R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, 및 P51OD011104 : 저자는이 연구의 지원에 대해 다음 NIH 상 / subawards을 인정하고 싶습니다.

사단 이미징 소프트웨어를 사용하여 1. 보정 Mesodissection 악기 사단 이미징 소프트웨어는이 문서의 나머지 부분에 대한 소프트웨어 또는 프로그램 중 하나라고한다. 이 단계는 정확하게 화상을 추적 할뿐만 아니라, 다수의 슬라이드 프레임을 정렬하는 데 필요하다. <ol><li> 악기와 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 오픈 소프트웨어 및 &quot;보정기구&quot;를 선택합니다. </li><li> 조이스틱을 사용하여 스테이지 이동을 보정합니다. 왼쪽 상단 위치로 무대를 이동합니다. 프로그램의 1 단계를 눌러 &quot;설정&quot;. </li><li> 올바른 위치를 낮은 단계로 이동합니다. 프로그램의 2 단계를 눌러 &quot;설정&quot;. </li><li> 먼저 헤드 어셈블리를 높이기 위해 &quot;Z 버튼&quot;을 눌러 포부를 보정합니다. 조이스틱을 눌러 &quot;대기음 펄스&quot;버튼과 &quot;해부&quot;버튼을 플런저 제어봉까지 최고 위치에 도달. 프로그램의 3 단계에서 &quot;SET&quot;키를 누르면,. </li><li> 을 눌러 &quot;대기음 리셋과# 8221; 버튼을 누릅니다. 플런저는 4 단계에서 아래의 위치를​​ 눌러 &quot;설정&quot;에서 정지되면. </li><li> &quot;규모 탭&quot;을 클릭합니다. </li><li> 빈면에 교정 통치자를 놓습니다. </li><li> 필요한 경우 현미경 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 마우스를 사용하여 두 개의 스케일 바 사이에 선을 그립니다. </li><li> 2 단계. 보도 &quot;계산&quot;버튼을 표시 상자에 거리를 입력합니다. </li><li> &quot;십자&quot;탭을 클릭합니다. 1 모터 속도를 켭니다. </li><li> 헤드 어셈블리에 xScisor를 삽입합니다. &quot;z 축&quot;버튼을 누름으로써, Z 축 준비 위치로 니더 헤드 조립체. 참고 : 헤드 어셈블리 베스트 해부 악기의 큰 구조입니다. xScisor이 문서의 나머지 부분에 대한 소비 밀 비트라고한다. </li><li> 조이스틱 버튼을 &quot;해부 참여&quot;를 클릭합니다. 참고 :이 버튼이 조이스틱의 상단에 위치하고 있습니다. </li><li> 시각적으로 회전 중심을 정의합니다. 이렇게하려면 정의하여 회전 중심에 십자선의 중심을 이동프로그램의 1 단계에서 d 매개 변수. 십자선을 정렬하는 픽셀을 조정하기 위해 &quot;X&quot;와 &quot;Y 축&quot;바에서 아래 화살표를 사용합니다. &quot;완료&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;홈&quot;아이콘을 클릭합니다. 참고 :이 작업은 오른쪽 상단 모서리에있는 집 이미지로 표현된다. </li></ol> 2. 참조 이미지 만들기 <ol><li> 무대에서 H &amp; E 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 상단에 불투명 커버를 놓습니다. H &amp; E 슬라이드의 원하는 영역에 조이스틱을 움직여서 기기를 구동한다. 생성 된 이미지를 저장합니다. 참고 : &quot;캡처 참조&quot;탭 또는 &quot;해부&quot;탭 하나가이 단계를 완료하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 해부를 위해 조직을 맞 춥니 다 <ol><li> 홈 화면에서 &quot;조직을 해부&quot;옵션을 클릭합니다. </li><li> &quot;연산자&quot;, &quot;해부 접근 번호&quot;, &quot;참조 기탁 번호&quot;, &quot;xScisor 바코드 번호,&quot;&amp; #을 입력합니다8220; 해부 유체 로트 번호 &quot;,&quot;xScisor 크기 &quot;및&quot;설정 &quot;탭에서&quot;설명 &quot;. </li><li> &quot;조직을 찾아&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> 가져 오기 이전에 참조 이미지를 저장. </li><li> 무대에서 5 미크론 두께의 흠 FFPE 슬라이드를 놓습니다. 참조 화상에 도시 한 것과 같은 영역으로 스테이지를 이동. &quot;이미지 삽입&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;정렬&quot;탭을 클릭합니다. 흠없는 이미지에 대한 참조 이미지를 정렬하는 마우스와 관련된 화살표를 사용합니다. </li></ol> 4. 슬라이드에 주석 달기 <ol><li> &quot;주석&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> microdissected 될 슬라이드의 원하는 영역 주위에 원을 그리려면 마우스를 사용합니다. </li></ol> 5. 소모품 밀 비트로드 <ol><li> 유체 운동에 위아래로 여러 번 플런저를 잡아 당겨,​​ 여기에 원하는 버퍼, PKD 버퍼와 소모품 밀 비트를 입력합니다. 반드시 공기를 제외 할 수 있도록거품. </li><li> &quot;Z-축&quot;버튼을 눌러 Z 축 올립니다. </li><li> 기계로 소비 밀 비트를 넣습니다. 기계의 정상에 소비 밀 비트를 슬라이딩하여이 작업을 수행 할 있도록 소모품 밀 비트에 검은 색 줄까지 기기 라인에 흰색 선. 플런저가 올바른 위치로 낮출 수 있도록 압박 &quot;포부 리셋&quot;버튼을 클릭합니다. 참고 : 소모품 밀 비트를 밀어 쉽게해야합니다. 그렇지 않은 경우, 노치가 제대로 정렬되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 다시 &quot;Z 축&quot;단추를 눌러 니더 Z 축. </li></ol> 6. 조직을 해부하다 (그림 4) <ol><li> &quot;해부&quot;탭을 엽니 다. </li><li> 1 모터와 흡입 속도를 켭니다. </li><li> &quot;쇼 추적&quot;확인란을 선택합니다. 주의 : 이는 사용자가 박리 공정 동안 해부 영역을 시각화 할 수있다. </li><li> 해부 할 준비가 완료되면, 버튼을 &quot;참여&quot;뿐만 아니라 &quot;대기음 &amp; # 계속 보유8221; 버튼 조직을 절개하기 위하여 반 시계 방향으로 조이스틱을 이동시키면서. </li><li> 대기음이 &quot;전체&quot;탭이 빨간색으로 변합니다 때까지 반 시계 방향으로 절개를 계속합니다. </li></ol> 7. 소모품 밀 비트를 비우고 제거 <ol><li> 소모품 밀 비트의 끝에서 0.5 μL의 미세 원심 분리 튜브를 놓습니다. </li><li> 을 눌러 &quot;열망&quot;제어봉 신속의 미세 튜브에 샘플을 꺼냅니다. </li><li> 사용되는 소모품 밀 비트를 배출 증가 힘으로 누르십시오. </li><li> 플런저를 다시 잡아 당겨 조직 조각을 씻어. 소모품 밀 비트에 남아있는 샘플을 표현하기 위해 앞으로 플런저를 밀어 넣습니다. 조직 조각은 지금의 미세 튜브에 포함됩니다. </li></ol> 열 처리하여 테 K 소화 8.를 Lyse 샘플 <ol><li> 조직 샘플을 복구하는 단백질 분해 효소 K의 5 μg을 포함 70 μL의 TE 산도 8.5을 추가합니다. </li><li> 프로그램 히터 통에 샘플을 놓고. </li><li> 다음 설정에서 프로그램 히터 통을 사용하여 완전한 소화 : 1,500 rpm에서 30 분 동안 60 ˚ C; 1,500 rpm에서 15 분 동안 82 ˚ C; 450 rpm에서 1 분간 25 ˚ C. 샘플은 현재 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 개시한다.

Mesodissection 병원균의 광대 한 배열로 인한 병적 병변 슬라이드로부터 RNA 추출에 적용 할 수있는 기법이다. 이것은 사용자가 콘텐츠를 추적하고 정확하게 이미지를 정렬 필요성이다. 이 작업을 수행하기 위해 장비는 이미징 소프트웨어의 지침에 따라 보정해야합니다. 해부 할 때 해부하고 그 슬라이드와 영역이 정렬되지 않는 경우, 사용자는 장비를 다시 교정해야합니다. 해부 과정에서 또 다른 ?...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

샘플은 전통적으로 수동으로 전체 조직이나 바늘과 메스를 사용하여 슬라이드 하나에서 microdissected되었습니다. 이것은 그 조직의 부와 주변 조직의 2 항 사이의 명확한 분리를 필요로한다. 분자 프로파일 기술에서 현재 발전으로, 세포 수준에서 조직을 평가할 필요성이 증가되고있다. 때문에 수동 미세 절제의 제한, LCM 등의 기술이 큰 절연 정밀도 수 있도록하기 위하여 설립되었다. 이 기술은 다음과 같은 연구가 유전자 발현 프로파일 링과 같은 하류 분석법에 사용할 수있는 다양한 세포 및 슬라이드 타입으로부터 특정 세포 집단을 분리 할 수​​있다. 다운 스트림 분석에 매우 효과적이지만, LCM은 제한이없는 것은 아니다. 첫째, LCM은 비용과 시간이 소요되는 과정입니다. 또한, 때문에 RNA의 불안정한 특성으로 종종 LCM 샘플 2에서 고품질의 RNA를 얻기 위해 도전하고있다. 때문에 디에LCM의 sadvantages은, 미세 절제 기술의 새로운 발전은 여전히​​ 저렴하고 시간에 민감한 방법으로 연구자의 큰 숫자에 더 접근 할 수 있도록하기 위해 필요합니다. 사용할 미세 절제 기술의 하나의 발전은 mesodissection로 알려진 기술이다. 이 기술에서 기계 공장 관심 주석 조직 섹션을 사용하고 소모품 밀 비트 3에를 흡입한다. 다음에,이 샘플 포집 관으로 흡인하고 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 시스템의 장점은 훨씬 적은 비용과 시간이 중요한 것이있다. 우리의 경험에서, 시스템 10 분의 폐 육아종 조직 부분의 절개를 할 수 있습니다. 한편, 기존의 LCM 가능성 프로세스를 완료하기 위해 시간을 필요로한다. 시스템은 오퍼레이터에 대한 주석의 비교뿐만 아니라 도구로 사용하는 기준 슬라이드를로드 할 수있다. 또한 보고서는 개요 일을 생성해부 된 슬라이드의 전자 영역입니다. mesodissection하는 두 가지 주요 단점이 있습니다. 복수의 셀을 추출하는데 효과적이지만, 그것은 하나의 세포를 분리하기 위해 도전. 또, 생성 된 화상의 정밀도는 다른 촬상 현미경을 사용하는 경우만큼 명확하지 않다. 결핵 (TB)는 주요 전염병 전세계 인류의 킬러와 Mtb의 감염의 결과입니다. 결핵균 에어로졸에 노출 된 개인의 대부분에서, 감염은 잠재적으로 제한됩니다. 매년 적어도 천만명에서, 활동성 결핵 4가 발생합니다. 잠복 감염시, Mtb의는 육아종로 알려진 병적 인 폐 병변 내에 포함되어 있습니다. 따라서 그것의 mtb 감염의 결과를 육아종 5 수준에서 결정되고 있다고 주장하고있다. 여기에서 우리는 mesodissection는 Mtb의에 의한 육아종을 microdissect하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 사용 된 슬라이드감염된 붉은 털 원숭이에서 FFPE의 폐 조직에서이다. 이 데모의 목적을 위해, 우리는 그 전체 육아종 해부 것이다. 또한 RNA가 회복 조직으로부터 추출 될 수 있다는 것을 보여준다. 이 기술은 다양한 다른 표본으로부터 조직 샘플에인가하고 하류 분석법 다양한 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>MeSectr</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mesodissector</td></tr><tr><td>400 nm xScisors</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Other sizes available</td></tr><tr><td>THOR</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Programmable Heater-Shaker</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE extraction kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq FFPE System&amp;nbsp;</td><td>Nugen</td><td>7150</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas

미세 절제는 십년에 대한 DNA, RNA 및 단백질 수준에서의 조직 검사를 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 오늘 사용되는 가장 일반적인 미세 절제 기법입니다. 이 기술에서, 레이저 focally 탈수 조직 섹션 1 위에 놓 열가소성 막을 용해하는 데 사용됩니다. 조직 절편 복합체이어서 들리고 막으로부터 분리된다. 이 기법은 조직 검사를 위해 성공적으로 사용될 수 있지만, 시간 소모적이고 비싸다. 또한,이 기술을 이용하여 절차의 성공적인 완료 따라서 그 사용을 제한하는, 레이저의 사용을 필요로한다. mesodissection라는 새 더 저렴하고 실용적인 미세 절제 방식은 LCM의 함정에 가능한 솔루션입니다. 이 기술은 밀에 장착 된 슬라이드 조직 샘플에서 원하는 조직을 MESO-1/MeSectr 시스템을 채택에 동시에 원하는 조직 샘플을 복구하는 유체 분배 및 흡인하면서소모품 밀 비트. 해부 과정을 시작하기 전에, 사용자는 (FFPE) 포함 된 포르말린 고정 파라핀 (H &amp; E) 기준 슬라이드 스테인드 헤 마톡 실린 및 에오신으로 밀어 맞 춥니 다. 그 후, 오퍼레이터는 소망 해부 영역에 주석 및 해당 세그먼트를 해부로 진행한다. 이 프로그램은 절개의 아카이브 이미지를 생성합니다. mesodissection의 가장 큰 장점은이 실험에서 세대를 샘플링하기 위해 설정 10 분 거리의 평균을 복용, 슬라이드를 해부하는 데 필요한 짧은 기간입니다. 또한,이 시스템은 훨씬 더 효과적인 비용과 사용자 친화적이다. 약간의 단점은 레이저 캡처 현미경처럼 정확하지 않습니다 것입니다. 이 문서에서 우리는 mesodissection은 결핵균 (Mtb의)에 의해 발생 FFPE의 육아종에서 슬라이드에서 RNA를 추출하는 방법을 보여줍니다.

상기 프로토콜은 FFPE 조직 슬라이드에서 RNA를 추출하는 새로운 mesodissection 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 효능은 다양한 감염 단계에서 Mtb의 감염 NHP에서 폐 육아종의 FFPE 슬라이드를 통해 표시됩니다. 1-3 악기. 그림 4의 이미지 들이고 해부 프로세스가 발생하는 방법을 묘사하고 소프트웨어. 표 1에 의해 생성 된 결과...

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A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

미세 절제가 광범위하게 조직 내에서 DNA, RNA, 단백질의 시험을 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 새로운 밀링 기술 mesodissection는 최근 유효하다. 우리는 mesodissected 포르말린 고정 파라핀 결핵균 육아종의 내장 조직 슬라이드에서 RNA 추출을 보여줍니다.

복구하는 새로운 미세 절제 접근<em&gt; 결핵균</em폐 육아종 임베디드 포르말린 고정 파라핀에서&gt; 특정 성적 증명서

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

8.0K 조회수.  Tulane National Primate Research Center.  미세 절제가 광범위하게 조직 내에서 DNA, RNA, 단백질의 시험을 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 새로운 밀링 기술 mesodissection는 최근 유효하다. 우리는 mesodissected 포르말린 고정 파라핀 결핵균 육아종의 내장 조직 슬라이드에서 RNA 추출을 보여줍니다. 

비디오: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

연구

유전학

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

면역학 및 감염병학

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

의학

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

<meta charset="utf8"></head><body>형광 현미경 분석을 위한 폐의 곰팡이 포자 국소화 보존

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

Transbronchial Lung Cryobiopsy for Diagnosing Interstitial Lung Diseases and Peripheral Pulmonary Lesions - A Stepwise Approach

Transbronchial lung cryobiopsy (TBLC) is an invasive procedure increasingly implemented during the last decade as an alternative to video-assisted thoracic surgery lung biopsy (SLB) for diagnosing interstitial lung diseases (ILDs). The indication for TBLC has primarily been to sub-classify a specific ILD subtype when this cannot be achieved on the basis of a preceding multidisciplinary team discussion. Although SLB is considered the gold standard for establishing a histological diagnosis, TBLC has been gradually suggested as the first-choice histological diagnostic modality in patients with unclassified ILDs due to a comparable diagnostic yield with SLB, but superior to SLB in terms of complications, including mortality. During recent years, radial endobronchial ultrasound (R-EBUS) and electromagnetic navigation bronchoscopy (ENB)-guided TBLC for peripheral pulmonary lesions have also been described as safe procedures, which may improve the diagnostic yield compared to forceps biopsies. Still, the diagnostic properties of TBLC rely on the quality of the procedure&#39;s performance. This article aims to describe the stepwise approach to conducting TBLC with a flexible bronchoscope for the different indications mentioned, which might be helpful for novice bronchoscopists performing TBLC.

<meta charset="utf8"></head><body>간질성 폐 질환 및 말초 폐 병변 진단을 위한 경기관지 폐 냉동 시공 - 단계적 접근법

Transbronchial lung cryobiopsy (TBLC) for diagnosing interstitial lung disease and peripheral pulmonary lesions is a high-yield diagnostic and safe procedure. We describe a stepwise approach to conduct TBLC for the different indications mentioned with a flexible bronchoscope, which might be helpful for novice bronchoscopists performing TBLC.

복구하는 새로운 미세 절제 접근

요약

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면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

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기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

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