이 연구로는 인디애나 대학 학교의 의학 연구 향상 그랜트와 NIH NIAID 1R03AI122127-01에 의해 부분에서 지원 되었다. N.A.는 Immunologists의 미국 협회에서 경력 면역학 친교에 의해이 기간 동안 부분적으로 지원 되었다.

모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 주립 대학, 인디애나 대학의과 대학의 호스트 캠퍼스 승인 했다-테 르 오 트.
1. A. fumigatus Conidia 감염에 대 한 준비
<ol><li>환기가 증기 두건에서 작업 하는 동안 900 µ L 셀 문화 학년 물 (CCGW) A. fumigatus 293 재고 솔루션의 125 µ L를 추가 합니다. 다음에 맥 아 피 펫을 통해 추출 천 (MEA) 배지 inoculating 루프와 균등 하 게 확산을 솔루션 전송.</li>
	<li>적어도 14 일 동안과 더 이상 28 일 24 ° C에서 어둠 속에서 곰 팡이 접시를 저장.</li>
	<li>유리 비즈를 사용 하 여 앞에서 설명한9conidia 수확.</li>
	<li>접시에 유리 구슬 0.5 m m의 1.5 g를 부 어 부드럽게 그것을 기울이기 앞뒤로 구슬 conidia를 추출 하기 위해 코팅은. 15 mL 원뿔 튜브에 구슬/conidia 혼합물을 수집 합니다. Dulbecco 5 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 소용돌이에 일시 중단 합니다.</li>
	<li>Conidia는 hemocytometer를 사용 하 여 하는 DPBS에 상쾌한의 50 배 희석에서을 계산 합니다. 그림 1 에 표시 된 지역에서 conidia의 수를 계산 하 고 방정식 1 를 사용 하 여 농도 계산 하. #Conidia × 희석 요인 10 ×4= Conidia/mL (식 1) 참고: 추가 4 x 4 사각형 모서리가 영역 수 계산, 방정식 1에 #Conidia로 사용 하는이 분야의 의미와.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig1.jpg"> 그림 1: Hemocytometer 대표 지역 conidia 계산에 사용 (상자, 화살표).
<ol start="6"><li>당 무 균 식 염 수 (DPBS) 원하는 농도, 5 x 106 conidia/50 µ L. 준비 50 µ L conidia 솔루션의 감염에 대 한 108 conidia/mL x 1.0를 가진 conidia 현 탁 액을 희석 ' n + 2' 계정 pipetting에 감염 되는 쥐 오류가 발생 했습니다. 참고: 표준 균 수확 및 준비/여과 또는 사용된10수 있습니다. 유리 구슬 메서드는 가장 사용 conidia 샘플 최소한의 작은/녹는 hyphal 항을 열망에 대 한 가져온.</li>
</ol>2. 면역 억제 및 감염 Murine 모델의
<ol><li>7-10-주-오래 된 마우스를 사용 합니다. 참고: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA, BALB/c 배경), 그리고 γ T 세포 결핍 (TCRδ-/-, B6 배경) 쥐가이 연구를 위해 사용 되었다. 각 실험, 나이 및 성별 일치 (남성과 여성 모두) 마우스 각 그룹에 대해 사용 되었다.</li>
	<li>호 중구 통해 복 (IP) 주입 측면 하단 오른쪽 사분면에 45 °에 메 마른 염 분에 0.1 mL (0.5 mg) 안티-mouse-Ly-6 G 항 체의 고갈 (실험 일정 그림 2참조).</li>
	<li>24 시간 후, 106A. fumigatus conidia 50에 x 5.0 포부 쥐 감염 µ L 살 균 염 분 앞11에서 설명한 (단계 2.4-2.10 참조). 동물의 하위 집합 등이 연구에 사용 하는 DPBS에 5 mg/kg caspofungin diacetate antifungal 에이전트와 함께 주사 감염, 다음 (매일, 그림 2참조).</li>
	<li>99.9 %isoflurane 수의학 마 취 기계를 사용 하 여 함께 마우스를 anesthetize.<ol>
<li>대변과 소변을 잡으려고 유도 챔버의 바닥에 종이 타월을 놓습니다.</li>
		<li>마우스에 유도 챔버, 뚜껑, 보안 고 2 분 및 30에 대 한 5 %isoflurane는 기화 기를 설정 s. 참고: 수 의사 연 고 마 취 총 시간은 5 분 미만 이기 때문에 사용 되지 않습니다.</li>
		<li>30에 대 한 최대 설정의 절반은 기화를 줄일 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>확인 호흡, 운동의 부족 및 발가락 꼬집어 자극에 응답의 부족 둔화 마우스 제대로 관찰 하 여 마 취.</li>
	<li>유도 약 실 및 경사 보드에 장소에서 마우스를 제거 합니다. 보드에 대 한 그것의 뒤를 가진 마우스를 놓습니다. 그것의 위 앞 니는 고무 밴드와 부드럽게 절제 된 더 낮은 앞 니 부드럽게 금속 와이어와 절제 된 확인 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 작은 집게와 혀의 기지에서 conidia/PBS 서 스 펜 션의 피 펫 50 µ L 전체 확장에서 혀를 개최.</li>
	<li>전체 확장; 혀를 잡으십시오 빠른 호흡과 열망의 독특한 클릭 소음을 들어봅니다. 20 동안 s 또는 서 스 펜 션은 완벽 하 게 발음 하는 때까지.</li>
	<li>경사 보드에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 관찰에 대 한 감 금 소에 배치.</li>
	<li>포부, 다음 마우스 야 회복 1 분 모니터 내 의식 마우스까지 완벽 하 게 의식 하 고 감 금 소의 주위에 걸을 수 있습니다. 동물 21 ° C에서 지 내게 하 고 폐는가 걷이 될 때까지 두 번 매일 모니터링 해야 합니다.</li>
	<li>호 중구 (단계 2.2) 24 h 후 감염 (그림 2)의 소모를 반복 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig2.jpg"> 그림 2: 실험 일정. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다.
3. 수확 및 조직학 분석을 위한 마우스 폐의 보존
<ol><li>깊이 anesthetize 390 mg/ml pentobarbital 나트륨 솔루션 IP의 0.1 ml의 치명적인 복용량을 가진 동물.</li>
	<li>핀셋으로 자발적인 호흡의 부족 및 사지 자극 반응의 부재를 관찰 하 여 안락사를 확인 합니다. 안락사, 일단 70% 에탄올 소독과 시체를 스프레이.</li>
	<li>흡수 성 패드로 덮여 폼 보드에 시체를 놓습니다. 참고: 시체 두어야 한다 그것의 뒤에 폼 보드에 모든 4 개의 사지를 고정 하는 핀.</li>
	<li>주의와 위를 사용 하 여 상단의 가슴 구멍을 엽니다. 폐 및 심 혼을 노출 하려면 흉 곽을 떨어져 잘라. 관류 수 있도록 열 등 한 베 나 정 맥을 잘라. 혈관을 절단 하 고 장기를 puncturing 하지 마십시오.</li>
	<li>천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 5 mL와 함께 perfuse. 10% 포 르 말린의 5 mL와 관류를 반복 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 기도 하 고 주변 지방 패드를 분리. 주의 사용 하 고 기도 puncturing 피하십시오. 초과 결합 조직 완전히 진행 하기 전에 기도 시각화 하기 위해 제거를 확인 합니다. 일단 기도 노출 장소 그것을 상승 기도 아래 집게.</li>
	<li>25 G 바늘을 사용 하 여 위쪽 기도에 작은 구멍 고추. 참고: 구멍 해야 될 배치 전체 정 기도에 맞는. 주의 사용 하 여 기관지 파열 방지.</li>
	<li>정 및 폐 쪽으로 구멍을 통해 삽입 합니다. 기관지 주위에 느슨하게 묶인 수술 실로 정을 보안 합니다. 참고: 기관지 파열 하는 경우는 정 가능한 기도에서 기도 과거 삽입할 수 있습니다.</li>
	<li>주사기를 사용 하는 정 맥을 통해 10% 포 르 말린 버퍼의 1 mL와 함께 폐 부 풀 려. 폐의 인플레이션 볼 수 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 카 테 터를 조정 하 고 반복. 폐가 팽창 되 면 신속 하 게 주의 정 맥을 제거 하 고 안전 하 게 봉쇄 기도 스레드 조입니다. 참고: 기관지 파열 폐 팽창 될 수 없는 경우에, 폐 수확 여전히 수 있습니다 하지만이 적절 한 고정 되지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 기관지 및 폐에서에서 제거 가슴 신중 하 게 스레드를 잡아 당겨 부드럽게 하는 동안 집게와 기도의 결합 조직을 뽑아야 합니다. 10% 포 르 말린 버퍼의 15 mL 50 mL 원뿔 튜브에 폐와 기관지를 놓습니다. 스레드 튜브 외부의 한쪽 끝을 배치 하 고 뚜껑을 봉인. 완전히 정착 액에 샘플 잠수함 튜브 반전.</li>
	<li>적어도 24 시간 또는 추가 처리 때까지 실 온에서 샘플을 저장 합니다. 주의: 포 르 말린은 유해. 고글, 얼굴 마스크 등 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 샘플을 처리할 때 화학 후드 작동 합니다.</li>
</ol>4. 수확 및 DNA 곰 팡이 부담에 대 한 마우스의 폐의 보존
<ol><li>별도 마우스에 위에서 설명한 단계 3.1-3.5를 수행 합니다.</li>
	<li>천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 10 mL와 함께 perfuse.</li>
	<li>가 위 폐를 소비 세와 레이블이 1.5 mL 튜브에.</li>
	<li>추가 처리까지-80 ° C에서 폐를 저장 합니다.</li>
	<li>(포함 및 단면)에 설명 된 대로, 제조업체의 프로토콜 ( 재료의 표참조)에 따라 표준 기법을 사용 합니다.</li>
</ol>5. 현미경 및 이미징
<ol><li>이미징 정량화 프로그램 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>가벼운 현미경을 사용 하 여, 슬라이드 (10 X 목표) 스테인드 GMS의 4 가지 분야를 얻을. 이미지 비슷한 조직 밀도와 폐 내의 감염 된 항공의 대표 인지 확인 합니다. 참고: 밀도 및 hyphal foci의 유통 제어 및 실험 그룹 사이 현저 하 게 다른 경우, 추가 필드 촬영 될 수 있습니다, 또는 전체 폐 섹션의 GMS 지역 몇 군데 있습니다 (4 X 목표). 원하는 경우 hematoxylin와 오신, 스테인드 직렬 폐 섹션에 (동등한 조직 형태 식별) 폐의 같은 영역에의 이미지를 얻을.</li>
	<li>필요한 경우 이미지에 눈금 막대를 추가 하 고 측정할 수에 이미지를 저장. 선택, 편집 > 추가/편집 교정 표시 > 메뉴: 선 두께, 색상 및 스케일 바 크기 선택 > 눈금 막대 배치 하는 대 한 이미지를 클릭 하십시오. 메뉴를 닫고 선택, 편집 > 병합 > 교정 표시 병합 > 파일 이름으로 저장 선택 > 파일의 이름을 지정 하 고 클릭 저장.</li>
</ol>6. 곰 팡이 부담 (그림 3)를 계산 하는 이미지 처리 프로그램을 사용 하
<ol><li>이미지 처리 프로그램을 엽니다. 파일을 선택 > 계량 샘플 폴더 > 이미지 (그림 3A). 이미지 선택 > 형식 > 변환 "RGB 스택" (그림 3B).</li>
	<li>3 주어진된 이미지 (그림 3B)의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. "컨트롤 + 교체 + T"를 명 중을 "임계값" 메뉴 설정 조절기 (그림 3C). 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 이미지 보기 프로그램 (그림 3C)와 열.</li>
	<li>왼쪽에 있는 모든 방법을 위쪽 슬라이더를 당겨와 (red)에 선택 영역 (일반적으로 이르기까지 130-160에서 슬라이더 (그림 3C)의 오른쪽에 표시 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정.</li>
	<li>일단 선택, 눌러 "설정" > "확인" (그림 3D). "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인" (그림 3D).</li>
	<li>공백 또는 배경 얼룩의 중요 한 영역 선택 영역이 나 다각형 도구로 적절 한 조직에 의해 제외 될 수 있습니다.</li>
	<li>마지막으로, "분석"을 선택 > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 탭 표시, "결과" 표시 됩니다) (그림 3E). 그래프를 위한 데이터 분석 프로그램을 데이터를 전송 및 통계 분석.</li>
	<li>각 폐 샘플에 대 한 4 개의 영역 비율의 평균을 입력 합니다. 5-8 샘플 그룹 간의 중요 한 차이 검출 하기 위하여 일반적으로 충분 하다. 두 실험 그룹을 비교 하는 경우 수행 하는 짝이 없는 학생의 t-의미를 확인 하려면 테스트.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig3.jpg"> 그림 3: GMS 조직학의 각 단계에 대 한 대표 스크린샷 필드 정량화. (A) 파일 선택 > 계량 샘플 폴더 > 선택 이미지. (B)을 선택 이미지 > 형식 > "RGB 스택" 변환. 3 주어진된 이미지의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. (C) 히트 "컨트롤 + 교체 + T" "임계값" 메뉴 설정 조절기를가지고. 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 사진 뷰어 프로그램으로 열기. 모든 방법은 왼쪽과 (red)에 선택 영역 (일반적으로에서 이르기까지 130-160으로 슬라이더의 오른쪽에 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정 가기 슬라이더를 당겨. (D) 선택 된 언론 "설정" > "확인". "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인". (E) "마지막으로 선택 분석" > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 있는 탭 "결과" 레이블이 표시 됩니다). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
7. DNA 곰 팡이 부담
<ol><li>-80 ° C에서 폐를 제거 하 고 적어도 4 h lyophilize (하룻밤 최적입니다) 또는 동결 건조 시스템에 의해 완전히 건조 될 때까지.</li>
	<li>폐를 건조 하는 동안 DNA 추출 버퍼 (0.1 m M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0 및 0.5 %SDS)를 준비.</li>
	<li>미리 따뜻하게 60 ° C 물 욕조에 준비 된 DNA 추출 버퍼를 놓습니다. 또한, 페 놀 장소: 클로 프롬: isoamyl 알콜 50 mL 원뿔 튜브에서 (25:24:1) 분리에 대 한 허용.</li>
	<li>유리 구슬의 0.2 mL 2 mL 스크류 캡 튜브에 동결 건조 된 폐를 놓습니다. 그것은 정밀한 분말을 형성 될 때까지 15-30에 대 한 건조 폐 조직 갈기 구슬 때리는 사용 하 여.</li>
	<li>각 튜브와 소용돌이를 0.8 mL 따뜻한 DNA 추출 버퍼를 잘 추가 합니다. 추가 15 분 동안 잠복기 전에 각 튜브 65 ° C 비드 목욕 그리고 소용돌이에서 15 분을 품 어. 잠복기, 후 소용돌이 그리고 원심 분리기 튜브 25000 x g 10 분에 합니다.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 1.5 mL 튜브의 3 세트를 분류 하 고 튜브의 1 세트에는 상쾌한의 상위 계층을 전송. 수성 상위 레이어 밖으로 pipetting 동안 주의 사용 하 여 중간 계층을 방해 하지 않도록.</li>
	<li>페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘 혼합. 다음 상위 레이어 밖으로 튜브의 두 번째 세트에 pipetting 전에 15 분에 대 한 25000 x g에서 원심.</li>
	<li>클로 프롬: isoamyl 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘, 튜브의 3 세트에 10 분 신중 하 게 상위 레이어 밖으로 피 펫에 대 한 25000 x g에서 원심.</li>
	<li>추가 500 µ L 소 프로 파 놀의 50 µ L NaoAc (pH 5.2), 잘, 그리고 샘플 10 분 동안 실내 온도에 알을 품을 수 있도록. 다음 30 분 동안 25000 x g에서 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>25000 x g. Decant 에탄올에서 얼음 찬 70% 에탄올과 5 분 원심 분리기의 750 µ L로 DNA 펠 릿을 세척 하 고 40 분 동안 증기 두건에 튜브에 공기를 펠 릿 건조 허용.</li>
	<li>건조 알 약 테 버퍼의 300 µ L에서 resuspend. 참고: DNA 정량까지-20 ° C에서 저장 수 있습니다.</li>
	<li>DNA는 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량 및 정량 분석에 대 한 각 DNA 샘플의 µ 0.2 µ g/L의 100 µ L를 준비.</li>
	<li>3 중 1 µ g의 DNA 샘플, 곰 팡이 18S rDNA 입문서와 함께 앞에서 설명한 표준 정량 수행 하 고 수정 된 프로브 끄는 프로브 세트 (5'-/ 56-팸/AGC CAG CGG/선/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')12,13.</li>
	<li>A. fumigatus genomic DNA에서 표준 곡선을 준비 하 고 각 페이지에 곰 팡이 DNA의 농도 계산 평균 기자를 사용 하 여 샘플 염색 Ct 값.</li>
	<li>플롯은 pg / µ g 균 DNA의 뜻의 표준 오류와 함께. 수행 하는 학생의 t-테스트 의미를 결정 하는 분석. 참고:으로 덜 독성 대안을 여기서 페 놀-클로 프롬 DNA 추출, 열 기반 DNA 추출 키트를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+and+the+role+of+mucins+in+cystic+fibrosis.">Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis.</a> Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).</li><li>Taylor, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+fungal+organisms+in+eosinophilic+mucin+using+a+fluorescein-labeled+chitin-specific+binding+protein.">Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 문서의 목적은 이미지 분석 및 정량화에 대 한 GMS 스테인드 폐 조직학 단면도 이용 하 여 IA와 쥐에 폐 버섯 모양 부담의 결심을 위한 방법을 소개 했다. 이 연구, 치료에에서 β-글 루 칸-합성-대상으로 항진균 약물 caspofungin14 개선 하지 않은 생존 또는 IA8neutropenic 야생-타입 마우스에 곰 팡이 부담. 그러나, 호 산 구는 γ T 세포의 부재, 생존 및 곰 팡이 부담 개선. 우리의 연구 결과 또한 널리 이용 균 DNA 정량 방법6에 비해 GMS 곰 팡이 부담 하 여 비교 결과 얻을 수 있습니다 설명 했다.
GMS 곰 팡이 부담 정량화를 활용 하 여 여러 가지 혜택을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 프로세스 따라서 잠재적으로 상당한 차이 확인 하는 데 필요한 실험의 수를 줄이고 기존 조직학 샘플 활용 수 있습니다. 둘째, 본이 연구에서는 적은 동물 GMS 곰 팡이 부담 정량화 (그림 6, 그림 7) 곰 팡이 DNA의 정량에 비해 상당한 차이 달성 하기 위해 필요 했다. 셋째, 정량 하 여 다른 격리에 곰 팡이 부담 비교 ribosomal DNA 복사 번호15에 격리 종속 차이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 반면, GMS 정량화는 영향을 받지 복사본 수로 곰 팡이 부담 폐 곰 팡이 성장의 상대적 수준에 의해 결정 됩니다. 따라서, 곰 팡이 부담에 대 한 GMS 정량화를 사용 하 여 척 추가 있는 동물의 사용 줄이고 rDNA 복사 번호의 사전 결정을 필요 하지 않습니다. 마지막으로, 곰 팡이 형태를 수정 하는 것 외에도 caspofungin 치료 곰 팡이 조각화, 증가 하 고 따라서 인위적으로 증가 시킬 수 있습니다 폐 homogenates12,16에서에서 콜로 니 형성 단위의 절연 측정 때 곰 팡이 부담 ,17. 따라서, 곰 팡이 부담 GMS 정량화 다른 일반적으로 사용 되는 방법으로 몇 가지 제한 내재를 방지합니다.
그러나, GMS 정량화 그리고/또한이 연구의 한계는 중요 한 것. 첫째, 저자 각 실험 그룹의 폐에 걸쳐 hyphal 성장의 유사한 분포를 가정 하 고 따라서 4 대표 10에서에서 정량화 객관적인 필드 x으로 사용 대표적인 측정 전체 폐에 곰 팡이 부담에 대 한 (그림 6B)입니다. 그 어떤 경우에 상대 분포, 크기 및 밀도 hyphal foci의 충분히 다 곰 팡이 부담 정량 메서드에서이 메서드 및 해당 다른 표시는 가능 하다. 그러나, 우리의 추가 결과 4 X 객관적인 필드를 사용 하 여 전체 폐 섹션 정량화를 비슷한, 그룹 (그림 6 c) 간의 통계적으로 유의 한 차이 이기는 하지만 덜 보였다. 이 부 량의 표준 오차는이 전략, 목표 및 차선 분야에서 증가 배경 4 감소 hyphal 해상도 때문에 가능성이 증가 되었다. 따라서, 더 높은 확대에 적은 분야의 대표적인 부 량이 좋습니다. 둘째, 단일, 중앙 섹션은 각 샘플에 사용 됩니다. 그것은 가능한, 곰 팡이 분리에 따라 또는 쥐 종자 사용, 일부 연구 hyphal 성장의 고르지 못한 배급에 발생할 수 있습니다. 그 경우에 각 파라핀 블록에 걸쳐 추가 섹션 더 대표 부담을 정량 한다. 셋째, 실험에는 상당한 생산 (즉, 측정 알레르기 bronchopulmonary aspergillosis (ABPA)18 또는 낭 성 섬유 증 (CF)18에 곰 팡이 성장 기도), mucins의와 GMS 반응성 유도 다 당 류-풍부한 mucins19 일반적인 GMS + 결과 하 고 따라서 높은 균 부담에 찬성 하 여 몇 가지 샘플을 기울일 수 있습니다. IA의 neutropenic 모델을만이 연구에 사용 되었다, 다른 면역 능력 또는 진압 모델의 사용 덜 비교 결과에 결과 수 가능 하다. 이러한 경고에도 불구 하 고 GMS 정량화 곰 팡이 부담을 결정 하는 유사한 기술 하며 추가 연구에 지속적인된 사용 유틸리티 일관성, 신뢰성, 그리고 비용 효과적으로이 방법의 유효성을 검사 추가 수 있습니다.

IA 면역 진압 치료 또는 만성 감염1,2선 천 적 또는 후 천 적인 면역 결핍과 취약 개인에 개발할 수 있는 기회 감염 이다. 1 차 감염 자주 폐, 간, 신장, 심장, Aspergillus fumigatus 의 일부 인스턴스 배포에서 발생 하 고 뇌를 심각한 질병 그리고 높은 함께 균의 광범위 한 조직 내 습의 결과로 발생할 수 있습니다. 사망률1,2의 속도. 또한, 기존 pharmacotherapies의 효능 제한, 그리고 환경3항진균-저항 하는 긴장의 출현에 의해 더 약화 될 수 있습니다. 그것은 그러므로 침략 버섯 모양 질병의 악화 또는 개발을 촉진 하는 곰 팡이 독성 및 병 리의 메커니즘을 이해 하는 것이 중요입니다.
그들은 곰 팡이 독성 유전자의 역할을 평가 하 고 설립과 A. fumigatus vivo에서4,5의 성장에 대 한 면역 이펙터를 호스트 하는 연구자 수 murine 모델 기계적 아이오와 연구에 대 한 중요 한 유지. 따라서, 여러 전략 효과적으로 계량 하거나 비교 실험 동물6,7의 그룹에 게 선 부담 고안 되었습니다. 이러한 전략 문화 기반, 생화학, immunoassay, 또는 정량 방법, 각각 고유한 장점과 단점을 포함 한다. 또한, 이러한 메서드의 각 면역 effector 기능, 유전자 표정 분석 및 비교 histopathology7의 평가 대 한 희생 뿐 아니라 동물의 부분 집합의 헌신을 포함. 따라서, 포괄적인 IA 연구는 종종 상당한 비용 연구 동물의 많은 수를 필요로합니다. 동물의 조직 여러 분석을 이용 하 여 실험 시간, 동물 비용, 및 윤리적인 고려 사항 감소 효과적인 전략은 따라서 매우 귀중 한7.
이 보고서에서 GMS IA와 쥐의 실험적인 그룹 간의 상대 곰 팡이의 비교를 위해 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화를 설명 하는 방법 소개. 곰 팡이 문화에서 감염, 조직 수확 및 처리, 이미지 수집 및 데이터 분석, 각 단계는 자세히 설명 되어 있습니다. 곰 팡이 부담 GMS 정량화 하 여 얻은 정량 IA의 neutropenic 모델에서 그리고 IA8caspofungin 처리 야생-타입 또는 eosinophil 불충분 한 쥐에 비교 되었다. 결과 GMS 정량화와 곰 팡이 DNA의 정량 유사성을 보여. 이것은 GMS 정량화 상대 균 부담 IA와 쥐의 비교의 보조 또는 대체 방법으로 조직학 분석에 종사 하는 연구원에 게 유용 하 고 궁극적으로 비용 및 연구에 있는 동물의 사용을 줄일 수 있습니다. 복잡 한, 기계 연구입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Center</td>
			<td>FGSC #A1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2155315</td>
			<td>White Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L11843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Dry Cabinet</td>
			<td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD</td>
			<td>HSFC160FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass Beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Model DME Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>13595XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse-Ly-6G antibody</td>
			<td>BioXCell</td>
			<td>BP0075-1</td>
			<td>Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>M3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pureline Oxygen Concentrator</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>OC8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slant Board Restraint</td>
			<td>Indiana State University Facilities Management</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Broad-Tipped Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Standard Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol-200 Proof</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 25, L 1 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z192406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-Plastic Norm-Ject Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9742754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B1000729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest&#160;Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Jung Histocut 820 Microtome</td>
			<td>Labequip.com</td>
			<td>31930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>66630-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>116875H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain (Modified GMS) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT100A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC410530250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Superslip Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Provis AX70 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PHOTO Universal Photo System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PHOTO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-MCB-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PS POWER SUPPLY UNIT</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7740020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima C&#160;Plus&#160;Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-257-80</td>
			<td>Displacement- 6.1 cfm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A383-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO&#160;PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML&#160;DFS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9573988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-24</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0451999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform/isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482;&#160;ABsolute Blue qPCR Mixes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB4137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Probe, 5&#8242;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sense Amplification Primer, 5&#8242;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense Amplification Primer, 5&#8242;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#8482; MicroAmp&#8482; Optical 8-Tube Strip, 0.2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>43-165-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Domed and Flat PCR Cap Strips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3005P QPCR System, 110 Volt</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401443</td>
			<td>Stratagene is now owned by Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 (B6) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosinophil-deficient (&#916;dblGATA, BALB/c background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;&#948; T cell-deficient (TCR&#948;-/-, B6 background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>002120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spot Advanced Software</td>
			<td>Spot Imaging</td>
			<td>SPOT53A</td>
			<td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step 4.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis

폐 균 부담의 정량화는 면역 보호 및 폐 곰 팡이 감염의 마우스 모델에서 곰 팡이 독성의 상대적 수준의 결정에 대 한 중요 합니다. 여러 메서드는 곰 팡이 부담을 평가 하는 데 사용 됩니다, 하지만 곰 팡이 DNA의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 이전 문화 기반 방법에 비해 여러 가지 장점 가진 기술로 떠오르고 있다. 현재, 폐 병 리, 백혈구 신규 모집, 곰 팡이 부담, 및 침략 aspergillosis (IA)와 쥐에 유전자 발현의 포괄적인 평가 실험의 뜻깊은 수 및 제어 동물의 사용을 필요로합니다. 여기 폐 조직학 동물의 감소 된 수를 사용 하 여 곰 팡이 부담을 결정 하기 위해 얼룩의 정량화는 자세히 시험 되었다. 폐 섹션 Gomori의 수정된 methanamine 실버 (GMS) 얼룩 곰 팡이 구조를 규명 얼룩이 있었다. 이미지는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 폐 각의 4 개의 개별 분야에서 GMS 스테인드 섹션에서 촬영 됐다. 각 이미지 내의 영역을 스테인드 GMS는 이미지 분석 프로그램을 사용 하 여 계량 했다 그리고이 정량화에서 스테인드 영역의 평균 백분율은 각 샘플에 대 한 결정 했다. 이 전략을 사용 하 여, 전시 eosinophil 불충분 한 쥐 감소 곰 팡이 부담 및 caspofungin 치료, 질병 동안 아이오와 야생-타입 마우스 caspofungin와 함께 개선 되지 않았다. 마찬가지로, 마우스 γ T 세포 부족에 곰 팡이 부담 했다 또한 향상 caspofungin, 정량 및 GMS 정량화로 측정 된. 따라서 GMS 정량화 상대 폐 균 부담 궁극적으로 침략 aspergillosis의 포괄적인 연구에 필요한 실험 동물의 수량을 줄일 수 있는 결정을 위한 방법으로 도입 되었습니다.

그림 4 는 야생 타입의 생존의 그래프를 포함 또는 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 caspofungin 치료. 결과 표시 eosinophil 불충분 한 쥐는 증가 생존 야생-타입 마우스에 비해 전시 (50% 사망률 100% 사망, 대 각각). 그림 5 는 neutropenic에서 얼룩이 지기 대표 GMS 야생-타입 및 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 취급 또는 caspofungin와 치료. Caspofungin 치료 결과 eosinophil 불충분 한, 하지만 아니 야생-타입 마우스 (오른쪽 패널)에 상대 균 클리어런스, 받지 못한 두 그룹이 caspofungin 비슷한 (왼쪽된 패널). 그림 6 caspofungin 치료에 곰 팡이 부담 비교를 보여줍니다 치료 야생-타입 또는 eosinophil 결핍 마우스를 제어, 균 DNA (그림 6A) 및 대표 GMS의 두 정량 Pcr를 사용 하 여 4 (10 X 목표)의 정량화 (필드 그림 6B)입니다. 두 기술에서 생성 된 결과 caspofungin 치료 결과에 가장 중요 한 곰 팡이 부담 야생-타입 및 eosinophil 불충분 한 쥐 (그림 6A) 사이 감소 보여. 그러나, 치료 쥐만 GMS 정량화 호 산 구는 (그림 6B) 부족 한 쥐에 있는 상당한 감소 결과. 전체 폐 GMS 스테인드 섹션의 의미 영역 계산 때 (4 X 목표), 차이 했다 4 대표 10 필드가, 얻은 결과 유사 하지만 덜 통계적 의미 (그림 6 c). 그림 7 보여줍니다 생존, 대표 GMS 얼룩 (4 10 X 필드)의 이미지와 곰 팡이 부담 정량화 두 방법으로 γ T 세포 결핍 (TCRδKO) 마우스를 제어에 비해 caspofungin로 치료 했다, 쥐를 치료. Caspofungin 치료 향상 된 생존 (그림 7A) 및 TCRδKO 마우스에 곰 팡이 부담 (그림 7B-D). 그림 6의 결과 마찬가지로, 버섯 모양 부담의 결과 GMS 정량화 (그림 ℃) 정량 (그림 7B) 및 대표에 의해 측정 했다 비교.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> 그림 4: caspofungin와 치료 후 아이오와 eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA) 쥐에 있는 생존을 증가 했다. 15-30 쥐/그룹입니다. 3-6 실험의 요약입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> 그림 5: 야생-타입, eosinophil 결핍, 및 caspofungin 처리 또는 컨트롤에서 GMS 스테인드 폐 섹션의 대표 이미지 치료 아이오와에 있는 쥐 3-4 쥐/그룹의 대표적인입니다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> 그림 6: 야생-타입에 곰 팡이 부담, eosinophil 불충분 한 쥐 취급 하는 IA 또는 제어 치료 caspofungin. (A) 곰 팡이 DNA의 정량. 15-30 쥐/그룹, 3-6 실험의 요약. (B) GMS의 정량화 조직학 단면도, GMS 4 필드 (10 x 목표)에서 얼룩의 평균 %. (C) GMS 정량화, 전체 폐 섹션 (4 X 목표)의 평균 % B와 C 5 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.001입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 보고 된 데이터를 사용 하 여 생성 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> 그림 7: caspofungin 치료 후 γ T 세포 불충분 한 쥐에 있는 IA의 심각도 감소. (A)의 생존 (B) 곰 팡이 DNA의 정량. (C) GMS 조직학의 정량화. (D) IA, 치료 또는 치료와 함께 caspofungin와 γ T 세포에서 GMS 스테인드 섹션의 대표 이미지. A와 B는 7-10 쥐/그룹 두 실험의 요약. C와 D 4 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.01입니다. p < 0.001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

histological-quantification-to-determine-lung-fungal-burden

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K 조회수.  Indiana University School of Medicine - Terre Haute. 여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

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Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델<em&gt; 결핵균</em&gt; 감염

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

복 포도 당 내성 검사, 폐 기능 측정 및 폐의 고정 비만 및 장애인된 대사 폐 결과에 미치는 영향 연구

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

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설립

에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상

복 포도 당 내성 검사, 폐 기능 측정 및 폐의 고정 비만 및 장애인된 대사 폐 결과에 미치는 영향 연구