The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

참고 : 본 연구에서 수행되는 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 발 패드를 문신 사용하여 마우스 1. 장기 식별 <ol><li> 실험에 직면 발 패드 (발바닥 표면)과 발을 고정. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 발바닥을 잡아. 발을 끼지 않도록주의하십시오. 주 : 안정 고정화 문신 안료 발 패드의 진피 내로 배치되도록하는 것이 중요하고, 따라서 영구 7이다. </li><li> 거즈 스폰지 또는 면봉에 70 % 에탄올로 발 패드를 면봉. </li><li> 면봉에 스킨 오일을 적용하고 부드럽게 발 패드 차례의 표면에 대한 팁을 누릅니다. 피부 오일의 소량만을 사용; 존재하는 경우 다량으로, 그것은 피부에 도달하는 문신 안료를 방지 할 것이다. </li><li> 직전 문신 잉크로 문신 바늘의 팁을 찍어문신에. 통증 및 감염의 가능성을 감소하고, 또한 문신 효율을 높이기 위해, 깨끗하고 선명한 무균 문신 바늘을 사용한다. </li><li> 발 패드 표면은 피부의 기름으로 덮여 있지만, 발 패드의 중앙에 수직으로 피부에 가볍게 문신 바늘 팁을 누르고, 여러 번 잉크를 분사. 전기 문신 시스템에 대한 자세한 내용은 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> 부드럽게, 거즈 스폰지에 70 % 에탄올 스프레이 피부 표면에 여분의 문신 색소를 제거하는 발에 대해 그것을 누르고, 문신의 품질을 검사합니다. 발 패드의 중간 정상 피부 착색과 다른 어두운 둥근 반점을 가지고 있는지 확인하십시오. 문신 어둡거나 쉽게 볼 충분하지 않은 경우, 종래 문신 단계를 반복한다. </li></ol> 고속 PCR 유전자형 키트를 사용하여 2. 유전자형 신생아 마우스 <ol><li> 70 % 에탄올 마우스 꼬리의 말단부 소독 꼬리 5mm 이하 잘라팁 및 PCR에 사용 된 형태의 8 튜브 스트립의 튜브에 옮긴다. 시편 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 강아지 미사용 면도날을 사용한다. 대안 적으로, 가위를 사용하지만,이 경우에는, 빠짐없이주의 70 % 에탄올을 사용하여 블레이드의 나머지 조직을 제거. 출혈을 확인합니다. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지, 거즈 스폰지로 꼬리의 절단 부분에 압력을 적용합니다. </li><li> 표본을 포함하는 각 PCR 튜브에 DNA 추출 용액 200 μl를 추가합니다. 키트에 대한 조성 및 정보 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> PCR 서멀 사이 클러로 튜브 스트립을 배치하고, 다음 프로그램을 이용하여 DNA 추출을 시작하는 1 사이클을 55 ° C에서 10 분, 10 분 동안 95 ° C에서 1주기, 4 ℃에서 들고. 주 :이 나중에 PCR에 사용 된 것과 동일한 PCR 서열 증폭기이다. </li><li> DNA 추출이 완료되면, 유전자 증폭기의 튜브로부터 스트립을 제거차 5 번 반전. </li><li> 미사용 8 튜브 스트립의 튜브 및 혼합 각 시편의 전송 솔루션 (DNA 추출물)의 4 μL : 2X PCR 준비 믹스 II의 10 μL, 앞으로 및 역방향 프라이머를 혼합 2 μL (에 권장 0.5 μM, 각 시료에 대한 핵산 분해 효소가없는 H 2 O의 시퀀스 재료 / 장비의 표 참조), 4 μL. 탁상 형 원심 분리기를 사용하여 스핀 짧게 (예를 들어, 3 초). 처리하는 경우를 제외하고는 항상 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 열 순환을 수행합니다. 참조 열 프로그램에 대한 재료 / 장비의 표. </li><li> 증폭 된 DNA의 제품을 감지합니다. 직접 아가 로스 젤의 우물에 PCR (20 μL)에서 총 반응 액을 넣습니다. 별도의 우물에 분자량 마커를로드합니다. 전기장을 적용합니다. </li><li> 자외선 아래 밴드의 형광 이미지를 획득. </li></ol> 마우스 뇌 신경 세포의 3 차 문화폐해 세포층에의 참고 : 뇌 해부 및 세포 해리 (3.1)에 대한 절차는 모든 후속 절차에 공통입니다. 마우스 아교 세포 배양을위한 절차 (3.2), 쥐 아교 세포 배양 (3.3), 마우스의 연결을 문화 (3.4) 이후에 별도​​로 설명되어 있습니다. <ol><li> 뇌 해부 및 세포 Dissocaiation <ol><li> 신속하게 뇌를 제거하고 행크스 &#39;솔루션으로 배치, 잘린 하나의 마우스 또는 쥐 새끼를 희생 (조성은 표 1 참조) + 20 % (얼음에 보관) 35mm 접시에 소 태아 혈청 (FBS). </li><li> 두 개의 반구로 중간 선을 통해 뇌를 잘라. 뇌의 각 반구에서 관심 영역 (예를 들어, 대뇌 피질, 선조체 (striatum)와 해마)를 제거합니다. 표면의 수막 및 주요 혈관을 제거합니다. 수술 블레이드를 사용하여 4-10 얇은 조각으로 뇌 영역을 잘라. </li><li> 재치되면, 15 ML의 원심 분리 관에 뇌 조각을 씻어시간 행크스 &#39;솔루션 + 20 % FBS, 행크스와 다음 3 회&#39;(혈청이없는 즉,) 솔루션 (4 ° C에서). 린스 5-10 ml의 용액을 추가 슬라이스 튜브 바닥에 침전 뇌, 위에서 용액을 흡인하도록하고 신선한 용액을 첨가한다. 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 마칩니다. </li><li> 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 사용 트립신 - 함유 소화 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 여과하고 뇌 조각을 함유하는 튜브에 직접 여액을 추가한다. 트립신은 실온에서 13 분 동안 진행하자. </li><li> 그것의 대부분을 흡입하여 다음 7 ~ 10 ml의 행크스 &#39;솔루션 + 20 % FBS (4 ° C)의 추가하여 먼저 트립신 용액을 중화. </li><li> 행크스 두 번, 뇌 조각을 씻어 &#39;솔루션 + 20 % FBS 및 행크스와 3 회&#39;솔루션 (즉, 혈청없이) (4 ° C에서). 오디오 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 완료이온. </li><li> 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 이용하여 해리 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 필터링 및 뇌 슬라이스 튜브에 직접 여액을 추가한다. </li><li> 기계적으로 보이는 조직 조각이 사라질 때까지 부드럽게, 10 ~ 20 시간을 분쇄하여하여 세포를 떼어 놓다. 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 분쇄하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 작은 조각이 정착을 위해 3 분을 기다립니다. </li><li> 용액의 대부분을 이동시켜 (~ 1.5 ㎖, 하단 일부 용액을 떠나)을 사용하여, 3 ㎖ 행크 용액 + 20 % FBS 용액 (39 °의 C)를 포함하는 15 ml의 원심 분리 튜브에 목화 꽂혀, 방화 광택 파스퇴르 피펫. 맨 아래에있는 퇴적물의 포함은 일반적으로 문화의 저하를 초래하기 때문에 모든 솔루션을 전송하지 마십시오. </li><li> 4 ° C에서 ~ 185g (~ 1,100 RPM)에서 13 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음,추가 1 ml의 미리 예열 펠릿 중간 (37 ° C)을 도금, 부드럽게 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 여러 번 피펫 팅하여 재현 탁. 주 : 매체 도금 세 종류의 다른 배양 목적에 사용된다 : 마우스 뉴런 배지 -2- 도금, 마우스 신경교 세포 용 배지 -1- 도금 및 래트 뉴런 및 신경교 세포 배지 -3- 도금 (조성물은 표 1을 참조) . </li><li> 또는 자동 혈구 세포 계수기를 사용하여, 세포 현탁액 10㎕를 꺼내 0.4 % 트리 판 블루 용액 10 μL와 혼합하고, 생균의 밀도를 측정한다. </li></ol></li><li> 마우스 폐해 문화 <ol><li> 마우스 세포의 건강한 문화를 확립하는 데 도움이 된 커버를 세척 할 것. <ol><li> 유리 페트리 접시에서 70 % 질산에 커버 글라스 (원형, 12mm 직경)을 담근다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하고, 진탕 기의 O / N에 놓습니다. </li><li> 유리 coversli을 씻어증류수로 페트리 접시에서 PS 세 번 이상. 증류 된 물에 담가. 진탕 O를 /의 N에 접시를 놓습니다. </li><li> 생물 안전 캐비닛 와트 150mm 필터 종이에 커버 슬립을 건조. </li><li> 커버 슬립을 압력솥. </li><li> 24 웰 배양 접시로 된 커버를 놓습니다. </li></ol></li><li> 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐. </li><li> 3.1 단계에 따라, 마우스 새끼의 뇌 세포를 얻습니다. 참고 : 대뇌 피질의 사용은 마우스 아교 세포층을 준비하기위한 전형이다. 그러나, 해마 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 조정 후 적절한 작동 할 것이다. </li><li> 미리 예열 최종 세포 현탁액 중간-1 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖). 사전 온난화 문화 미디어의 경우, 문화 인큐베이터에서 솔루션 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C) O / N,에 배치온도와 산도 값이 안정 될 수 있도록. </li><li> 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다. </li><li> 시험 관내 (DIV)에서 일일에서 두 번 도금와 T25 플라스크에서 배양 된 세포를 씻어 매체-1 (4 ° C). 인큐베이터로 플라스크를 놓습니다. 소용돌이 모션에서 여러 번 새로운 배지의 ~ 5 mL를 추가, 완전히 파스퇴르 피펫, 플라스크 내부 매체를 흡입 조심스럽게 플라스크를 기울여 세척 수행합니다. </li><li> 6-9 DIV에서 (즉, 하나의 트립신 전날과 3.2.8-3.2.13 단계에서, 된 커버에 도금), (세포 외 기질 단백질로 코팅 재료의 100 μl를 배치에 대한 의견을 재료 / 장비의 표를 참조 코팅 배양 접시에서 커버 글라스에 재료), 그리고 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. </li><li> DIV 7-10에서, 세포를 20-4 때0 % 합류 (공간적으로 연속)는 이들을를 Trypsinize. <ol><li> 플라스크 내의 모든 솔루션을 흡입하고 ~ 행크스 &#39;솔루션 (4 ° C)의 13 ml에 추가하여, 한 번 플라스크를 씻어 부드럽게 소용돌이 치는 동작으로 플라스크를 여러 번 기울 완전히 솔루션을 대기음. </li><li> 4 ml의 트립신 EDTA 용액에 DNase의 용액 (최종 농도 750 단위 / ㎖)의 40 μL를 추가 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 용액을 통과하고, 플라스크 내의 세포에 직접 여액을 추가한다. </li><li> 트립신은 인큐베이터에서 37 ° C에서 13 분 동안 진행하자. </li><li> 플라스크에 100 % FBS (39 ° C) 2 ㎖을 첨가함으로써 트립신을 중화 용액. </li><li> 행크스 &#39;솔루션 + 20 %의 FBS (4 ° C)에서 원심 분리기 ~ 4를 가하여 5 ~ 10 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ㎖의 원심 분리 튜브에 트립신 세포로 이동 ~ 185g, 13 분 동안 4 ° C 상층 액을 대기음. </li></ol></li><li> 사전 warme 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁D 도금 매체-1. </li><li> 단계 3.1.13에 따른 세포의 밀도를 측정한다. </li><li> 커버 슬립에 재현 탁 ~ 신경교 세​​포의 50 μL를 도포 커버 글라스 완전히 재료 및 기음 플레이트. 참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다. </li><li> 인큐베이터 된 커버와 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 20 ~ 60 분 후, 미리 예열이 잘 각 매체-1 도금 1 ㎖를 추가하고 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 주 : 도금 배지 첨가 동안, 커버 슬립이 배지에서 부유하지 않도록, (어떠한 도금 세포가없는) 커버 슬립의 주연을 눌러 다른 피펫을 사용하는 것이 도움이 될 것이다. </li><li> (유리 커버 슬립에서 예) 폐해 세포층 1 DIV에서 1 ml의 배지를 교체 미리 예열 도금 중간 1 웰 모든 용액을 흡입 한 다음 신선한 배지로 채워서. </li><li> 아교 세포층의 2-3 DIV에서 때 CEL각 웰에 따라서 DNA 복제 및 행을 억제하기 위해, LS는 유사 분열 억제제 (81.2 및 204.8 μM의 최종 농도 각각 5- 플루오로 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 + 우리 딘의 혼합물을 10 μL)을 추가 80-100 %의 합류 아르 신경교 세​​포 증식을 억제. </li><li> 세포 90-100 %의 컨 플루 언트 (폐해 세포층에 뉴런 도금 전 1-2 시간) 7-9 DIV 경우에서와 배지를 교체 미리 예열 도금 중간이 (37 ° C). 주 : 뉴런 단계 3.4를 사용하여, 같은 날에 플레이 팅한다. </li></ol></li><li> 쥐 폐해 문화 <ol><li> 코트 같은 도료와 T25 플라스크 배양. 주 :이 단계 3.3.5 비 부착 세포의 제거 이후에​​ 필요하다. <ol><li> 플라스크에 코팅 재료의 2.0 ML을 추가하고, 문화 인큐베이터에서 플라스크를 배치합니다. </li><li> 2-3 시간 후, 플라스크의 바닥 건조가되도록 완전히 도료 대기음. </li></ol></li><li> 세포를 얻기래트 새끼로부터 3.1 단계에있어서. 주 : 해마 CA1-CA3 영역 래트 신경아 피더 층의 제조에 사용된다. 그러나, 대뇌 피질 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 차이를 보정 한 후에 작동 할 것이다. </li><li> 미리 예열 최종 세포 현탁액에 중간 3 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖). </li><li> 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C)에서 플라스크를 놓습니다. </li><li> 2-3 DIV에서 세포 20-40 %의 컨 플루 언트 될 때, 단단히 뚜껑을 닫은 플라스크를 흔들어, 미부착 된 또는 약하게 부착 세포를 제거 격렬 ~ 10 배, 용액을 흡인하고, 도금 4-5 mL를 넣은 매체-3 (4 ° C에서). 한 번이 절차를 반복합니다. 예를 들어 (전체 플라스크 바닥에서 배양 된 세포를 검사,완전히 제거된다) 전지 본체의 외부 테두리가 위상 밝다 해당되는 즉 신경을 (나타날 것과 확인하는 위상차 현미경)을 사용. 이러한 세포를 제거하고 인큐베이터에 플라스크를 반환 할 필요 시마다 절차를 반복합니다. 참고 : 강도와 개별 실험자 다를 수 있습니다 필요한 &#39;쉐이크&#39;의 총 수. 중요한 것은 일련 번호 쉐이크의 총 수를 유지하는 것이 아니라 신경 세포 유사 세포를 제거하는 것을 확인하기 위해이 아니다. </li><li> 6-8 DIV에서, 세포 90-100 %의 합류 통로 단계 3.2.8에서 그들을 trypsinizing으로 아교 세포를 때. </li><li> 원심 분리 후, 코팅되지 않은 T75 플라스크에 트립신으로 세포를 전송 매체-3 (39 ° C)를 도금의 10 mL를 넣어 배양 이들을 매체에서는-3 (39 ° C)을 도금 한 ㎖에 펠렛을 재현 탁 인큐베이터. 참고 : 쥐 신경 교세포 두 번 계대됩니다; 대조 마우스 아교 세포는 아칸소그들은 여러 통로 후 건강에 해로운 될 수 있기 때문에 전자는 한 번만 계대. 쥐 신경교 세​​포는 임의의 코팅 재료로 코팅되지 않은 T75 플라스크에서 계대 배양된다. 코팅은 쥐 아교 세포가 너무 빨리 성장하고 나중에 신경 세포의 배양 조건을 저하됩니다 많은 섬 모세포 (추정 뇌실막 세포)를 얻을 수 있습니다. </li><li> 플라스크에 아교 문화의 17-19 DIV에서 (즉, 십일일 계대 및 트립신 하루 전날과 3.3.9-3.3.14 단계로 된 커버에 도금 후), (씻지 않은 커버 글라스에 코팅 재료의 100 μl를 배치 라운드, 12mm 직경) 배양 접시에서 배양 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. 참고 : 쥐 아교 세포 배양를 들어, 차이가 있거나 된 커버를 세척하지 않고 배양 결과에 발견되지 않았습니다. </li><li> 플라스크에 아교 문화의 18-20 DIV에서 (즉, 계대 후 12 일), 세인트에 따르면, 배양 된 세포를 trypsinizing하여 아교 세포층을 준비EP 3.2.8. </li><li> 원심 동안, 커버 글라스에서 완전히 도료 대기음. </li><li> 원심 분리 후, 단계 3.1.13 항에있어서, 중간 3 (39 ° C)를 1 ml의 도금에 펠렛을 재현 탁하고, 세포 밀도를 측정한다. </li><li> 라이브 104 세포 / ml로 폐해 농도를 조정하고 피복 된 유리 커버 슬립에 아교 세포 현탁액 100 μl를 접시. 참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다. </li><li> 20 ~ 60 분 동안 인큐베이터로 된 커버와 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 중간 3 (4 ° C)을 도금 한 ML을 추가하고, 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 커버 슬립에 세포 40-80% 합류 때 폐해 세포층 3-4 DIV에서, 상기 예열 된 증식 배지 1 ㎖를 추가 (시토신 β-D 아라 비노 푸라 노 시드를 포함하는 (조성물은 표 1을 참조) ARAÇ, 4 μM의 최종 농도)는 아교 세포 증식을 정지합니다. 플레이트 신경신경교 세​​포층의 7-9 DIV들에서 세포를 이용하여 단계 3.4 60-80 % 컨 플루 언트 (confluent) 상태 인 경우. </li></ol></li><li> 마우스의 연결을 문화 <ol><li> 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐. </li><li> 단계 3.1 마우스 새끼를 사용합니다. </li><li> 살아있는 세포 현탁액의 농도를 조절하기 ~하여 2.0 × 105 세포 / ml 미리 예열 매체 -2- 마우스 신경교 세포 도금, 또는 사용하는 금도금 매체 -3- 래트 신경교 세포상의 도금. </li><li> 부드럽게 각각의 배지에 균체 현탁액을 첨가하여 웰, 신경교 피더 레이어 상에 세포를 접시. 주의 : 첨가되는 세포 현탁액의 부피는 웰 배양 세포의 목표 수에 의해 결정된다. 예를 들면, 플레이트는 ~ 세포 현탁액 60 μL은 / 웰 12,000 세포를 달성했다. </li><li> 뉴런은 도금 후 해결책 변경이 필요하지 않습니다. 문화의 과정을 통해, 내부 O를 가습하여 우물에서 솔루션의 증발을 방지하기 위해주의문화 인큐베이터 바. </li></ol></li></ol>

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

The protocol presented here includes procedures for tattooing to label/identify mice, for genotyping mice from tail tips, and for culturing mouse brain neurons at low density. In one round of experiments using 6-8 pups, these procedures typically require ~0.5 hr, ~4 hr and ~2 hr, respectively, at a total of 6-7 hr. This makes it practical for a single experimenter to complete all the procedures necessary from the time of the pups&#39; birth to the plating of neuronal cultures &#8211; in less than a single working day (wi...

유전병의 설치류 모델은 정상 단백질과 핵산뿐만 아니라, 이들의 결함의 병태 생리 학적 결과의 생리 기능을 확립하는데 유용 입증되었다. 예로는 주요 세포 기능에 관여하는 단백질 결핍 마우스뿐만 아니라 알츠하이머 질환과 같은 질환의 마우스 모델을 포함한다. 그러나, 특정 유전자 조작 곧 신생아 치사 또는 출생 후 몇 일이 발생할 수 있습니다. 이 경우, 일차 세포 배양 생균 사망 전 배아 또는 신생아 새끼로부터 획득 될 수 있기 때문에 중요한 도구들은 시험 관내에서의 적어도 몇 주 동안 유지 될 수 있으며,이 시간 동안 초기 신경 발달은 다음 수 생화학 적 기능과 형태 학적 실험. 차 배양 들어, 저밀도 뉴런 판형 것이 유익 할 수있다; 이것은 개별 세포체, 수상 돌기 축삭 통로 및 신경 TERMI을 시각화하는 것을 가능하게높은 공간 해상도 NALS. 그러나, 낮은 밀도에서 뉴런의 생존과 분화는 일반적으로 그들이 신경교 영양 세포층에 플레이 팅되는 것을 필요로 공 배양 한 신경교 의해 컨디셔닝 물리적 그들과 접촉, 또는 배지에서의 부재와 신경 교세포. 아교 세포층에 저밀도의 연결을 문화의 설립은 사전에 신속하고 신뢰할 수 유전자형에 종속 될 수 있습니다 - 몇 일에 대비 몇 시간 내에. 신경 유전자형 미리 준비된 신경교 세​​포층의 것과 일치해야 할 때 속도는 특히 중요하다. 더 구체적인 예로서, 그 유전자형이 새끼 실험의 효율을 최적화하기 위해, 생성 배양에 사용할 것인지를 결정하는 것이 필요할 수있다. 여기에서 우리는 이전의 출판물 2-6, 빠르고 간단하고 신뢰할 수있는 마우스 유전자형에 사용 된 작업 프로토콜을 보여줍니다. 마우스 꼬리와시중에서 판매하는 키트가 사용된다. 이 프로토콜은 조직으로부터의 단일 핵산 추출 단계를 포함하고, ( &#39;정지 용액&#39;), 핵산 정제 공정이나 종단 버퍼의 이용도를 필요로한다. 유전자형이 방법의 신뢰성은 차이 시험편의 개시 량, 동물의 연령 및 PCR 증폭 산물의 길이에 대하여 소개하는 경우 일련의 테스트의 결과를 제시하여 설명한다. 이 키트는 자동 추출 및 신뢰성의 이점을 제공한다. 포괄적 인 위해, 유전자형 생쥐의 장기 식별 문신의 용도도 설명된다. 문신 (표피 하) 피부의 진피 문신 잉크를 적용함으로써 달성된다 7. 절차가 이러한 꼬리 문신 발가락 등 신체의 다른 부분에 적용 할 수 있지만, 신생아 또는 1 일된 쥐의 발바닥 문신에 기술되고,하기 ANIM모든 연령의 루게릭 병. 또한 절차는 신경교 세포층 2,8의 다른 유형의 최적화에 기초하여 제조, 저농도 마우스 뉴런 도금 및 배양 입증 될 것이다. (; p.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 유전자 TOR1A의 돌연변이에 의해 발생하는 상 염색체 지배적 인 운동 장애 - 우리는 상속 된 신경 학적 장애 DYT1의 근육 긴장의 유전 마우스 모델을 사용하고 있습니다. 단백질 전개, 단백질 복잡한 분해, 막 인신 매매 및 소포 융합 : 인코딩 된 단백질, torsinA는, 누구의 회원 일반적으로, 보호자와 같은 기능을 수행에서 지원 (단 +) 단백질의 가족, &quot;다양한 세포 활동과 연관 -ATPase를&quot;에 속하는 10-13. 돌연변이 글루탐산에 대한 코돈의에서 프레임 삭제하고 따라서 &#39;조기 발병 일반화 고립 된 근육 긴장 이상&#39;14, 15의 발현으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 경로이 질환에 대한 책임 ophysiological 메커니즘을 제대로 이해 남아있다. 녹아웃 마우스 모델에서, 돌연변이 대립 유전자 Tor1a ΔE로 이하 언급 Tor1a tm2Wtd이다. 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 DYT1의 근육 긴장 이상으로 실행 가능하고 유 전적으로 모방 인간의 환자이며, 반면에 동형 접합 노크에 쥐가 유전 적 배경 (18)에 의해 영향을받는 출생 후 사망에 대기 시간, 출생 16, 17 후 죽는다. 동형 접합 노크에서 마우스의 조기 사망은 동물의 유전자형과의 연결을 문화의 설립이 모두 빠르게 완료되었는지 필요로한다. 유전자형의 다른 예로서, Tfap2a (전사 인자는 AP-2α, 인핸서 2α 단백질 결합을 활성화하는) 사용될 것이다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 증식, 분화, 생존 및 사멸 (19) 같은 다수의 세포 과정을 조절하는 것이 중요하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS - tattooing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Cleanser</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NMCR3</td>
			<td>This is used to clean the needles and the holder after tattooing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Drying Agent</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NDAR4</td>
			<td>This is used to dry the needles and holder after cleaning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Tattoo Black Pigment</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NBP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep Applicator</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSPA1</td>
			<td>Q-tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep solution</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSP01</td>
			<td>This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage &#8211; the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing &#8211; softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - genotyping</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Ready Mix II</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution A</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution B</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH 3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td>
			<td>rpi</td>
			<td>A20090-500&#160;</td>
			<td>We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 &#181;g/ml gel volume).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG104-96RS&#160;</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2020-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2812-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1001</td>
			<td>We use either of these three molecular weight markers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, Ultraflux Individual&#160;</td>
			<td>rpi</td>
			<td>145660</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>rpi</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tor1a gene in &#916;E-torsinA knock-in mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3&#39; (forward) and 5&#39;-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3&#39; (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/&#181;l (~0.16 &#181;M) (reference 2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3&#39; (forward), 5&#39;-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3&#39; (reverse) for the 498-bp amplicon, 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3&#39; (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3&#39; (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>See comments section of uridine for more information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, polypropylene, 15 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess (cell number counter) chamber slides</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6645-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish, Petri glass 100 x 15 mm</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>15230-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527-200KU</td>
			<td>Stock solution is prepared at 1500 units/20 &#956;l = 75000 units/ml in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10569-010, 500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09&#8211;0.12 mm, No. 0</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>633017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387-10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-100 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4&#8226;(7H2O), BioUltra, &#8805;99.5% (Fluka)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20&#176;C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4&#176;C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>bdh 3044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS (Neuronal Supplement) 21&#160;</td>
			<td>prepared in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Source: reference 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 5 &#190;&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>Use this cotton-plugged 5 &#190;&#8221; Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 9&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 2 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 25 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 50 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480878-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#8226;(7H2O)), &#8805;99.99%, Aldrich</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431478-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, SigmaUltra, &#8805;99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, sterile, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin, Holo, bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain, 0.4%</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, type XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1005-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution, 0.25%&#160;</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - immunocytochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons

포유류 신경 세포의 형태와 기능의 고해상도 분석은 종종 뉴런의 일차 배양 분석 하였다 개별 동물의 유전자형을 필요로한다. 유전자형되는 신생아 마우스, 빠른 유전자형 레이블, 이러한 마우스의 뇌 신경 세포의 저밀도 문화를 확립 : 우리는 절차의 집합을 설명합니다. 개별 마우스는 성인이 지속되는 장기 식별 할 수 있습니다 문신에 의해 표시되어 있습니다. 설명 프로토콜에 의한 유전자형 빠르고 효율적이며, 좋은 안정성과 핵산 자동 추출 할 수 있습니다. 이 신생아 치사 고통 생쥐에서, 예를 들어 기존의 유전자형 충분한 시간을 사용할 수없는 상황에서 유용합니다. 기본의 연결을 문화가 높은 공간 해상도 이미징 실험을 가능하게 낮은 밀도에서 생성됩니다. 이 배양법 종래 신경 교세포 도금 세포층의 제조를 필요로한다. Protocol은 운동 장애 DYT1 된 근긴장 (ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐)의 마우스 모델에 전체적으로 도포하고, 신경 세포 배양은 이들 마우스의 해마, 대뇌 피질 및 선조체로부터 제조된다. 이 프로토콜은 다른 종의 동물뿐만 아니라, 다른 유전 적 돌연변이 마우스에 적용 할 수있다. 또한, 프로토콜의 개별 구성 요소는 격리 된 서브 프로젝트를 위해 사용될 수있다. 따라서이 프로토콜은 신경 과학뿐만 아니라 생물학 및 의료 과학의 다른 분야에서뿐만 아니라 다양한 응용 프로그램을해야합니다.

이 프로토콜의 적용 예를 들어, 대표적인 결과는 다양한 실험 조건 하에서 문신, 신뢰할 수있는 유전자형으로 마우스를 라벨 및 아교 피더 레이어에 기본의 연결을 문화를 확립 표시됩니다. 문신 신생아 새끼 (그림 1에서 &#39;신생아&#39;) 문신 시스템을 사용하여 발바닥에 표시 하였다. 라벨 3 주에서 명확하게 볼 남아 ( &#39;3 주?...

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Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K 조회수.  University of Iowa Carver College of Medicine.  우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다. 

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

작은 동물의 만성 신경 레코딩을위한 초경량 동력 Microdrive의 설계 및 조립

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 기록하는 다중 섬유 광도 측정법

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...