPR 튜브 200 μL 각을 채워집니다. 주 : 모든 출금 볼륨이 감소됨에 따라, 전극의 위치는 조정될 필요가 간섭없이 교반 용액과의 양호한 접촉을 가질 수있다. 이 마지막 샘플의 취하하므로 그 시료의 전위가 덜 정확할 수있다 후의 전위를 측정하기 어려울 수도있다. </li><li> EPR 측정이 일어날 때까지 선택적으로, 액체 질소에 냉동 EPR 샘플을 저장합니다. </li></ol> EPR 분광학 및 데이터 분석을 사용하여 3. 측정 적정 샘플 <ol><li> 다른의 기록 EPR 스펙트럼적정 샘플은 다음과 같습니다 : <ol><li> &lt;10-5 막대에 석영 저온 유지 장치를 대피 높은 진공 펌프를 사용합니다. </li><li> EPR 자석의 물 냉각에 전환합니다. EPR 구멍을 통해 건조한 공기의 흐름을 엽니 다. </li><li> 자석 전원과 EPR의 컴퓨터 스위치. </li><li> 주파수 보정 프로그램을 실행합니다. EPR 측정 매개 변수를 설정합니다. 액체 헬륨 듀어에 저온 유지 장치를 연결합니다. 9-16 K.에 캐비티 쿨 </li><li> 공동의 EPR 샘플을 소개합니다. EPR 스펙트럼을 기록합니다. </li></ol></li><li> 다른 EPR 종을 확인하고 신호를 정량화하는 가장 좋은 스펙트럼을 사용합니다. 외부 구리 표준 용액의 스펙트럼 스펙트럼과 비교 더블 통합하여 EPR 정량을 달성 10 mM의 CuSO / 2 M 차아 염소산 나트륨 4 10분의 4 mM의 염산. (8) </li><li> 다음 적정 곡선을 확인 : <ol><li> 파라에 대한 특징 g 값에 EPR 신호 진폭 플롯가능성에 대한 관심의 자기 종. </li><li> 스핀에 EPR 신호 진폭 스케일을 변경 / 분자 규모를 단계 3.2에서 EPR 정량을 사용하여. </li><li> 산화제 또는 환원제의 첨가로 인해 발생한 희석 각 샘플의 신호 진폭을 수정한다. </li><li> Ag / AgCl 기준 전극의 전위에 대한 중간 점 전위를 수정한다. 주 : (포화 된 KCl을 포함) Ag / AgCl 기준 전극은 25 ° C에서의 표준 수소 전극 (SHE) 대 0.194 V의 중간 점 전위를 갖는다. 전압계의 전위는 -0.6 V 년경 읽으면 따라서, SHE을 참조 전위는 -0.4이다 V. </li></ol></li><li> 다음과 같이 네른스트 식에 맞는 신호 : 종은 그 감소 된 상태에서 상자성은 다음과 같습니다 <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> 상자성가 오에있는 종xidized 상태 : <img alt="식 (2)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> 중간 상태에서 상자성하는 종의 경우 : <img alt="식 (3)" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> 이러한 방정식은 하나의 전자가 전송 된 산화 환원 반응에 유효하므로 N = 1. 볼트의 E는 = 가능성 E의 m = 볼트에 중점 가능성 F = 패러데이 상수 = 96,480 C · 몰 -1 R = 기체 상수 = 8.314 J · K -1 · 몰 -1 켈빈 T는 = 온도 </li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. 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J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

13 산화 환원 매개체의 시리즈에서 -0.45 SHE 대 +0.3 V (표 1 및도 3)의 범위로 용액의 산화 환원 평형을 허용한다. 그럼 위의 이러한 잠재력 아래의 모든 매개체 중 하나를 완전히 줄어들거나 완전히 산화 따라서 단백질의 산화 환원 반응의 센터와 더 이상 평형은 발생하지 않을 수 있습니다. 때때로 산화 환원 적정 만 좁은 범위 11 측정 될 수 있도록, 두 개 또는 세 개의 매개로 수?...

그것은이 행성, 광합성, 질소 고정 호흡으로 생명에 가장 기본적인 화학 공정은 유기 및 무기 산화 환원 보조 인자를 포함하는 다양한 범위의 큰 단백질 복합체에 의해 촉매되는 타격이다. 이는 전체 단백질의 약 30 %가 하나 이상의 금속 보조 인자를 포함하는 것으로 추정되었다. 1,2- 식별 및 산화 환원 보조 인자 직접 전기 화학 (예, 단백질 막 볼타) 또는 산화 환원 적정을 사용하여 확립 될 수 특성화. 두 가지 기술은 자연과 적용의 상호 보완 적이다. 전압 전류는 전극 표면과 반응 할 수있는 중간 전위 보조 인자의 전자 이동 반응 속도의 빠른 결정을 제공한다. -3,4- 보통 이것은 사이토 크롬 C 또는 페레 독신과 같은 전자 전달 단백질에 대해 잘 작동한다. 그리고 그것은 때때로 전극 표면에 고정화 된 더 복잡한 단백질 작동합니다. 자세한 지식단백질의 보조 인자의 특성은 전압 전류가 보조 인자 (cofactor)의 신원에 대한 직접적인 정보를 제공하지 않으므로, 사용할 수 있습니다. 산화 환원 적정​​을 실행하는 것이 더 힘든하고 단백질 mg의 양을 필요로한다. 그러나, 이들은 중간 전위와 보조 인자의 신원에 관한 정보를 제공한다. 또한,도 5의 여러 단백질 공동 인자가 모니터링 될 수있는 단일의 적정. 산화 환원 적정​​의 원리는 산화 환원 활성 단백질 또는 효소 또는 화학적으로 산화 환원된다는 것이다. 위해 공동 인자가 사용되는 환원제 또는 산화제 산화 환원 매개체와 반응되었는지 확인합니다. 이러한 산화 환원 매개체는 또한 용액의 전위를 측정 할 수 있도록 전극과 반응. 산화 환원 매개체는 버퍼로서 작용하여 단백질 전극과 보조 인자 사이에 평형. 화학적 원하는 값 전위 poising 후, 샘플은 AW 액상 질소에서 빠르게 동결 흡인되고분광 기술을 추가 분석을 AIT. EPR 분광법은 정량적 상자성 금속 중심 또는 유기 라디칼을 측정하는데 사용될 수있다이 점에서 특히 유용하다. 산화 환원 적정​​은 두 방향으로 수행 할 수 있습니다 낮은에서 높은 또는 높은에서 낮은 중간 잠재력. 선택은 연구중인 보조 인자의 안정성에 따라 달라집니다. 종종 낮은 전위에서 시작하고 잠재력을 증가 단계적하는 산화제를 추가하는 것이 현명하다. 이것은 산화 적정 호출되고 여기에 설명된다. 여기서 우리는 사카로 미세스 세 레비 시아 Nar1로부터 단백질을 함유하는 철 - 황 클러스터의 산화 환원 적정을 나타낸다. 이 단백질은 세포질 철 - 황 클러스터 생합성 기계 (CIA 경로)에, 비계 단백질로, 가능성이 참여하고있다. 6,7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

전자 스핀 공명 (EPR)가 산화 환원 적정​​ 강력한 방법은 보조 인자 단백질의 중간 점 전위를 결정하고, 그 검출 산화 환원 상태에서 보조 자극 분자를 식별하고 정량화 모니터링한다. 기술은 전자 전달 속도에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에, 접근하지만, 연구중인 단백질 공동 인자의 정체 및 산화 환원 상태를 확립 않는 직접 전기 화학 (볼타) 상보 적이다. 기술은 전자 상자성 공명 (EPR)을 포함하는 보조 인자 검출하는 단백질에 넓게 적용 할 수있는 것이다. 전형적인 적정 1-100 μM의 범위의 농도를 갖는 조효소 2 ㎖의 단백질을 필요로한다. 단백질은 일정한 전위로 샘플을 포이즈 위해 화학적 환원제 (온산 나트륨) 또는 산화제 (페리 시안화 칼륨)으로 적정한다. 백금선과 Ag / AgCl 기준 전극은 볼트에 연결되어m은 단백질 용액의 전위를 측정 하였다. 13 개의 다른 레 독스 매개체 세트는 단백질의 산화 환원 보조 인자와 전극 사이에 평형을 위해 사용된다. 샘플이 단백질이 다른 산화 환원 보조 인자에 대한 특성이 서로 다른 전위 전자 상자성 공명 스펙트럼에 그려, 측정된다. 시료 대 전위 신호 세기의 플롯은 보조 인자의 중간 점 전위를 측정하기 위해 네른스트 식을 이용하여 분석한다.

Nar1 : 사카로 미세스 세 레비 시아에서 단백질 Nar1를 포함하는 철 - 황 클러스터의 산화 환원 적정 세 가지 보조 인자의 확인 결과 [3Fe-4S] 클러스터, [4Fe-4S] 클러스터와 단핵 철 센터 (그림 1) . EPR 신호는 자신의 g-값 특징 : 대한 [3Fe-4S] + g Z 2.01 g 크로스 오버 2.00 (그림 1B); 대한 [4Fe-4S] +, G z를 2.02 g y를 1.93, g X 1.82...

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EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정​​을 모니터링<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K 조회수.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

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Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정​​을 모니터링

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정을 모니터링