Name: histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
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이 연구로는 인디애나 대학 학교의 의학 연구 향상 그랜트와 NIH NIAID 1R03AI122127-01에 의해 부분에서 지원 되었다. N.A.는 Immunologists의 미국 협회에서 경력 면역학 친교에 의해이 기간 동안 부분적으로 지원 되었다.

모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 주립 대학, 인디애나 대학의과 대학의 호스트 캠퍼스 승인 했다-테 르 오 트.
1. A. fumigatus Conidia 감염에 대 한 준비
<ol><li>환기가 증기 두건에서 작업 하는 동안 900 µ L 셀 문화 학년 물 (CCGW) A. fumigatus 293 재고 솔루션의 125 µ L를 추가 합니다. 다음에 맥 아 피 펫을 통해 추출 천 (MEA) 배지 inoculating 루프와 균등 하 게 확산을 솔루션 전송.</li>
	<li>적어도 14 일 동안과 더 이상 28 일 24 ° C에서 어둠 속에서 곰 팡이 접시를 저장.</li>
	<li>유리 비즈를 사용 하 여 앞에서 설명한9conidia 수확.</li>
	<li>접시에 유리 구슬 0.5 m m의 1.5 g를 부 어 부드럽게 그것을 기울이기 앞뒤로 구슬 conidia를 추출 하기 위해 코팅은. 15 mL 원뿔 튜브에 구슬/conidia 혼합물을 수집 합니다. Dulbecco 5 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 소용돌이에 일시 중단 합니다.</li>
	<li>Conidia는 hemocytometer를 사용 하 여 하는 DPBS에 상쾌한의 50 배 희석에서을 계산 합니다. 그림 1 에 표시 된 지역에서 conidia의 수를 계산 하 고 방정식 1 를 사용 하 여 농도 계산 하. #Conidia × 희석 요인 10 ×4= Conidia/mL (식 1) 참고: 추가 4 x 4 사각형 모서리가 영역 수 계산, 방정식 1에 #Conidia로 사용 하는이 분야의 의미와.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig1.jpg"> 그림 1: Hemocytometer 대표 지역 conidia 계산에 사용 (상자, 화살표).
<ol start="6"><li>당 무 균 식 염 수 (DPBS) 원하는 농도, 5 x 106 conidia/50 µ L. 준비 50 µ L conidia 솔루션의 감염에 대 한 108 conidia/mL x 1.0를 가진 conidia 현 탁 액을 희석 ' n + 2' 계정 pipetting에 감염 되는 쥐 오류가 발생 했습니다. 참고: 표준 균 수확 및 준비/여과 또는 사용된10수 있습니다. 유리 구슬 메서드는 가장 사용 conidia 샘플 최소한의 작은/녹는 hyphal 항을 열망에 대 한 가져온.</li>
</ol>2. 면역 억제 및 감염 Murine 모델의
<ol><li>7-10-주-오래 된 마우스를 사용 합니다. 참고: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA, BALB/c 배경), 그리고 γ T 세포 결핍 (TCRδ-/-, B6 배경) 쥐가이 연구를 위해 사용 되었다. 각 실험, 나이 및 성별 일치 (남성과 여성 모두) 마우스 각 그룹에 대해 사용 되었다.</li>
	<li>호 중구 통해 복 (IP) 주입 측면 하단 오른쪽 사분면에 45 °에 메 마른 염 분에 0.1 mL (0.5 mg) 안티-mouse-Ly-6 G 항 체의 고갈 (실험 일정 그림 2참조).</li>
	<li>24 시간 후, 106A. fumigatus conidia 50에 x 5.0 포부 쥐 감염 µ L 살 균 염 분 앞11에서 설명한 (단계 2.4-2.10 참조). 동물의 하위 집합 등이 연구에 사용 하는 DPBS에 5 mg/kg caspofungin diacetate antifungal 에이전트와 함께 주사 감염, 다음 (매일, 그림 2참조).</li>
	<li>99.9 %isoflurane 수의학 마 취 기계를 사용 하 여 함께 마우스를 anesthetize.<ol>
<li>대변과 소변을 잡으려고 유도 챔버의 바닥에 종이 타월을 놓습니다.</li>
		<li>마우스에 유도 챔버, 뚜껑, 보안 고 2 분 및 30에 대 한 5 %isoflurane는 기화 기를 설정 s. 참고: 수 의사 연 고 마 취 총 시간은 5 분 미만 이기 때문에 사용 되지 않습니다.</li>
		<li>30에 대 한 최대 설정의 절반은 기화를 줄일 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>확인 호흡, 운동의 부족 및 발가락 꼬집어 자극에 응답의 부족 둔화 마우스 제대로 관찰 하 여 마 취.</li>
	<li>유도 약 실 및 경사 보드에 장소에서 마우스를 제거 합니다. 보드에 대 한 그것의 뒤를 가진 마우스를 놓습니다. 그것의 위 앞 니는 고무 밴드와 부드럽게 절제 된 더 낮은 앞 니 부드럽게 금속 와이어와 절제 된 확인 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 작은 집게와 혀의 기지에서 conidia/PBS 서 스 펜 션의 피 펫 50 µ L 전체 확장에서 혀를 개최.</li>
	<li>전체 확장; 혀를 잡으십시오 빠른 호흡과 열망의 독특한 클릭 소음을 들어봅니다. 20 동안 s 또는 서 스 펜 션은 완벽 하 게 발음 하는 때까지.</li>
	<li>경사 보드에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 관찰에 대 한 감 금 소에 배치.</li>
	<li>포부, 다음 마우스 야 회복 1 분 모니터 내 의식 마우스까지 완벽 하 게 의식 하 고 감 금 소의 주위에 걸을 수 있습니다. 동물 21 ° C에서 지 내게 하 고 폐는가 걷이 될 때까지 두 번 매일 모니터링 해야 합니다.</li>
	<li>호 중구 (단계 2.2) 24 h 후 감염 (그림 2)의 소모를 반복 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig2.jpg"> 그림 2: 실험 일정. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다.
3. 수확 및 조직학 분석을 위한 마우스 폐의 보존
<ol><li>깊이 anesthetize 390 mg/ml pentobarbital 나트륨 솔루션 IP의 0.1 ml의 치명적인 복용량을 가진 동물.</li>
	<li>핀셋으로 자발적인 호흡의 부족 및 사지 자극 반응의 부재를 관찰 하 여 안락사를 확인 합니다. 안락사, 일단 70% 에탄올 소독과 시체를 스프레이.</li>
	<li>흡수 성 패드로 덮여 폼 보드에 시체를 놓습니다. 참고: 시체 두어야 한다 그것의 뒤에 폼 보드에 모든 4 개의 사지를 고정 하는 핀.</li>
	<li>주의와 위를 사용 하 여 상단의 가슴 구멍을 엽니다. 폐 및 심 혼을 노출 하려면 흉 곽을 떨어져 잘라. 관류 수 있도록 열 등 한 베 나 정 맥을 잘라. 혈관을 절단 하 고 장기를 puncturing 하지 마십시오.</li>
	<li>천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 5 mL와 함께 perfuse. 10% 포 르 말린의 5 mL와 관류를 반복 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 기도 하 고 주변 지방 패드를 분리. 주의 사용 하 고 기도 puncturing 피하십시오. 초과 결합 조직 완전히 진행 하기 전에 기도 시각화 하기 위해 제거를 확인 합니다. 일단 기도 노출 장소 그것을 상승 기도 아래 집게.</li>
	<li>25 G 바늘을 사용 하 여 위쪽 기도에 작은 구멍 고추. 참고: 구멍 해야 될 배치 전체 정 기도에 맞는. 주의 사용 하 여 기관지 파열 방지.</li>
	<li>정 및 폐 쪽으로 구멍을 통해 삽입 합니다. 기관지 주위에 느슨하게 묶인 수술 실로 정을 보안 합니다. 참고: 기관지 파열 하는 경우는 정 가능한 기도에서 기도 과거 삽입할 수 있습니다.</li>
	<li>주사기를 사용 하는 정 맥을 통해 10% 포 르 말린 버퍼의 1 mL와 함께 폐 부 풀 려. 폐의 인플레이션 볼 수 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 카 테 터를 조정 하 고 반복. 폐가 팽창 되 면 신속 하 게 주의 정 맥을 제거 하 고 안전 하 게 봉쇄 기도 스레드 조입니다. 참고: 기관지 파열 폐 팽창 될 수 없는 경우에, 폐 수확 여전히 수 있습니다 하지만이 적절 한 고정 되지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 기관지 및 폐에서에서 제거 가슴 신중 하 게 스레드를 잡아 당겨 부드럽게 하는 동안 집게와 기도의 결합 조직을 뽑아야 합니다. 10% 포 르 말린 버퍼의 15 mL 50 mL 원뿔 튜브에 폐와 기관지를 놓습니다. 스레드 튜브 외부의 한쪽 끝을 배치 하 고 뚜껑을 봉인. 완전히 정착 액에 샘플 잠수함 튜브 반전.</li>
	<li>적어도 24 시간 또는 추가 처리 때까지 실 온에서 샘플을 저장 합니다. 주의: 포 르 말린은 유해. 고글, 얼굴 마스크 등 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 샘플을 처리할 때 화학 후드 작동 합니다.</li>
</ol>4. 수확 및 DNA 곰 팡이 부담에 대 한 마우스의 폐의 보존
<ol><li>별도 마우스에 위에서 설명한 단계 3.1-3.5를 수행 합니다.</li>
	<li>천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 10 mL와 함께 perfuse.</li>
	<li>가 위 폐를 소비 세와 레이블이 1.5 mL 튜브에.</li>
	<li>추가 처리까지-80 ° C에서 폐를 저장 합니다.</li>
	<li>(포함 및 단면)에 설명 된 대로, 제조업체의 프로토콜 ( 재료의 표참조)에 따라 표준 기법을 사용 합니다.</li>
</ol>5. 현미경 및 이미징
<ol><li>이미징 정량화 프로그램 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>가벼운 현미경을 사용 하 여, 슬라이드 (10 X 목표) 스테인드 GMS의 4 가지 분야를 얻을. 이미지 비슷한 조직 밀도와 폐 내의 감염 된 항공의 대표 인지 확인 합니다. 참고: 밀도 및 hyphal foci의 유통 제어 및 실험 그룹 사이 현저 하 게 다른 경우, 추가 필드 촬영 될 수 있습니다, 또는 전체 폐 섹션의 GMS 지역 몇 군데 있습니다 (4 X 목표). 원하는 경우 hematoxylin와 오신, 스테인드 직렬 폐 섹션에 (동등한 조직 형태 식별) 폐의 같은 영역에의 이미지를 얻을.</li>
	<li>필요한 경우 이미지에 눈금 막대를 추가 하 고 측정할 수에 이미지를 저장. 선택, 편집 > 추가/편집 교정 표시 > 메뉴: 선 두께, 색상 및 스케일 바 크기 선택 > 눈금 막대 배치 하는 대 한 이미지를 클릭 하십시오. 메뉴를 닫고 선택, 편집 > 병합 > 교정 표시 병합 > 파일 이름으로 저장 선택 > 파일의 이름을 지정 하 고 클릭 저장.</li>
</ol>6. 곰 팡이 부담 (그림 3)를 계산 하는 이미지 처리 프로그램을 사용 하
<ol><li>이미지 처리 프로그램을 엽니다. 파일을 선택 > 계량 샘플 폴더 > 이미지 (그림 3A). 이미지 선택 > 형식 > 변환 "RGB 스택" (그림 3B).</li>
	<li>3 주어진된 이미지 (그림 3B)의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. "컨트롤 + 교체 + T"를 명 중을 "임계값" 메뉴 설정 조절기 (그림 3C). 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 이미지 보기 프로그램 (그림 3C)와 열.</li>
	<li>왼쪽에 있는 모든 방법을 위쪽 슬라이더를 당겨와 (red)에 선택 영역 (일반적으로 이르기까지 130-160에서 슬라이더 (그림 3C)의 오른쪽에 표시 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정.</li>
	<li>일단 선택, 눌러 "설정" > "확인" (그림 3D). "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인" (그림 3D).</li>
	<li>공백 또는 배경 얼룩의 중요 한 영역 선택 영역이 나 다각형 도구로 적절 한 조직에 의해 제외 될 수 있습니다.</li>
	<li>마지막으로, "분석"을 선택 > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 탭 표시, "결과" 표시 됩니다) (그림 3E). 그래프를 위한 데이터 분석 프로그램을 데이터를 전송 및 통계 분석.</li>
	<li>각 폐 샘플에 대 한 4 개의 영역 비율의 평균을 입력 합니다. 5-8 샘플 그룹 간의 중요 한 차이 검출 하기 위하여 일반적으로 충분 하다. 두 실험 그룹을 비교 하는 경우 수행 하는 짝이 없는 학생의 t-의미를 확인 하려면 테스트.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig3.jpg"> 그림 3: GMS 조직학의 각 단계에 대 한 대표 스크린샷 필드 정량화. (A) 파일 선택 > 계량 샘플 폴더 > 선택 이미지. (B)을 선택 이미지 > 형식 > "RGB 스택" 변환. 3 주어진된 이미지의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. (C) 히트 "컨트롤 + 교체 + T" "임계값" 메뉴 설정 조절기를가지고. 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 사진 뷰어 프로그램으로 열기. 모든 방법은 왼쪽과 (red)에 선택 영역 (일반적으로에서 이르기까지 130-160으로 슬라이더의 오른쪽에 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정 가기 슬라이더를 당겨. (D) 선택 된 언론 "설정" > "확인". "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인". (E) "마지막으로 선택 분석" > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 있는 탭 "결과" 레이블이 표시 됩니다). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
7. DNA 곰 팡이 부담
<ol><li>-80 ° C에서 폐를 제거 하 고 적어도 4 h lyophilize (하룻밤 최적입니다) 또는 동결 건조 시스템에 의해 완전히 건조 될 때까지.</li>
	<li>폐를 건조 하는 동안 DNA 추출 버퍼 (0.1 m M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0 및 0.5 %SDS)를 준비.</li>
	<li>미리 따뜻하게 60 ° C 물 욕조에 준비 된 DNA 추출 버퍼를 놓습니다. 또한, 페 놀 장소: 클로 프롬: isoamyl 알콜 50 mL 원뿔 튜브에서 (25:24:1) 분리에 대 한 허용.</li>
	<li>유리 구슬의 0.2 mL 2 mL 스크류 캡 튜브에 동결 건조 된 폐를 놓습니다. 그것은 정밀한 분말을 형성 될 때까지 15-30에 대 한 건조 폐 조직 갈기 구슬 때리는 사용 하 여.</li>
	<li>각 튜브와 소용돌이를 0.8 mL 따뜻한 DNA 추출 버퍼를 잘 추가 합니다. 추가 15 분 동안 잠복기 전에 각 튜브 65 ° C 비드 목욕 그리고 소용돌이에서 15 분을 품 어. 잠복기, 후 소용돌이 그리고 원심 분리기 튜브 25000 x g 10 분에 합니다.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 1.5 mL 튜브의 3 세트를 분류 하 고 튜브의 1 세트에는 상쾌한의 상위 계층을 전송. 수성 상위 레이어 밖으로 pipetting 동안 주의 사용 하 여 중간 계층을 방해 하지 않도록.</li>
	<li>페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘 혼합. 다음 상위 레이어 밖으로 튜브의 두 번째 세트에 pipetting 전에 15 분에 대 한 25000 x g에서 원심.</li>
	<li>클로 프롬: isoamyl 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘, 튜브의 3 세트에 10 분 신중 하 게 상위 레이어 밖으로 피 펫에 대 한 25000 x g에서 원심.</li>
	<li>추가 500 µ L 소 프로 파 놀의 50 µ L NaoAc (pH 5.2), 잘, 그리고 샘플 10 분 동안 실내 온도에 알을 품을 수 있도록. 다음 30 분 동안 25000 x g에서 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>25000 x g. Decant 에탄올에서 얼음 찬 70% 에탄올과 5 분 원심 분리기의 750 µ L로 DNA 펠 릿을 세척 하 고 40 분 동안 증기 두건에 튜브에 공기를 펠 릿 건조 허용.</li>
	<li>건조 알 약 테 버퍼의 300 µ L에서 resuspend. 참고: DNA 정량까지-20 ° C에서 저장 수 있습니다.</li>
	<li>DNA는 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량 및 정량 분석에 대 한 각 DNA 샘플의 µ 0.2 µ g/L의 100 µ L를 준비.</li>
	<li>3 중 1 µ g의 DNA 샘플, 곰 팡이 18S rDNA 입문서와 함께 앞에서 설명한 표준 정량 수행 하 고 수정 된 프로브 끄는 프로브 세트 (5'-/ 56-팸/AGC CAG CGG/선/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')12,13.</li>
	<li>A. fumigatus genomic DNA에서 표준 곡선을 준비 하 고 각 페이지에 곰 팡이 DNA의 농도 계산 평균 기자를 사용 하 여 샘플 염색 Ct 값.</li>
	<li>플롯은 pg / µ g 균 DNA의 뜻의 표준 오류와 함께. 수행 하는 학생의 t-테스트 의미를 결정 하는 분석. 참고:으로 덜 독성 대안을 여기서 페 놀-클로 프롬 DNA 추출, 열 기반 DNA 추출 키트를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 문서의 목적은 이미지 분석 및 정량화에 대 한 GMS 스테인드 폐 조직학 단면도 이용 하 여 IA와 쥐에 폐 버섯 모양 부담의 결심을 위한 방법을 소개 했다. 이 연구, 치료에에서 β-글 루 칸-합성-대상으로 항진균 약물 caspofungin14 개선 하지 않은 생존 또는 IA8neutropenic 야생-타입 마우스에 곰 팡이 부담. 그러나, 호 산 구는 γ T 세포의 부재, 생존 및 곰 팡이 부담 개선. 우리의 연구 결과 또한 널리 이용 균 DNA 정량 방법6에 비해 GMS 곰 팡이 부담 하 여 비교 결과 얻을 수 있습니다 설명 했다.
GMS 곰 팡이 부담 정량화를 활용 하 여 여러 가지 혜택을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 프로세스 따라서 잠재적으로 상당한 차이 확인 하는 데 필요한 실험의 수를 줄이고 기존 조직학 샘플 활용 수 있습니다. 둘째, 본이 연구에서는 적은 동물 GMS 곰 팡이 부담 정량화 (그림 6, 그림 7) 곰 팡이 DNA의 정량에 비해 상당한 차이 달성 하기 위해 필요 했다. 셋째, 정량 하 여 다른 격리에 곰 팡이 부담 비교 ribosomal DNA 복사 번호15에 격리 종속 차이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 반면, GMS 정량화는 영향을 받지 복사본 수로 곰 팡이 부담 폐 곰 팡이 성장의 상대적 수준에 의해 결정 됩니다. 따라서, 곰 팡이 부담에 대 한 GMS 정량화를 사용 하 여 척 추가 있는 동물의 사용 줄이고 rDNA 복사 번호의 사전 결정을 필요 하지 않습니다. 마지막으로, 곰 팡이 형태를 수정 하는 것 외에도 caspofungin 치료 곰 팡이 조각화, 증가 하 고 따라서 인위적으로 증가 시킬 수 있습니다 폐 homogenates12,16에서에서 콜로 니 형성 단위의 절연 측정 때 곰 팡이 부담 ,17. 따라서, 곰 팡이 부담 GMS 정량화 다른 일반적으로 사용 되는 방법으로 몇 가지 제한 내재를 방지합니다.
그러나, GMS 정량화 그리고/또한이 연구의 한계는 중요 한 것. 첫째, 저자 각 실험 그룹의 폐에 걸쳐 hyphal 성장의 유사한 분포를 가정 하 고 따라서 4 대표 10에서에서 정량화 객관적인 필드 x으로 사용 대표적인 측정 전체 폐에 곰 팡이 부담에 대 한 (그림 6B)입니다. 그 어떤 경우에 상대 분포, 크기 및 밀도 hyphal foci의 충분히 다 곰 팡이 부담 정량 메서드에서이 메서드 및 해당 다른 표시는 가능 하다. 그러나, 우리의 추가 결과 4 X 객관적인 필드를 사용 하 여 전체 폐 섹션 정량화를 비슷한, 그룹 (그림 6 c) 간의 통계적으로 유의 한 차이 이기는 하지만 덜 보였다. 이 부 량의 표준 오차는이 전략, 목표 및 차선 분야에서 증가 배경 4 감소 hyphal 해상도 때문에 가능성이 증가 되었다. 따라서, 더 높은 확대에 적은 분야의 대표적인 부 량이 좋습니다. 둘째, 단일, 중앙 섹션은 각 샘플에 사용 됩니다. 그것은 가능한, 곰 팡이 분리에 따라 또는 쥐 종자 사용, 일부 연구 hyphal 성장의 고르지 못한 배급에 발생할 수 있습니다. 그 경우에 각 파라핀 블록에 걸쳐 추가 섹션 더 대표 부담을 정량 한다. 셋째, 실험에는 상당한 생산 (즉, 측정 알레르기 bronchopulmonary aspergillosis (ABPA)18 또는 낭 성 섬유 증 (CF)18에 곰 팡이 성장 기도), mucins의와 GMS 반응성 유도 다 당 류-풍부한 mucins19 일반적인 GMS + 결과 하 고 따라서 높은 균 부담에 찬성 하 여 몇 가지 샘플을 기울일 수 있습니다. IA의 neutropenic 모델을만이 연구에 사용 되었다, 다른 면역 능력 또는 진압 모델의 사용 덜 비교 결과에 결과 수 가능 하다. 이러한 경고에도 불구 하 고 GMS 정량화 곰 팡이 부담을 결정 하는 유사한 기술 하며 추가 연구에 지속적인된 사용 유틸리티 일관성, 신뢰성, 그리고 비용 효과적으로이 방법의 유효성을 검사 추가 수 있습니다.

IA 면역 진압 치료 또는 만성 감염1,2선 천 적 또는 후 천 적인 면역 결핍과 취약 개인에 개발할 수 있는 기회 감염 이다. 1 차 감염 자주 폐, 간, 신장, 심장, Aspergillus fumigatus 의 일부 인스턴스 배포에서 발생 하 고 뇌를 심각한 질병 그리고 높은 함께 균의 광범위 한 조직 내 습의 결과로 발생할 수 있습니다. 사망률1,2의 속도. 또한, 기존 pharmacotherapies의 효능 제한, 그리고 환경3항진균-저항 하는 긴장의 출현에 의해 더 약화 될 수 있습니다. 그것은 그러므로 침략 버섯 모양 질병의 악화 또는 개발을 촉진 하는 곰 팡이 독성 및 병 리의 메커니즘을 이해 하는 것이 중요입니다.
그들은 곰 팡이 독성 유전자의 역할을 평가 하 고 설립과 A. fumigatus vivo에서4,5의 성장에 대 한 면역 이펙터를 호스트 하는 연구자 수 murine 모델 기계적 아이오와 연구에 대 한 중요 한 유지. 따라서, 여러 전략 효과적으로 계량 하거나 비교 실험 동물6,7의 그룹에 게 선 부담 고안 되었습니다. 이러한 전략 문화 기반, 생화학, immunoassay, 또는 정량 방법, 각각 고유한 장점과 단점을 포함 한다. 또한, 이러한 메서드의 각 면역 effector 기능, 유전자 표정 분석 및 비교 histopathology7의 평가 대 한 희생 뿐 아니라 동물의 부분 집합의 헌신을 포함. 따라서, 포괄적인 IA 연구는 종종 상당한 비용 연구 동물의 많은 수를 필요로합니다. 동물의 조직 여러 분석을 이용 하 여 실험 시간, 동물 비용, 및 윤리적인 고려 사항 감소 효과적인 전략은 따라서 매우 귀중 한7.
이 보고서에서 GMS IA와 쥐의 실험적인 그룹 간의 상대 곰 팡이의 비교를 위해 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화를 설명 하는 방법 소개. 곰 팡이 문화에서 감염, 조직 수확 및 처리, 이미지 수집 및 데이터 분석, 각 단계는 자세히 설명 되어 있습니다. 곰 팡이 부담 GMS 정량화 하 여 얻은 정량 IA의 neutropenic 모델에서 그리고 IA8caspofungin 처리 야생-타입 또는 eosinophil 불충분 한 쥐에 비교 되었다. 결과 GMS 정량화와 곰 팡이 DNA의 정량 유사성을 보여. 이것은 GMS 정량화 상대 균 부담 IA와 쥐의 비교의 보조 또는 대체 방법으로 조직학 분석에 종사 하는 연구원에 게 유용 하 고 궁극적으로 비용 및 연구에 있는 동물의 사용을 줄일 수 있습니다. 복잡 한, 기계 연구입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus fumigatus&lt;/em&gt; 293 Stock Solution</td><td>Fungal Genetics Stock Center</td><td>FGSC #A1100</td><td></td></tr><tr><td>HyPure Cell Culture Grade Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>Malt Extract</td><td>MP Biomedicals</td><td>2155315</td><td>White Powder</td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>L11843</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Auto Dry Cabinet</td><td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD</td><td>HSFC160FD</td><td></td></tr><tr><td>1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm Glass Beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td># 0267110</td><td></td></tr><tr><td>Leica Model DME Microscope</td><td>Leica</td><td>13595XXX</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&amp;nbsp;syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192384</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse-Ly-6G antibody</td><td>BioXCell</td><td>BP0075-1</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>Caspofungin diacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1169567762</td><td></td></tr><tr><td>Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine</td><td>Supera Anesthesia Innovations</td><td>M3000</td><td></td></tr><tr><td>Pureline Oxygen Concentrator</td><td>Supera Anesthesia Innovations</td><td>OC8000</td><td></td></tr><tr><td>Slant Board Restraint</td><td>Indiana State University Facilities Management</td><td>Custom made</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&amp;nbsp;PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>General-Purpose Broad-Tipped Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Standard Dissecting Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol-200 Proof</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-63</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&amp;nbsp;syringe needles, gauge 25, L 1 in.</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z192406</td><td></td></tr><tr><td>All-Plastic Norm-Ject Syringes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-30</td><td></td></tr><tr><td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9742754</td><td></td></tr><tr><td>Formalin Solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs</td><td>Fisher Scientific</td><td>B1000729</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest&amp;nbsp;Histoplast Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Jung Histocut 820 Microtome</td><td>Labequip.com</td><td>31930</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Precision Scientific</td><td>66630-23</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>116875H</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain (Modified GMS) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT100A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC410530250</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Superslip Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-89</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Provis AX70 Microscope</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-AX70</td><td></td></tr><tr><td>U-PHOTO Universal Photo System</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-PHOTO</td><td></td></tr><tr><td>U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-MCB-2</td><td></td></tr><tr><td>U-PS POWER SUPPLY UNIT</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-PS</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System</td><td>LABCONCO</td><td>7740020</td><td></td></tr><tr><td>Maxima C&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;Vacuum Pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-257-80</td><td>Displacement- 6.1 cfm</td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-4</td><td></td></tr><tr><td>AMRESCO&amp;nbsp;PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML&amp;nbsp;DFS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9573988</td><td></td></tr><tr><td>Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-24</td><td>BioSpec Products</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0451999</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform/isoamyl alcohol 24:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-570</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade;&amp;nbsp;ABsolute Blue qPCR Mixes</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB4137A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Probe, 5&amp;prime;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&amp;prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sense Amplification Primer, 5&amp;prime;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&amp;prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Antisense Amplification Primer, 5&amp;prime;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&amp;prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems&amp;trade; MicroAmp&amp;trade; Optical 8-Tube Strip, 0.2mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>43-165-67</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Domed and Flat PCR Cap Strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0386</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR System, 110 Volt</td><td>Agilent</td><td>401443</td><td>Stratagene is now owned by Agilent</td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 (B6) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Eosinophil-deficient (&amp;Delta;dblGATA, BALB/c background) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005653</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;&amp;delta; T cell-deficient (TCR&amp;delta;-/-, B6 background) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002120</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Spot Advanced Software</td><td>Spot Imaging</td><td>SPOT53A</td><td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr><tr><td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Step 4.5</td><td></td><td></td><td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td></tr></tbody></table>

histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis

폐 균 부담의 정량화는 면역 보호 및 폐 곰 팡이 감염의 마우스 모델에서 곰 팡이 독성의 상대적 수준의 결정에 대 한 중요 합니다. 여러 메서드는 곰 팡이 부담을 평가 하는 데 사용 됩니다, 하지만 곰 팡이 DNA의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 이전 문화 기반 방법에 비해 여러 가지 장점 가진 기술로 떠오르고 있다. 현재, 폐 병 리, 백혈구 신규 모집, 곰 팡이 부담, 및 침략 aspergillosis (IA)와 쥐에 유전자 발현의 포괄적인 평가 실험의 뜻깊은 수 및 제어 동물의 사용을 필요로합니다. 여기 폐 조직학 동물의 감소 된 수를 사용 하 여 곰 팡이 부담을 결정 하기 위해 얼룩의 정량화는 자세히 시험 되었다. 폐 섹션 Gomori의 수정된 methanamine 실버 (GMS) 얼룩 곰 팡이 구조를 규명 얼룩이 있었다. 이미지는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 폐 각의 4 개의 개별 분야에서 GMS 스테인드 섹션에서 촬영 됐다. 각 이미지 내의 영역을 스테인드 GMS는 이미지 분석 프로그램을 사용 하 여 계량 했다 그리고이 정량화에서 스테인드 영역의 평균 백분율은 각 샘플에 대 한 결정 했다. 이 전략을 사용 하 여, 전시 eosinophil 불충분 한 쥐 감소 곰 팡이 부담 및 caspofungin 치료, 질병 동안 아이오와 야생-타입 마우스 caspofungin와 함께 개선 되지 않았다. 마찬가지로, 마우스 γ T 세포 부족에 곰 팡이 부담 했다 또한 향상 caspofungin, 정량 및 GMS 정량화로 측정 된. 따라서 GMS 정량화 상대 폐 균 부담 궁극적으로 침략 aspergillosis의 포괄적인 연구에 필요한 실험 동물의 수량을 줄일 수 있는 결정을 위한 방법으로 도입 되었습니다.

그림 4 는 야생 타입의 생존의 그래프를 포함 또는 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 caspofungin 치료. 결과 표시 eosinophil 불충분 한 쥐는 증가 생존 야생-타입 마우스에 비해 전시 (50% 사망률 100% 사망, 대 각각). 그림 5 는 neutropenic에서 얼룩이 지기 대표 GMS 야생-타입 및 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 취급 또는 caspofungin와 치료. Caspofungin 치료 결과 eosinophil 불충분 한, 하지만 아니 야생-타입 마우스 (오른쪽 패널)에 상대 균 클리어런스, 받지 못한 두 그룹이 caspofungin 비슷한 (왼쪽된 패널). 그림 6 caspofungin 치료에 곰 팡이 부담 비교를 보여줍니다 치료 야생-타입 또는 eosinophil 결핍 마우스를 제어, 균 DNA (그림 6A) 및 대표 GMS의 두 정량 Pcr를 사용 하 여 4 (10 X 목표)의 정량화 (필드 그림 6B)입니다. 두 기술에서 생성 된 결과 caspofungin 치료 결과에 가장 중요 한 곰 팡이 부담 야생-타입 및 eosinophil 불충분 한 쥐 (그림 6A) 사이 감소 보여. 그러나, 치료 쥐만 GMS 정량화 호 산 구는 (그림 6B) 부족 한 쥐에 있는 상당한 감소 결과. 전체 폐 GMS 스테인드 섹션의 의미 영역 계산 때 (4 X 목표), 차이 했다 4 대표 10 필드가, 얻은 결과 유사 하지만 덜 통계적 의미 (그림 6 c). 그림 7 보여줍니다 생존, 대표 GMS 얼룩 (4 10 X 필드)의 이미지와 곰 팡이 부담 정량화 두 방법으로 γ T 세포 결핍 (TCRδKO) 마우스를 제어에 비해 caspofungin로 치료 했다, 쥐를 치료. Caspofungin 치료 향상 된 생존 (그림 7A) 및 TCRδKO 마우스에 곰 팡이 부담 (그림 7B-D). 그림 6의 결과 마찬가지로, 버섯 모양 부담의 결과 GMS 정량화 (그림 ℃) 정량 (그림 7B) 및 대표에 의해 측정 했다 비교.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> 그림 4: caspofungin와 치료 후 아이오와 eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA) 쥐에 있는 생존을 증가 했다. 15-30 쥐/그룹입니다. 3-6 실험의 요약입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> 그림 5: 야생-타입, eosinophil 결핍, 및 caspofungin 처리 또는 컨트롤에서 GMS 스테인드 폐 섹션의 대표 이미지 치료 아이오와에 있는 쥐 3-4 쥐/그룹의 대표적인입니다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> 그림 6: 야생-타입에 곰 팡이 부담, eosinophil 불충분 한 쥐 취급 하는 IA 또는 제어 치료 caspofungin. (A) 곰 팡이 DNA의 정량. 15-30 쥐/그룹, 3-6 실험의 요약. (B) GMS의 정량화 조직학 단면도, GMS 4 필드 (10 x 목표)에서 얼룩의 평균 %. (C) GMS 정량화, 전체 폐 섹션 (4 X 목표)의 평균 % B와 C 5 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.001입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 보고 된 데이터를 사용 하 여 생성 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> 그림 7: caspofungin 치료 후 γ T 세포 불충분 한 쥐에 있는 IA의 심각도 감소. (A)의 생존 (B) 곰 팡이 DNA의 정량. (C) GMS 조직학의 정량화. (D) IA, 치료 또는 치료와 함께 caspofungin와 γ T 세포에서 GMS 스테인드 섹션의 대표 이미지. A와 B는 7-10 쥐/그룹 두 실험의 요약. C와 D 4 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.01입니다. p < 0.001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

histological-quantification-to-determine-lung-fungal-burden

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K 조회수.  Indiana University School of Medicine - Terre Haute. 여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

비디오: Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

<meta charset="utf8"></head><body>형광 현미경 분석을 위한 폐의 곰팡이 포자 국소화 보존

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

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2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법