This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.

참고 : 연구실 안전에 관한 사항 표준 실험실 모범 사례에 준하여 다음 사항을 준수하십시오. 적절한 위치에있는 모든 유기 용제를 저장합니다. 화학 성분의 명확한 표시와 화학 폐기물 용기에있는 모든 폐기물을 보관하십시오. 이러한 프로토콜에 사용되는 몇 가지 시약 잠재적 인 발암 물질이나, 휘발성 가연성 가스를 생성 환기 흄 후드에서 모든 시약을 처리합니다. 유기 용매를 사용하여 작업 할 때와 같은 장갑, 실험실 코트, 및 눈 보호 등의 개인 보호 장비를 착용 할 것. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px" /> 에 - 겔 O-글라 이코믹스 1. 절차를 그림. 관심의 (A) 단백질은 적절한 염색 절차 (코마 또는 실버)에 의해 감지, SDS-PAGE에 의해 해결하고 절제되어있다. 절제된 젤 조각 썰어작은 큐브로, 탈색, 이후 MS 분석을 방해 오염물을 감소시키기 위해 에틸 아세테이트로 세척 하였다. 겔 슬라이스의 일부는 LC-MS / MS에 의해 겔 트립신 소화 및 후속 단백체 특성화를 위해 예약 될 수있다. (B) O 연결 글리 칸은에 - 겔 환원 β-제거하여 해결할 당 단백질에서 해제됩니다. 필수 단계는 탈염 및 메탄올 공비에 의한 붕산 제거를 포함한다. 메틸화 및 이후 수성 ​​및 유기 단계로 분할된다 (C) 환원 β-제거가 발표 한 글리 칸을 O 링크. Sulfoglycans 정량적 상단 (수성) 단계에서 회수 낮은 (DCM) 층으로 중립 시알 글리 칸을 분할한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px" /> 에 - 겔 글라 이코믹스 그림 2. 상세 흐름도. 각 experimen도 1에 도시 탈 단계가 개별적으로 도시되어있다. (A) 젤 탈색하고, EtOAc 추출, (B)에서 - 겔 환원 O 연결된 글리 칸 릴리스에 대한 β-제거하고, 직접 (C)과 메틸화 및 위상 파티션. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 1. 젤 절제 젤 유래 오염 물질의 제거 <ol><li> 절차를 시작하기 전에, 재료 목록에 화학 물질과 시약을 준비합니다. </li><li> 표준 트리스 - 글리신 버퍼 시스템을 사용하여 SDS-PAGE 겔상의 단백질을 해결. 얼룩은 쿠마시 브릴리언트 블루 또는 실버 얼룩 중 하나와 단백질을 해결. 일반적으로, 실버 스테인드 젤에서 O 연결 글리 칸의 회복은 코마에서 달성 복구의 약 80~90%가 젤 스테인드입니다. </li><li> 전기 영동 후, 유리판 및 소비세 t에 겔을 배치깨끗한 메스 또는 면도날을 사용하여 관심의 그는 지역. </li><li> 오 글리 칸의 수율을 증가 다른 유리 접시에 관심의 겔 밴드를 전송하고 약 2mm 큐브로 적출 된 젤 조각을 잘라합니다. 글리 칸 복구가 감소되기 때문에 젤 조각을 1 mm보다 작 큐브를 피합니다. 스테인리스 microspatula와 나사 상부 유리관 (13 × 100 ㎜)로 작은 겔 조각을 전송. </li><li> 샘플 튜브에 25 mM의 중탄산 암모늄 (AMBIC, 3 NH 4 HCO) 1 ml를, 테플론 늘어선 나사 상단 뚜껑과 유리 튜브 캡 추가하고 부드럽게 10 분간 방치시키는 전에 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 겔 조각들을 추출 피하기 위하여 격렬하게 교반을 채용하지 않는다. </li><li> 조심스럽게 유리 파스퇴르 피펫 또는 매우 긴 플라스틱 팁 장착 피펫을 사용하여 유리 튜브로부터 제거 AMBIC. 스매싱과 AMBIC 솔루션을 제거하는 동안 작은 젤 조각을 전송하지 마십시오. </li><li> 아세토 니트릴 (ACN)의 1 ML을 추가유리 튜브, 모자, 부드럽게 10 분간 방치셔서 전에 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 겔 조각이 완전히 용매로 덮여 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 튜브 벽의 해제 및 피펫 팁과 용매에 젤 조각을 밀어 넣습니다. </li><li> 유리관에서 ACN을 피펫과 밝은 푸른 색이 제거 될 때까지 반복 1.5-1.7 단계를 반복합니다. 필요한 경우 다섯 순차적 AMBIC / ACN 세척의 최소를 반복합니다. 실버 스테인드 젤의 경우, destain 키트를 사용합니다. 겔 조각이 ACN에 균일하게 흰색 동안 켤 때 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 유리 튜브에서 액체를 피펫 튜브를 요약하자면, AMBIC 1 ㎖를 추가하고 5 분 동안 서 보자. </li><li> AMBIC를 제거하고 유리관에 에틸 아세테이트 (EtOAc로) 2 ㎖를 추가한다. 또는 엔드 오버 엔드 교반 또는 야간에 4 ° C에서 테플론 늘어선 모자와 장소 요점을 되풀이 튜브 30 분 각각 실온에서 세 EtOAc로 세척을 수행합니다. 이상을 EtOAc 세척, 오염 물질의보다 효율적으로 제거. </li><li> 제거최종 EtOAc를 씻고 H 2 O 2 ㎖ 세 세척을 각각 수행 EtOAc로의 완전한 제거는 강력한 환원 β-제거 반응을 보장합니다. </li><li> H 2 O를 피펫 ACN 1 ㎖로 한번 세정함으로써 겔을 탈수. 참고 : 건조 후, 탈수 젤에서 젤 β-제거를위한 준비가되어 있습니다. 탈수 겔 조각을 사용할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 무관 겔에 적용되는 버퍼 또는 용액 중, 어느 단계에서 세척 공정을 중지하고 밤새 39 ° C에서 겔 조각을 저장 (AMBIC, ACN, H 2 O). 다음 2 일 이내에 언제든지 샘플 준비를 다시 시작합니다. </li><li> 표준 프로 테오 믹 방법에 의해 단백질 ID 용 탈색 탈수 젤 조각의 일부를 사용한다. </li></ol> 환원 적 β-제거 2.에서 젤 O-글리 칸 출시 <ol><li> 사용할 때까지 4 ° C에서 50 %의 NaOH 또는 고체의 NaOH 및 저장소를 사용하여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH) 원액을 준비합니다. <ol&gt; <li> 50 %의 NaOH (또는 고체의 NaOH 4g) 5.2 mL를 취하여 1 M NaOH 용액을 100 ml의 볼륨을 조절합니다. 환원 β-제거 반응 효율의 손실없이 최대 6 개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다 100 mM의 NaOH를,에 1 M 수산화 나트륨 원액을 희석. </li></ol></li><li> 100 mM의 2 M NaOH를 수소화 붕소 나트륨 (에 NaBH 4) 확인. 100 mM의 NaOH를 0.5 ml의의 NaBH 4의 38 mg을 녹인다. 일반적으로, 각각의 샘플에 대한 보로 하이드 라이드 0.5-1.0 ml의 용액을 사용한다. 단계 1에서 제조 한 건조 겔 조각의 양에 반응 용액의 부피가 1-2 절제 겔 조각 (단계 1.3)에 대한 보로 하이드 라이드 용액 0.5㎖의 사용을 기대 바리. </li><li> 탈수 젤 조각에 100 mM의 NaOH를 500 μl를 추가하고 글리 칸 복구를 향상 기본 조건에 젤을 평형하기 위해 얼음에 3 ~ 5 분간 방치 할 수 있습니다. </li><li> 1 M의 NaBH의 최종 농도의 결과로, 100 mM의 NaOH를 2 M의 NaBH 4의 500 μl를 추가 <sub100 mM의 NaOH를에&gt; 4. 부드럽게 튜브를 혼합하고 18 시간 동안 45 ° C에서 품어. <ol><li> 배양의 첫 번째 시간 동안 부드럽게 튜브마다 15 분을 섞는다. 이 겔 조각을 조각 낼 수 있기 때문에, 강한 교반을 피하십시오. 잘 평형화 배양기 / 또는 오븐에서 가열 블록에서 반응을 수행한다. 겔 조각이 반응 용액으로 덮여 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 인큐베이터 또는 가열 블록으로부터 샘플 튜브를 제거하고 얼음에 배치하여 반응을 중지. NOTE : β-제거 반응이 18 시간 동안 진행시킨 후, 탈염 처리가 당일 내에서 수행되어야한다. </li></ol> 양이온 교환 크로마토 그래피 3. 탈염 <ol><li> 얼음 샘플 튜브를 유지하는 것은 과도한 열이 형성되지 않도록하면서 천천히 염기 중화 10 % 아세트산 (아세트산) 적가 하였다. 부드럽게 아세트산의 추가 사이의 샘플 튜브를 소용돌이. 천천히 산을 추가 할주의와 additi으로 현명한 드롭산에 거품의 &quot;화산&quot;을 생성합니다. 필요한 경우, 기포를 제거하고 유출을 방지하기 위해 튜브를 원심 분리기. <ol><li> 반응 혼합물에 나트륨의 다량을 제거하기 위해, 작은 양이온 교환 칼럼 (웩스 또는 AG-50W-X8 수지, H + 형)를 통해 반응 혼합물을 전달한다. </li><li> 1 M의 NaOH와 함께 양이온 교환 수지를 씻어 1 M HCl을 수지는 분석 등급의 경우에도, MS 분석을 방해 오염물을 제거하기 위해 사용 전에. </li><li> 1 M의 NaOH에 수지를 만끽하고 경사 분리하여 용액을 제거. 다음 1 M 염산을 추가, 물을 제거, 탈 이온수를 추가합니다. </li></ol></li><li> 수지 위의 액이 무색이 될 때까지이 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 5 % 아세트산에 탈 이온수 및 저장소와 청소 수지를 씻으십시오. </li><li> 작은 유리 칼럼, 스크래치하고 피펫 팁의 테이퍼는 대략 1cm 길이가되도록 세라믹 커터를 사용하여 유리 파스퇴르 피펫 팁을 끊어도. 글래스 울 플러그 떨어져 애타게 수지 베드를위한​​ 지원을 형성 팁쪽으로 밀어. 유리 테스트 튜브를 통해 클램프 또는 빨래와 장소 피펫 열을 고정합니다. </li><li> 1 ml의 메탄올 (메탄올) 및 3 ㎖의 5 % 아세트산으로 빈 피펫을 씻으십시오. 소용돌이 H + 웩스 AG50 또는 양이온 교환 수지 슬러리를 5 % 아세트산에 저장하고 파스퇴르 피펫 열에 1ml의 베드 볼륨을 생성하기 위해, 슬러리의 충분한 옮긴다. </li><li> 5 % 아세트산의 5 권을 사용하여 열을 씻어. 수지 입자의 외관 흐를 수지가 검출되는 경우에 열을 사용하지 않는 체크. </li><li> 새로운 나사 위에 유리 튜브 (16 × 125mm) 및로드 샘플을 통해 열을 놓습니다. 통한 유동을 수집하고 동일한 튜브에 5 % 아세트산 중 적어도 3 볼륨으로 글리 칸을 용출. </li><li> 파라 필름으로 관을 덮고 바늘로 작은 구멍을합니다. -80 ° C 또는 드라이 아이스에 샘플 튜브를 놓습니다. 동결되면, 동결 건조하여 샘플을 건조. -20 °에서 건조 된 물질을 저장사용할 때까지 C. </li></ol> 4. 붕산염 제거 <ol><li> 메탄올 10 % 아세트산을 준비합니다. 빙초산 10 mL를 취하여 메탄올 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 최대 6 개월 테플론 늘어선 모자와 유리 병에서이 시약을 보관하십시오. </li><li> 건조, 동결 건조 된 샘플 튜브와 소용돌이에 메탄올 10 % 아세트산 300 μL를 추가합니다. N 2 스트림에서 증발에 의한 결과 트리메틸 보레이트를 제거합니다. 참고 : 산성 조건에서 메탄올로 보레이트 염을 혼합 휘발성 화합물 인 트리메틸 보레이트를 생성합니다. </li><li> 37 ° C에서 N 2 스트림에서 건조. 4.2 단계에 설명 된대로 건조 후, 메탄올의 아세트산의 또 다른 나누어지는를 추가합니다. 질소 하에서 5 분 (N 2) 37 ° C에서 스트림 액체를 건조. <ol><li> 반복 재 부상 및 건조 적어도 3 회. 사용할 때까지 -20 ° C에서 건조 된 물질을 저장합니다. </li></ol></li></ol> 5. C18 정리 <ol><li> C18 카트리지 열 평형ACN의 세 권과 5 % 아세트산의 5 권을 사용 (크기 1 ml를, 100 mg의 수지). 온화한 포지티브 공기압의인가에 의해 평형화 용액의 통과를 가속화. </li><li> 탈염과 붕산염 무료 샘플 튜브에 5 % 아세트산 500 μL를 추가하고 소용돌이에 의해 용해. </li><li> 평형 C18 컬럼으로 재현 탁 샘플을로드하고 유리 스크류 캡 튜브 (13 × 100 ㎜)로 통해 흐름을 수집합니다. 용출 O 글리 칸 같은 튜브에 5 % 아세트산 3 ㎖와. </li><li> 튜브를 파라 필름 작은 바늘로 작은 구멍을 만들거나 튜브를 다루 느슨하게 밀폐 된 PTFE가 늘어선 캡을 사용하고, -80 ° C 또는 드라이 아이스에 샘플을 동결. 동결 건조하여 용매를 제거합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 건조 된 샘플을 저장합니다. </li></ol> 메틸화 6. 자료 준비 참고 : 강력한 메틸화를 달성의 NaOH를 슬러리 신선한을 준비하기 위해. 메틸화 반응에 사용되는 모든 유리 제품은 광범위하게 청소해야합니다. <ol><li> , 메틸화에 대한 기본 시약을 준비 깨끗한 유리 나사 탑 튜브 (13 × 100 mm)의 50 % NaOH를 400 μl를 추가합니다. 무수 메탄올와 소용돌이의 800 μl를 추가합니다. </li><li> 백색 침전물을 생성하기 위해 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)와 소용돌이 4㎖를 추가. </li><li> 침전물을 펠렛 1 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 피펫 버린다. 펠렛에 무수 DMSO의 추가 4 ML을 추가합니다. 소용돌이. </li><li> 단계를 반복 6.2 세 번이나 더 흰색 침전물이 형성 될 때까지 6.3 최소. </li><li> 3 ㎖ 무수 DMSO의 펠렛 기반을 녹여 부드럽게 깨끗한 파스퇴르 피펫으로 상하를 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> 이 저장 될 수있는 다음의 메틸화 반응에 즉시베이스를 사용한다. </li></ol> 출시 글리 칸의 7 메틸화 <ol><li> C18 정제 시료와 소용돌이 또는 재현 탁하는 초음파 처리에 무수 DMSO 200 μl를 추가합니다. </li><li> resusp 300 μl를 추가샘플에 종단 기본 슬러리 즉시 요오드 메탄 100 ㎕ (메이)를 추가합니다. 테플론 늘어선 모자와 튜브를 봉인하고 적극적으로 소용돌이에 의해 5 분간 섞는다. </li><li> , 메틸화 반응을 중지 얼음 소용돌이에 5 % 아세트산 2 ㎖를 추가합니다. 피펫 솔루션 위아래로 5 회 증발 된 Mel의 남은 양을 줄일 수 있습니다. 주 : 아세트산이 용액을 중화 메이의 제거 단계 파티션 중에 수상으로 황산 화 글리 칸의 추출 효율을 증가시킨다. </li><li> 디클로로 메탄 (DCM)와 소용돌이의 2 ML을 추가합니다. 실온에서 1 분 동안 600 XG에 원심 분리기 수성 및 유기 상을 분리한다. </li><li> 새로운 유리관 (13 × 100 ㎜)로 상부층 (메틸화 황산 화 글리 칸의 대부분을 포함 성상)을 전송. </li><li> 유기상와 소용돌이에 H 2 O 2 ㎖를 추가합니다. 600 XG 1 분 원심 분리기는 수성 및 유기 상을 분리하고, 전나무와이 두 번째 수상을 결합세인트 수상 (단계 7.5). </li><li> 반복 단계 7.6 및 7.5 세 번 이상하지만 이후의 파티션에서 얻어진 수성 상을 저장할 필요가 없다. </li><li> 바닥층 (유기상)로부터 가능한 한 많은 최종 상부 층 (성상)을 제거하고 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 별도의 새로운 유리관에 바닥층 (유기상)을 전송. </li><li> 42 ° C에서 N 2 스트림에서 유기상을 건조. </li><li> 사용할 때까지 -20 ° C에서 파​​라 필름과 관과 상점을 커버. </li></ol> 수성 단계에서 메틸화 황산염 O-글리 칸의 8 C18 정리 <ol><li> ACN의 세 권과 5 % 아세트산의 5 권과 C18 카트리지 열 평형. </li><li> 수집 단계 컬럼으로 7.5과 7.6에서 결합 수성 상을로드합니다. </li><li> 탈염을위한 H 2 O 10 mL로 컬럼을 세척 할 것. </li><li> 용출 메틸화 황산 2 mL를 새 유리 튜브에 O-글리 칸50 % ACN의. 큰 올리고당에 메틸화 황산 O-글리 칸의 회복을 향상시키기 위해 85 % ACN으로 추가 용출을 사용합니다. </li><li> 42 ° C에서 질소 기류 하에서 건조 용출액. </li><li> MS 분석 이전에 6개월에 -20 ° C의 최대의 건조물을 저장합니다. </li></ol> 메틸화 O-글리 칸의 9 질량 분석 <ol><li> 210 ° C의 온도에서 모세관 0.40-0.60 μL / 분의 주사기 유량 nanoelectrospray 소스를 사용하여 적절한 질량 분석기로 직접 주입함으로써 메틸화 O 글리 칸 분석. MS / MS 및 이온 트랩 악기의 MS N에서 CID에 의해 분열를 들어 30 ~ 40 %의 충돌 에너지를 적용합니다. </li><li> 음이온 모드의 재구성 메틸화 설페이트 O 글리 칸 메탄올 / 2- 프로판올 / 1- 프로판올 50 μL에 / 13 mM의 아세트산 암모늄 수용액 (16 : 3 : 3 : 2 부피비). 양이온 모드의 경우, 1 mM 염화나트륨 하이드로 50㎕의 중성 / O 시알 릴화 된 글리 칸을 메틸화 재구성메탄올 / 물 xide (1 : 1). </li><li> 개별 O-글리 칸 구조 13, 19, 21, 23의 특성을의 MSN 분석 Xcalibur 소프트웨어 패키지 버전 2.0의 총 이온 매핑 (TIM) 및 중립 손실 스캔 (NL 스캔) 기능을 사용합니다. </li></ol>

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M., Holst, O., Thomas-Oates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+profiling+of+O-linked+glycans+released+directly+from+glycoproteins+in+gels+using+in-gel+reductive+&#946;-elimination.">Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive &#946;-elimination.</a> Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).</li><li>Anumula, K. R., Taylor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+procedure+for+preparation+of+partially+methylated+alditol+acetates+from+glycoprotein+carbohydrates.">A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).</li><li>Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+developmental+elaboration+of+N-linked+glycan+complexity+in+the+Drosophila+melanogaster+embryo.">Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo.</a> J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).</li><li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Nomenclature+for+Carbohydrate+Fragmentations+in+Fab-Ms+Ms+Spectra+of+Glycoconjugates.">A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates.</a> Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR:+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li><li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry.">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li><li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+mucin+MG1+(MUC5B)+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse.">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li><li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans.">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope.">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li><li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+&#946;-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics.">In-gel &#946;-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

Combining in-gel reductive &#946;-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t...

글리코 실화는 유기체 생리학, 조직 병리학, 및 셀룰러 인식 1-3에 기여 필수적인 단백질 번역 후 변형이다. 분석, 당질의 주요 발전에도 불구하고, 특정 단백질에 글리 칸의 전체 다양성을 특징 짓는 특히 차 생물 소스에서 고립 된 단백질에, 매우 어려운 과제 남아있다. 그럼에도 불구하고, 당 단백질 글리 칸의 microheterogeneity 자주 다른 단백질과 기능의 상호 작용에 영향을 미친다. 따라서, 글리 칸 다양성의 특성화 세포 및 조직 당화 4,5의 생리적 중요성을 이해하는데 필수적이다. 조직의 생리 및 병태 생리, 강력한 민감하고 포괄적 인 glycomic 분석 기술에 당 단백질 글리코 실화의 기여를 이해하기 위해 점점 더 중요 해지고있다. 단백질체 분석에서 동정 된 단백질은 일반적으로 LC-MS에 의해 달성된다/ 트립신 펩티드 (6)의 MS 분석. 단백질 분해는 7-9의 트립신과 같은 프로테아제의 겔 소화 다음 SDS-PAGE에 의해 해결 정제 된 단백질 또는 단백질을 사용하여 수행 될 수있다. SDS-PAGE에 의해 단백질 혼합물의 예비 농축 단백질 ID의 깊이와 정확도를 향상시킨다. 당 단백질의 당화의 glycomic 분석을위한 유사한 전략의 개발은 당질의 최전선에있다. 글리 칸의 두 가지 주요 클래스는 N-O 결합 또는 쇄교 어느 통해 단백질 골격에 부착된다. N 연결된 글리 칸은 아스파라긴에 부착된다 아스파라긴 (Asn)에서 Asn-X-빼앗아 /의 Thr / Cys이고 정의 sequon의 일부로서 발견 잔기 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 임), 및 펩티드 - N과 효소 절단에 의해 해제 될 수있다 -glycanase (PNGaseF 또는 A), 하나 솔루션에서 젤, 또는 온 오점 10-12. O 연결 글리 칸은 주로 세린 (SER) 또는 트레오닌 (THR) 잔기에 부착된다. 그러나, 단지 하나의 효소 IDEN되었습니다당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출 할 수 있고, 그것은 단지 간단한 O 연결 글리 칸을 방출 극히 제한 글리 칸으로 발견 된 특이성을 갖는다. 화학 릴리스 전략은 당 단백질의 O 연결 글리 칸의 종합 릴리스에 대한 선택의 방법 남아있다. 환원성 또는 비 환원성 β-제거, 또는 하이드라진 잘 특성화 된 화학 분리 기법이며, 당 단백질 (13, 14)에서 O 연결 글리 칸을 해제하기위한 가장 널리 사용되는 방식은 현재. 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출하기 위해 사용되었지만, 이전 접근법은 15-17 후속 분석을 위해 HPLC 분리를 요구했다. 다차원 MS (MS N) 분석은 현재 대부분의 생물학적 소스에서 예상되는 금액에 고립 된 당 단백질에서 방출 된 글리 칸의 특성에 대한 구조적 데이터의 가장 부유 한 소스를 제공합니다. MS의 깊이기반 구조 특성이 크게 전에 그들의 분석 글리 칸을 방출 permethylating에 의해 촉진된다. 메틸화는 이온화를 개선하고 글리 칸 구조 (18, 19)의 넓은 범위에 걸쳐 몰 응답 신호를 등화시키는 경향이있다. 또한, 메틸화는 모호하여 구조적 해명 20-23 향상 특유 매스와 단자 및 치환 단당 잔기를 붙인다. 예를 들어, 산성 글리 칸은 MS에 의해 비 메틸화 종으로 감지 할 수 일반적으로 어렵다. 산성 글리 칸이 MS에 의해 마이너스 이온 모드에서 검출 될 수 있지만, 동일한 이온 모드에서 모두 산성 및 중성 글리 칸을 검출하는 것은 불가능하다. 글리 칸 메틸화의 큰 장점은 메틸화로 글리 칸의 단당류 치환체에 자유 수산기 (OH)가 모두 그들로서 검출하게 메틸기 (OCH 3 또는 SID), 따라서 시알 릴화 된 글리 칸의 전하를 중화로 캡핑 될 것이라는 것이다 중립 (아시아LO) 글리 칸. 그러나, sulfoglycans에 황산 부분의 수산기는 이온화를 억제하고 감도를 감소 음이온 전하의 보존 결과, 메틸화에 저항. 이 억제는 현재 황산 글리 칸 24 ~ 26의 높은 풍요 로움을 가지고 같은 점액과 같은 매우 복잡한 당 단백질의 포괄적 인 glycomic 분석을 방지 할 수 있습니다. 정화 황산 글리 칸 최근 보고서는 역 위상 정화 크로마토 그래피 및 MALDI 분석에 앞서 별도의 메틸화 글리 칸, 충전에 사용됩니다. 이 방법은 우리가 유기 상 분할보다 덜 엄격한 것으로 나타났습니다 용출 다른 이동상을 사용하여 황산 및 비 황산 글리 칸의 완전한 분리에 의존한다. 따라서, sulfoglycans의 검출 및 농축에 적합한 새로운 기술이 여기에 제시되어있다. 이러한 기술은 다음과 같은 물 성상 황산 화 글리 칸의 정량적 복구 할 수 : DCM (디클로로 메탄)일상적 당쇄 메틸화 반응 (27)의 끝에서 수행된다 추출. 또한이 MS 단편화 패턴을 단순화 중요한 메틸화 비 설페이트 화 글리 칸의 혼합물로부터 메틸화 sulfoglycans이 견고한 분리 병용 하전 종 풍부. 개선에 - 겔 O 연결된 글리 칸 분석을위한 포괄적 인 프로토콜은 제공됩니다. 개선 된 프로토콜은, 글리 칸 회복을 향상 MS 통해 얻어지는 N 메틸화 글리 칸의 분석 구조 정보를 증가시키고 생물학적 공급원으로부터 격리 필수 당 단백질에인가 sulfoglycomic 분석의 감도를 향상시킨다. 이 프로토콜은 전체 당 단백질 추출물 O 연결된 글리 칸 분석을 위해 또는 SDS-PAGE에 의해 해결 관심 특정 당 단백질의 의도와 세 실험 절차로 구성된다; A) 젤 청소, B)에서 - 겔 환원 β-제거, 및 C) 글리 칸 permethy만큼은. 목표는 생물학적 관심 (그림 1)의 기본 소스에서 수확 당 단백질에 대한 포괄적 인 O-연결 glycomic 데이터를 획득하는 것입니다. SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질 염색 관심 대역 절제되고 결과 겔 밴드를 작은 조각으로 분리된다 시각화된다. 겔 조각 탈색 및 겔 오염물 (도 2a)를 제거 에틸 아세테이트 세척을 실시한다. 글리 칸 릴리스에 - 겔 환원 β-제거 (그림 2B)에 의해 달성되고 발표 된 글리 칸은 메틸화된다. 수성 유기 추출 다음과 메틸화 정량적으로 떨어져 비 황산 중립 글리 칸 (그림 2C)에서 음이온 성 황산 글리 칸을 분할한다. 에 - 겔 수성 유기 추출 결합 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질의 소량에서 방출 O 연결 글리 칸과 sulfoglycans의 특성을 수 있습니다. 전략적 개요 summari입니다도 1 및 세부 데이빗은도 2에 도시되어있다. 또, 탈색 및 세척 겔 조각 부는 표준 LC-MS / MS 단백체 기술에 의해 단백질 ID를 위해 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:231px;">Water, deionized water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetic acid, Glacial</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td style="width:303px;">Certified ACS&#8805;99.7 w/w %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td style="width:303px;">BioUltra, &#8805;99.5% (T), Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>34972-1L-R</td>
			<td style="width:303px;">LC-MS CHROMASOLV, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>213462-25G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99%, Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Iodomethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99.5%,&#160; Step 6.&#160; Store at 4 &#176;C until use.&#160; Sit at room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Sodium hydroxide solution, 50% w/w</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>SS254-1</td>
			<td style="width:303px;">Certified, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dimethyl sulfoxide, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>276855-1L</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, &#8805;99.9%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, 99.8%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34856-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOL&#174;, for HPLC, &#8805;99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:231px;">Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200&#160;mesh</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>217506-500G</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">AG 50W-X8 Resin&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>142-1441</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase</td>
			<td style="width:155px;">JT Baker</td>
			<td>JT-7020-01</td>
			<td style="width:303px;">Step 5 and 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bio-Safe Coomassie Stain&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>161-0786</td>
			<td style="width:303px;">G-250, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Silver Stain Kit for Mass Spectrometry</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>24600</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-16</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-15</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81265</td>
			<td style="width:303px;">volume 500&#160;&#956;L, needle size 22 ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81165</td>
			<td style="width:303px;">volume 250&#160;&#956;L, needle size 22 ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81065</td>
			<td style="width:303px;">volume 100&#160;&#956;L, needle size 22s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80965</td>
			<td style="width:303px;">volume 50&#160;&#956;L, needle size 22s ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton Calibrated Syringes</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80300</td>
			<td style="width:303px;">volume 10&#160;&#956;L, needle size 26s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Petri Dish Glass 100mm x 15mm</td>
			<td style="width:155px;">GSC INTERNATIONAL INC</td>
			<td>1500-4</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bard-Parker Surgical Blades</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>371310</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Reacti-Therm Heating/Stirring Module</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>18870</td>
			<td style="width:303px;">Step 1, 4 and 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Heating Blocks</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>125D</td>
			<td style="width:303px;">Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>CLS3950</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fused Silica CutterTubing cutter</td>
			<td style="width:155px;">alltech</td>
			<td>3194</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Multi-tube vortexers&#160;</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>444-7063</td>
			<td style="width:303px;">Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lyophilizer 25EL Freezemobile</td>
			<td style="width:155px;">Virtis</td>
			<td>25EL</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>Clinical 50</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">LTQ Orbitrap Discovery</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

인 - 젤 환원 적 β-제거에 에틸 아세테이트 치료의 효과 이전 에 - 겔 환원 β-제거를 사용하여 점액 소에서 방출 메틸화 O 연결된 글리 칸 샘플의 대표적인 질량 스펙트럼은 그림 3과 같다. 겔 조각의 EtOAc로 세척 효과적으로 이후 MS 분석 (27)을 방해 SDS와 폴리 아크릴 오염 물질을 제거합니다. <i...

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Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

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Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

연구

화학

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry. This strategy is based on previous successful characterization of mercury-dicysteinyl complexes involving tripeptides by utilizing mass spectrometry among other techniques. Mercury(II) chloride and a dicysteinyl tetrapeptide were incubated in a degassed buffered medium at varying stoichiometric ratios. The complexes formed were subsequently analyzed on an electrospray mass spectrometer consisting of a hybrid linear ion- and orbi- trap mass analyzer. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) spectra were acquired in the positive mode and the observed peaks were then analyzed for distinct mercury isotopic distribution patterns and associated monoisotopic peak. This work demonstrates that an accurate stoichiometry of mercury and peptide in the complexes formed under specified electrospray ionization conditions can be determined by using high resolution ESI MS based on distinct mercury isotopic distribution patterns.

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

전자 분무 이온화 질량 분석에 의해 Dicysteinyl Tetrapeptides와 수은 (II)의 복합체 형성에 관한 연구

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

고 분해능 질량 분석을 결합 하는 보조 Nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간 호흡 분석

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

클러스터 유도 탈착/이온화 질량 분광법에 의한 표면에 대한 복잡한 분자 및 표면의 반응 분석

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

나노 물질에 의해 획득 된 단백질과 대사 산물 코로나특성화를위한 모세관 전기 전구 질량 분광법 접근법

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

질량 분광법에 의한 단백질 고차 구조를 연구하기 위한 디틸피로카보네이트와 공유 라벨링

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

질량 분광법을 사용하여 단일 뉴런의 RNA 변형 특성화

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...