저자는이 연구에 임상 자료를 공헌 한 자원 봉사자에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 모든 임상 자료의 수집을위한 보건 임상 의학, 의학 / 호흡기 의학 전공, 대학 병원, 우메 (Norrlands의 universitetssjukhus)의 부서의 직원들에게 감사하다. 이 작품은 스웨덴 연구 협의회, 스웨덴 심장 - 폐 재단, 전략적 연구를위한 스웨덴 재단과 카롤린스카 연구소에서 AS-S에 보조금에 의해 지원되었다.

참고 :이 연구는 우메 아, 스웨덴의 지역 윤리 심의위원회에 의해 승인되었다. 인간의 주제에서 샘플링 기관지 생검 1. 기관 지경 <ol><li> 모든 참가자의 동의를 얻습니다. </li><li> 경구 용 미다 졸람 (4-8 mg) 및 정맥 glycopyrronium (0.2-04 mg을)를 기관지 전에 30 분으로 주제를 취급합니다. 후두와 기관지에 리도카인으로 국소 마취를 적용합니다. 리도카인 4 % ~ 3 ㎖와 제목 양치질을하자 혀베이스와 후두 주사기를 통해 후두에 3 ㎖를 적용합니다. 리도카인 스프레이의 8-10 투여와 국소 마취를 최적화합니다. 제목 앉아이 단계를 수행합니다. </li><li> 앙와위에서 주제와 플라스틱 마우스 피스를 통해 입을 통해 유연한 비디오 기관 지경을 삽입합니다. 기관 지경을 통해 말단 기관 및 기관지의 국소 마취를 완료 할 목적으로 만든 스프레이 카테터를 사용합니다. 여기에, 약의 복용량을 사용리도카인 2 % ~ 10 mL로. </li><li> 6-9 주 카리나에서 기관지 점막 생검과 유창 집게를 사용하여 주 기관지 부문 (그림 1) 가져 가라. 기관지 내시경을 다음과 병원을 떠나기 전에, 2-4 시간 동안 주제 나머지를하자 가벼운 식사와 함께 그를 / 그녀를 제공합니다. </li></ol> 2. 글리콜 메틸 아크릴 레이트 (GMA) 수지의 생검을 포함하기 주 : GMA의 면역 프로토콜은 원래 사우 샘프 턴 대학, 조직 화학 연구 (17)에서 개발되었다. <ol><li> 고정 : 면역 조직 화학 법의 경우, 집게로부터 생검을 제거하고 (얼음 - 냉각 탈수 아세톤 및 프로테아제 저해제 3 ㎖을 함유하는 유리 병에 직접 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (35 밀리그램 / 100 ml의 아세톤)을 넣고 요오도 아세트 아미드 (370 밀리그램 / 100 ml의 아세톤 )). -20 ° C (그림 2)에서 하룻밤 조직을 수정합니다. 참고 : 다음 단계를 PERFO한다적절한 니트릴 장갑 흄 후드에서 rmed. 매립 키트 과민, 자극, 및 / 또는 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수있는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 모든 폐기물은 유해 폐기물로 폐기되어야합니다. </li><li> 탈수 : 억제제와 아세톤을 제거하고 실온에서 15 분 (RT)에 대한 (억제제)없이 신선한 탈수 아세톤으로 교체합니다. 아세톤을 제거하고 15 분 동안 메틸 벤조 에이트로 교체합니다. </li><li> 침투 : 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체의 5 % 메틸 벤조 에이트 용액의 처리 액을 준비한다; 10 ㎖ 바이알 한 충분하다. 메틸 벤조 에이트 용액 오프 플라스틱 파스퇴르 피펫 흡입을 이용하여 처리 액 3ml를 교체. 생검 2 시간 동안 4 ° C에서 초과 처리 솔루션을 품어; 파스퇴르 피펫 용액 매립 포함한 모든 후속 용액 변화에 사용될 수있다. </li><li> 처리 액마다 2 시간 (3X 2 시간 인큐베이션)이므로 생체의 합계 함침 시간을주고처리 액에 psies 적어도 6 시간이다. 생검을 식별하기 위해 삽입 캡슐의 상단에 종이 라벨을 삽입합니다. </li><li> 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체를 10 ml의 75 mg의 벤조일 퍼 옥사이드 매립 용액을 제조 하였다. 중합 반응을 시작하기 위해 매립 용액에 N, N -dimethylaniline 폴리 (에틸렌 옥사이드) 0.25 ㎖ (가속기)를 추가한다. 처리 액을 제거하고 집게를 사용하여 관련 매립 캡슐에 한 생검을 놓는다. </li><li> 천천히 솔루션을 포함로 가기 포함 캡슐을 채우고 뚜껑을 닫습니다. 생검을 방해하고 큰 공기 방울을 생성하지 마십시오. 수지가 완전히 중합 될 때까지 4 ℃에서 캡슐을 품어. </li><li> 실리카겔 약 5g을 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 -20 ° C에 보관 매립 생검. </li></ol> GMA 내장 기관지 생검 3. 단면 <ol><li> 현미경 슬라이드 코팅 : A의 현미경 슬라이드를 씻으정상주기에 식기 세척기. 슬라이드를 덮고 건조 공기로 할 수 있습니다. </li><li> 증류수 10 % 폴리 -L- 리신 (PLL) 용액의 도포 액을 준비한다. 5 분 동안 코팅 용액의 슬라이드 잠수함, 다음 그들에게 자연 건조를 할 수 있습니다. 원래 상자에 건조 PLL 코팅 된 슬라이드를 저장합니다. </li><li> 증류수에 0.1 %의 트윈 20을 시트 유리 스트립을 씻으십시오. 종이 타월로 70 % 에탄올 건조와 유리를 씻어. 칼 메이커를 사용하여 유리 스트립 유리 블레이드를 잘라. 절삭 날이 손상되거나 흠집되지 않도록 이동을 방지 용기에 블레이드를 저장한다. </li><li> 생검 트리밍 : 캡슐 분배기의 생검 캡슐을 놓고 탄소 강철 단일 에지 블레이드를 사용하여 각면을 잘라. GMA 내장 조직 검사를 제거하고 그 단단히 놓습니다. 철강 블레이드를 사용하여 조직 검사 주위에서 초과 GMA을 낸다. </li><li> GMA의 단면. <ol><li> 증류수 0.05 % 암모니아 용액을 준비합니다. 일에서 유리 나이프와 조직 검사를 배치전자 마이크로톰. 조심스럽게 블레이드 블록의 표면에 대해 평평하게 걸쳐 지도록 나이프 홀더 생검 블록의 각도를 조절함으로써 블레이드 생검 블록 정렬. </li><li> 느린 절단 속도에 마이크로톰을 사용하여 2 μm의 두께 부분을 잘라 전송하고 암모니아수에 섹션을 떠 집게를 사용합니다. 부드러운 항원 검색을 허용하고 섹션의 전개, 45-90 초 동안 섹션을 플로트. </li><li> 현미경 슬라이드에 섹션을 선택합니다. 빨리 톨루이딘 블루 염색에 의해 생검 조직 검사를 확인합니다. </li><li> 50 ° C에 핫 플레이트 세트에 슬라이드를 건조 및 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 섹션을 여과 톨루이딘 블루 염색의 500 μl를 적용합니다. 녹색 링이 얼룩의 가장자리에 등장하기 시작할 때까지 뜨거운 접시에 절을 따뜻하게 한 다음 물로 씻어 내십시오. </li><li> 광학 현미경을 사용하여, 생검 조직 검사를 확인합니다. 면역 조직 화학 염색에 사용되는 섹션은 손상되지 않은 얇은 판의 좋은 부분을 포함해야적은 수의 분비 가능한 한 작은 평활근과 고유 층과는 상피. </li><li> 섹션 3.4.2에서와 같이, 좋은 조직학이 부분을 절단 및 면역 조직 화학 염색을위한 PLL 코팅 현미경 슬라이드로를 선택합니다. 분석을 위해 각 조직 검사에서 적어도 두 부분을 잘라. 적어도 1 시간 동안 건조 슬라이드. 건조 후, 절편 주석 호일로 래핑 할 수 있고, 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 보관하거나 즉시 면역 염색 할 수있다. </li></ol></li></ol> GMA 내장 기관지 생검 4. 면역 조직 화학 염색 주 : 아 지드 화 나트륨은 독성이있다. 흄 후드 내의 0.1 % 나트륨 아 지드의 용액을 제조하고 산으로부터 멀리. 산에 접촉하면 유독 가스를 방출합니다. <ol><li> 다이아몬드로 만들어진 펜을 사용하여 섹션을 주위에 그려 염색 선반 위에 슬라이드를 정렬합니다. </li><li> 퍼 옥시 다제 블록을 수행합니다. 0.1 % 아 지드 화 나트륨 용액에 0.3 %의 과산화수소를 퍼 옥시 다제 블록 용액을 제조 하였다. 출원Y 1 부에 퍼 옥시다아제 블록 ㎖를 30 분 동안 배양한다. </li><li> 0.05 M 트리스 완충 식염수 (TBS), 산도 7.6의 세척 용액을 준비합니다. , TBS에서 3 배 5 분 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> DMEM의 1 % BSA 블록 솔루션을 준비합니다. 사전에 큰 볼륨, 나누어지는에서이 작업을 수행하고 필요한 때까지 동결. 슬라이드 드레인 비특이적 결합 된 항체를 차단하는 블록을 30 분 동안 용액 중에서 섹션을 배양한다. 비특이적 결합은 여전히 ​​발생하면, 이차 항체와 같은 종으로부터의 5 % 혈청 블록과 함께 30 분간 배양 단계를 포함한다. </li><li> (:; 따라 CD1a 1로 희석 1,000 : 1,00 1 희석 CD45) 및 슬라이드에 적용하여 원하는 농도로 TBS에서 차 항체 (CD45 또는 따라 CD1a)를 희석. 섹션을 커버 슬립과 RT에서 밤새 품어. </li><li> TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. (TBS에서 원하는 농도 (2)이 경우, 토끼 항 마우스 F (AB &#39;에서 일차 항체 숙주 종에 대해 유도) 1:30 비오틴 차 항체 희석0 희석)과 슬라이드에 적용됩니다. 실온에서 2 시간 동안 품어. </li><li> 사용하기 전에 스트렙 타비 딘 비오틴 - 퍼 옥시 다제 복잡한 적어도 30 분을 준비합니다. 모든 슬라이드를 커버하기에 충분 있는지 확인하십시오. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 슬라이드에 대한 해결책을 적용하고 실온에서 2 시간 동안 품어. </li><li> TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 3- 아미노 9 에틸 카바 졸 (제조업체의 지침에 따라 제조) (AEC) 퍼 옥시 다제 기질 용액을 준비합니다. 슬라이드에 적용하고 20 ~ 30 분 동안 또는 원하는 얼룩 강도가 개발 될 때까지 배양한다. </li><li> 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어. 2 분 동안 여과 마이어의 헤 마톡 솔루션 섹션을 Counterstain과. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드를 배출하고 영구적 인 수성 장착 매체와 섹션을 커버한다. 건조 오븐에서 80 ℃에서 슬라이드를 건조. 슬라이드 냉각 한 다음 DPX로 장착하고 커버 슬립을 배치 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 세인트aining 분석 <ol><li> 컴퓨터에 연결 탑재 된 카메라로 광학 현미경을 사용하여 40X 배율 섹션을 분석합니다. 참고 : 세포 분석을 위해 적극적으로 부드러운 근육, 동맥, 큰 혈관과 일치하지 않는 또는 손상된 조직의 영역을 제외하고, 기관지 점막 고유 그대로 상피 세포 내 핵 세포를 염색 카운트. </li><li> 세포 수를 평균 고유 층의 면적 및 상피의 길이에 대한 평균 세포 수를 수정한다. 고유 판 및 상피의 길이의 영역은, 화상 해석 프로그램을 사용하여 계산 될 수있다. </li></ol> 기관지 생검 6. 효소 소화 <ol><li> 세탁기 생검 : 행크 완충 식염수 용액 (HBSS) (도 3) 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 무균 핀셋 장소 생검 그대로 사용. 30 rpm에서 락을 플랫폼에서 RT에서 5 분 동안 품어. 멸균 D에 조직 검사로 이동HBSS로 15ml의 튜브의 함유량을 경사하여 틱. </li><li> DTT와 점액을 중단 : 5 mM의 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 포함 HBSS 10 ㎖로 튜브의 HBSS를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 15 초 동안 부드럽게 튜브를 소용돌이. HBSS DTT와 함께 15 ml의 튜브의 함유량을 경사 분리하여 멸균 접시 상 생검을 전송. </li><li> 문화 매체에 조직 검사를 전송 : RPMI 1640 배지 10 ㎖로 튜브의 HBSS과 DTT를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 10 분 동안 품어. </li><li> 콜라게나 제와 DNase의와 생검을 소화. <ol><li> 1 M HEPES 용액을 함유하는 예비 가온 RPMI에서 콜라게나 제 II (0.25 ㎎ / ㎖)과의 DNase (0.2 ㎎ / ㎖)의 분해 용액을 제조 하였다. 48 웰 조직 숭배에 500 μL 잘 당 소화 용액 추가URE 판. </li><li> 소화 용액 아니라 당 조직 검사를 놓습니다. 220 rpm에서 37 ° C에서 60 분 동안 진탕 플랫폼에서 접시를 품어. 피펫 30 분의 생검을 재 분산 한 후 아래로, 그리고 60 분 후가 완전히 조직들을 분해한다. </li></ol></li><li> 단일 세포 현탁액을 준비. <ol><li> 함께 수영장 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하여 50 ㎖ 튜브에 우물에서 소화 생검. 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 (인산염 완충 식염수 (PBS)를 함유하는 2 % 소 태아 혈청)으로 웰을 세척하여 잔여 세포를 수집한다. </li><li> 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 세포 여과기에 남아있는 조직을 짠다. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에서 소화 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음 - 냉각 된 FACS 완충액 5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 수동으로 세포의 생존력을 평가하기 혈구 및 트립 판 블루 염색을 이용하여 세포 수를 계산. </li></ol></li></ol><ol><li> FACS 완충액 200㎕를 약 1 × 106 세포의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 죽은 세포 배제에 대한 세포 생존 염료를 추가합니다. </li><li> 의 FcR 차단 시약의 5 ​​μl를 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> , CD16 (0.5 μL), HLA-DR (3 μL)의 CD11c (5 μL), CD123, CD45 (2 μL), 계보 (2 ㎕를 각 CD3, CD20, CD56, CD66abce 및 CD14)에 대한 세포 표면 항체 추가 (5 μL), CD1c (3 μL), 및 CD103 (2 μL), 4 ℃에서 15 분 동안 품어. 항체에 대한 세부 사항은 방법 섹션에서 찾을 수 있지만, 사용 사이토 정확한 흐름에 항체를 적정하고 최적화 할 수 있습니다. 400 X g에서 5 분 동안 PBS로 여분의 항체를 씻으십시오. 사이토의 흐름에 신선한 샘플을 취득 이상 acquisit 이전에 1 % 파라 포름 알데히드의 세포를 고정이온. </li><li> 분석 (18) (그림 4) 세포 계측법 흐름을 사용하여 폐 조직 검사에서 인간의 수지상 세포를 식별합니다. 주 : 분석 소프트웨어 유세포를 사용하여, 면역 세포가 CD45에 게이팅하여 다른 폐 세포로부터 구별된다. 죽은 세포는 LIVE / DEAD 염료에 대한 긍정적 인 세포로 제외 할 수 있습니다. 모든 살아있는 CD45 + 세포 계통 세포 (B 세포, T 세포, NK 세포, 호중구 및 단핵 세포)의 한 채널에서 CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 및 CD16에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 배제 할 수있다. , HLA-DR + 세포가 인간의 모든 DC가의 식별을 허용 할 것을 다음과 같습니다. 이 중 CD11c MDC에 발현하는 CD11c 또는 각각의 부재에 기초하여 올라가고 구별 될 수있다. MDC에 더 CD1c + MDC에 또는 CD141 +로 나눌 수 있습니다. </li></ol>

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+flow+cytometry:+helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data.">Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 논문은 면역 조직 화학 염색을 이용하여 건강한 인간의 폐 조직 상주 수지상의 상세한 공간 및 표현형 특성을 생성하고 기관지 동안 수집 된 기관지 점막 생검에 유동 세포 계측법하는 방법에 대해 설명합니다. 다음 단락에서 프로토콜의 중요한 단계를 자세히 설명합니다. 프로토콜과 중요한 단계 단면 및 면역 : 그것은 그들이 (단계 2.5)를 사용하지 않...

폐는 외부 환경과 연속적인 접촉이 높은 질환을 유발하는 능력 모두에 무해 입자와 미생물에 노출된다. 따라서, 침입 병원균에 대한 강력한 면역 반응을 탑재 면역계에 중요하지만, 질병의 원인이없는 흡입 항원에 대한 내성을 유지하는 것도 중요하다. 강력한 면역 감시를 제공하기 위해 호흡기는 수지상 세포를 포함하여 면역 세포의 네트워크 늘어서있다. 수지상 나이브 T 세포를 활성화 할 수있는 독특한 능력을 가진 전문적인 항원 제시 세포이다. 인간 폐, 상주 수지상 항원 다음 프로세스가 발생하여 T 세포를 1, 2, 3으로 표시 및 활성화에 대한 폐 림프절로 전송. 인간 면역계 DCS는 디스탱으로 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다CT하지만 중복 기능 : CD1c +와 CD141 + 골수성 수지상 세포 (MDC에) 및 CD123 + 형질 DC가 (올라가고) 4, 5. 인간 수지상 가장 상세한 기술은 혈액 유래 연구 동안, 인간의 폐는 T 세포 자극 용량 6, 7, 8, 9 DC 서브 세트 드문 인구 항구 것이 이제 명백하다. 그러나, 누적 데이터는 수지상 세포를 포함하는 면역 세포가 자신의 해부학 적 위치 (10)에 따라 빈도, 표현형 및 기능에 차이가 있음을 보여준다. 따라서, 로컬 면역 관용에 대한 그들의 기여를 이해하기 위해 관련 조직에서 면역 세포를 연구하는 것이 중요하다. 함께 찍은,이 혈액 DC가 더 쉽게 사용 가능하고 접근에도 불구하고, 폐 질환을 해결하면 폐 상주 수지상 세포를 연구 할 필요성을 강조<html> 인간한다. 인간 폐 상주 수지상 조사 제의 연구는 주로 면역 11, 12, 13을 이용하여 조직 절편에서 형태 및 HLA-DR의 CD11c와 같은 하나의 마커의 발현에 의존했다. 대조적으로, 통상적으로 유세포에 의존 더 최근의 연구는 다양한 면역 세포 서브 세트를 연구 분석한다. 그 고유 특정 DC 서브 세트를 식별하는 하나의 세포 표면 마커를 찾는 것은 어렵다 때문에, 연구의 전위 한계는 단지 4 색은 유세포인가하는 수지상 세포와 유사한 표현형 마커와 세포 집단 등의 위험이있다. 예를 들어, 중 CD11c 모든 골수성 수지상 세포와 단핵 세포의 대부분에 표현된다. 한편, 연구 고급 유동 세포 계측법 패널을 적용하여 환자의 수술 적 절제로부터 비 암성 폐 조직은 통상적으로 사용 된외부 참조 &quot;&gt; 10, 14, 15, 16은, 이들 희소 인구 건강한 피험자의 DCS 본 진정 대표 불분명 않는다. 전체적으로 연구 인해 수술 제거 또는 전부를 인간 폐 조직이 부족하다는 사실에 크게 제한된다. 이러한 한계들을 극복하기 위해,이 작품은 공간 분포와 기관지 내시경을 받아야 건강한 지원자에서 얻은 점막 기관지 생검에서 수지상 세포의 표현형 식별에 대한 자세한 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 작은 생검 각에서 수집 될 수 있고,이어서 절편 분석 고급 유세포 분석을위한 분해 효소를 사용하여 면역 조직 화학 또는 임베디드 될 수있다. bronchoscopies 얻은 기관지 생검 형태의 폐 조직을 사용하는 것은 가능 명세서를 수행 할 수있게하는 장점을 부여udy는 건강한 지원자에서, 폐의 개복 수술과는 달리 분명한 이유, 흉부 수술이 필요한 환자에게 제한되어있다. 또한, 건강한 지원자에서 기관지 중 샘플링되는 조직은 폐 질환을 가진 환자의 폐 조직의 영향을받지 않는 영역에 대조적으로, 생리 학적으로 정상인. 한편, 생검 작은 여러 생검 풀링에도 검색된 셀의 수는 수행 될 수있는 분석의 유형을 제한한다. 본 연구는 수지상 세포에 초점을 맞추고 있지만, 직접 확장 할 수 있습니다 설명하는 방법은 인간의 점막 폐 조직에있는 관심의 다른 (면역) 세포를 포함합니다. 또한, 프로토콜은 기관지 같은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 유육종증, 폐 암으로 진단을 확립의 일부 폐 질환을 앓고있는 환자로부터 얻은 샘플에 직접 적용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1260">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bronchoscopy</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:628px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bronchoscope BF1T160</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">BF1T160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light source&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">Exera CV-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fenestrated forceps</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">FB21C</td>
			<td>Used to take biopsies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bite Block</td>
			<td style="width:172px;">Conmed</td>
			<td style="width:148px;">1429</td>
			<td>20x27mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose 25%&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>500mL intravenous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Can be used for extra relaxation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine, 40mg/mL</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Mouth and throat administration / Gargled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine 100mg/ml spray</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Administered to back of throat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine 20mg/ml spray</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Administered via bronchoscope to airways</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA processing and embedding</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass vials</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">32201-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Molecular sieves, 4A</td>
			<td style="width:172px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:148px;">88120</td>
			<td>3-4mm diameter pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">P-7626</td>
			<td>0.035g/100ml acetone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">I-6125</td>
			<td>0.37g/100ml acetone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polythene-flat&#160; TAAB embedding capsules</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C094</td>
			<td>x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Capsule holder</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C054</td>
			<td style="width:628px;">Holds 25 8mm capsules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">JB-4 GMA embedding kit</td>
			<td style="width:172px;">Polysciences</td>
			<td style="width:148px;">00226</td>
			<td>Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methyl benzoate</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">27614-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Silica gel with humidity indicator</td>
			<td style="width:172px;">Scharlau</td>
			<td style="width:148px;">GE0043</td>
			<td>2.5-6mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:172px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:148px;">10143562CEF</td>
			<td>Cut edges, frosted end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Poly-L-Lysine solution</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">P8920-500mL</td>
			<td>1:10 for working solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheet glass strips for ultramicrotomy</td>
			<td>Alkar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Wash solution (0.1% Tween20)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LKB 7800B Knifemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Capsule splitter</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Carbon steel single edge blades</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">B054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vice</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ammonia, 25%</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">1133.1000</td>
			<td>2mL in 1L, 1:500 (0.05%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microtome</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica RM 2165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light source</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica CLS 150 XE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microscope with swing arm stand</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica MZ6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Diamond tipped pen</td>
			<td style="width:172px;">Histolab</td>
			<td style="width:148px;">5218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td style="width:172px;">AnalaR Normapur</td>
			<td style="width:148px;">23619.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-2</td>
			<td>Probumin BSA diagnostic grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304002</td>
			<td>Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human CD1a antibody</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA80GA</td>
			<td>Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse monoclonal IgG1 isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse monoclonal IgG2a isotype control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X094301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectastain ABC Elite standard kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite</td>
			<td style="width:172px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:148px;">SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mayers haematoxylin</td>
			<td style="width:172px;">HistoLab</td>
			<td style="width:148px;">01820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Permanent Aqueous Mounting Medium</td>
			<td style="width:172px;">AbD Serotech</td>
			<td style="width:148px;">BUF058C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Drying oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DPX permanent mounting solution&#160;</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">360292F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica DMLB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microscope camera</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica DFC 320</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Analysis software</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica Qwin V3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Enzymatic digestion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>55021C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DNase</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Forceps</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Platform rocker</td>
			<td style="width:172px;">Grant instruments</td>
			<td>PMR-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:172px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:172px;">Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Flow cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>555485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>557757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD20</td>
			<td>BD</td>
			<td>335829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD56</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD66abce</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-101-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HLA-DR</td>
			<td>BD</td>
			<td>555813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD14</td>
			<td>BD</td>
			<td>557831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>560369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD1c</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-098-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD141</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LSR II Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Software for analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human lung dendritic cells: spatial distribution and phenotypic identification in endobronchial biopsies using immunohistochemistry and flow cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

DC를 비롯한 인간 호흡기 조직 상주 면역 세포를 특성화 연구는 주로 수술로 인해 제거되거나 전체 인간 폐 조직이 부족하다는 사실을 한정한다. 여기서, 면역 세포 계측법을 사용하여 조직의 면역 세포를 분석하거나, 유동 건강한 지원자 및 개발 프로토콜 기관지 생검 (EBB)로부터 폐 조직을 얻는 덜 침습적 방법이 설명된다. ?...

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Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

The main advantage of this technique is that a lot of information can be generated from small tissues obtained during bronchoscopy.This method can help answer key questions in mucosal immunology, where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as COPD, sarcoidosis, or lung cancer.Visual demonstration of this procedure will enable individuals new to this method to recognize when enzymatic digestion is complete.Demonstrating this procedure, along with Faezzah Baharom, will be Greg Rankin, a postdoc from our collaborator's lab at Ume

human-lung-dendritic-cells-spatial-distribution-phenotypic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K 조회수.  Karolinska Institutet. The main advantage of this technique is that a lot of information can be generated from small tissues obtained during bronchoscopy.This method can help answer key questions in mucosal immunology, where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as COPD, sarcoidosis, or lung cancer.Visual demonstration of this procedure will enable individuals new to this method to recognize when enzymatic digestion is complete.Demonstrating this procedure, along with Faezzah Baharom, will be Gre...

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...