이 프로토콜은 박테리아 글리코프%eptides의 식별을 간소화하여 연구원들이 새로운 글리코실화 사건과 균주 간의 글리코실화에 사용되는 글리칸의 차이를 식별할 수 있게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 비글리코실화 전문가가 박테리아 프로테옴 샘플에서 잠재적인 글리코실화 사건을 식별할 수 있게 한다는 것이다. 개방 검색은 글리코실화뿐만 아니라 다양한 변형의 확인에 사용될 수 있는 일반적으로 적용 가능한 접근법이며, 임의의 프로테옴 샘플에 적용될 수 있다.
STB-RPS 스톱 앤 고 추출 팁을 준비하려면 14게이지 무딘 바늘을 사용하여 50마이크로그램의 펩타이드 결합을 위해 47평방 밀리미터 STB-RPS 멤브레인에서 세 개의 STB-RPS 디스크를 절제합니다. 펩티드 양이 더 많으면 그에 따라 디스크 수를 늘리십시오. SDB-RPS 스테이지 팁을 사용하기 전에, 100% 아세토니트릴 150 마이크로리터를 첨가하고 원심분리에 의해 버퍼를 방사하거나 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 팁을 세척한다.
다음으로, 팁을 1%TFA를 함유하는 30%메탄올 150마이크로리터로 세척한 다음, 팁을 1%TFA를 함유하는 90%이소프로판올 150마이크로리터로 평형화시킨다. 평형화 후, 프로테옴 샘플을 원심분리 또는 주사기를 사용하여 STB-RPS 단계 팁 상에 로딩한다. 그런 다음 팁을 1 % TFA를 함유 한 90 % 이소프로판올 150 마이크로 리터로 씻은 다음 1 % TFA 150 마이크로 리터로 씻으십시오.
STB-RPS 단계 팁에서 펩티드를 용출시키려면, 단일 팁에 첨가된 5%수산화암모늄 및 80% 아세토니트릴의 150 마이크로리터를 사용하고 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 개별 튜브에서 용출된 샘플을 수집한다. 또는 원심분리를 통해 용출하는 경우 모든 단계 팁에 첨가 된 80 % 아세토 니트릴의 5 % 수산화 암모늄에서 150 마이크로 리터를 사용하고 깨끗한 플레이트에서 수집하십시오. 용출된 펩티드를 섭씨 25도에서 진공 원심분리하여 건조시킨다.
다음에, 글리코펩티드 샘플을 풍부하게하기 위해, 쯔비터이온성 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 또는 ZIC-HILIC, 스테이지 팁을 제조하였다. 14게이지 무딘 바늘을 사용하여 470평방밀리미터 C8 멤브레인에서 C8 디스크 하나를 절제하고 P-200 팁에 디스크를 포장하여 프릿을 만듭니다. 그런 다음, 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 프릿 상에 50% 아세토니트릴에 재현탁된 약 5밀리미터의 ZIC-HILIC 물질을 첨가한다.
팁을 사용하기 전에 수지를 20 베드 부피의 ZIC-HILIC 용출 버퍼로 평형화시키고 수지 위에 10 마이크로 리터의 부피를 남겨 두어 수지가 건조되지 않도록하십시오. 이어서, 20베드 부피의 ZIC-HILIC 준비 완충액으로 수지를 순차적으로 세척한 다음, 20층 부피의 ZIC-HILIC 로딩 또는 세척 완충액으로 세척한다. 다음에, 소화되고 건조된 펩티드를 ZIC-HILIC 로딩 완충액 중에 마이크로리터당 네 마이크로그램의 최종 농도로 재현탁시킨다.
샘플을 재현탁 시키려면 잠시 동안 소용돌이 치신 다음 섭씨 2000 배와 섭씨 25도에서 1 분 동안 회전시킵니다. 방사 후, 재현탁된 펩티드 샘플을 컨디셔닝된 ZIC-HILIC 컬럼 상에 로딩한 다음, 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가함으로써 ZIC-HILIC 로딩 버퍼의 20베드 부피로 컬럼을 세 번 세척한다. 마지막으로, 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 1.5 밀리리터 튜브에 20 베드 부피의 ZIC-HILIC 용출 완충액으로 글리코펩티드를 용출시킨 다음, 섭씨 25도에서 진공 원심분리하여 용리액을 건조시킨다.
LC-MS 분석을 위해, 버퍼 A*의 샘플을 마이크로리터당 하나의 마이크로그램의 최종 농도로 재현탁시킨 다음, 샘플을 MS에 결합된 HPLC-UPLC에 로딩하여 글리코펩티드의 분리 및 식별을 가능하게 한다. 결과 MS 데이터 수집을 모니터링하여 원하는 매개 변수로 데이터가 수집되고 있는지 확인합니다. 프로테옴 및 글리코펩티드가 풍부해진 샘플을 분석하려면 FragPipe를 열고 워크플로 탭을 클릭합니다.
워크플로 풀다운 메뉴에서 검색 열기 옵션을 선택하고 파일 추가를 클릭하여 검색할 데이터 파일을 FragPipe로 가져옵니다. 그런 다음 데이터베이스 탭을 클릭한 다음 다운로드를 클릭하여 UniProt 가입 번호를 사용하여 UniProt에서 프로테옴 데이터베이스를 다운로드하기 위한 다운로드 관리자를 시작합니다. 다운로드 관리자 내에서 디코이 및 오염 물질 추가 옵션을 클릭하여 디코이 및 오염 단백질을 이 데이터베이스에 통합합니다.
그런 다음 MSFragger 탭을 클릭 한 다음 피크 일치 상자 내에서 전구체 질량 공차를 기본 500 달톤에서 2, 000 달톤으로 늘려 큰 수정을 식별합니다. 실행 탭을 클릭하여 FragPipe의 출력 위치를 정의한 다음 실행 단추를 클릭하여 검색을 시작합니다. 고신뢰 글리코펩티드가 할당되면서, 글리코펩티드의 동정을 개선하기 위해 일반적으로 관찰되는 글리칸 관련 이온을 동정한다.
그런 다음 MSFragger 탭을 클릭하고 관찰된 글리칸의 결정된 델타 질량을 슬래시로 구분된 개별 질량이 있는 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 추가합니다. 그런 다음 이러한 글리칸의 글리칸 관련 단편 덩어리를 MSFragger의 글리코 / 불안정 모드 섹션에 추가하십시오. 마지막으로, 프로테오믹 연구와 관련된 모든 MS 데이터를 PRIDE 또는 MassIVE 저장소와 같은 중앙 집중식 프로테오믹 저장소에 업로드합니다.
Acinetobacter baumannii 균주 AB307-0294의 공개 검색은 648.25 및 692.28 달톤에 상응하는 두 개의 우세한 델타 질량을 밝혀냈다. ACICU 캡슐은 843.31 달톤의 예측된 질량에 상응하는 사당류 K 단위로 구성되는 것으로 알려져 있다. 이 캡슐 구조는 ACICU 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 델타 질량과 일치한다.
균주 D1279779의 공개 검색 분석은 203.08, 794.31 및 1588.62 달톤과 일치하는 다중 델타 질량의 존재를 밝혀냈다. 인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기를 사용하여, 세 개의 A.baumannii 균주에 걸쳐 확인된 글리코펩티드가 잠재적인 글리칸-관련 이온을 드러내는 것으로 평가되었다. 글리칸 중심의 검색은 세 가지 A.baumannii 균주 모두에서 확인 된 글리코 펩타이드 / 펩티드 스펙트럼 일치의 총 수가 눈에 띄게 증가했으며, 이는 ACICU의 37 % 증가, AB307-0294의 117 % 증가, D1279779의 363 % 증가에 해당합니다.
개별 MS 이벤트의 경우, 글리칸 특이적 정보의 포함은 전형적으로 관찰된 하이퍼스코어를 증가시키지만, 이러한 증가는 고도로 글리칸 의존적이다. ZIC-HILIC 농축을 수행 할 때 용매의 손실로 인해 글리코 펩타이드의 분리가 손상 될 수 있으므로 수지가 항상 젖은 상태로 유지되도록하십시오. 글리코실화의 차이에 대한 데이터는 돌연변이유발 연구를 알리거나 글리칸 생합성을 담당하는 유전자 클래스를 확인하는 데 사용될 수 있다.
개방형 데이터베이스 검색을 사용하여, 우리는 박테리아 유전자에 걸쳐 글리칸 다양성을 특성화하기 시작했습니다. 이것은 박테리아 글리코실화가 우리가 생각했던 것보다 더 흔하고 훨씬 다양하다는 것을 보여주었습니다.
