Edgar 및 Linington 연구소 구성원, 특히 Chris Linington 교수, Diana Arseni 박사 및 Katja Muecklisch 박사에게 이러한 문화를 설정하는 동안 문화에 대한 조언, 유용한 의견 및 지원에 감사드립니다. Cell Profiler 파이프라인의 시작점을 제공한 Dr Muecklisch에게 특별한 감사를 전합니다. 이 작업은 MS Society (보조금 122)와 Yuri and Lorna Chernajovsky 재단의 지원을 받았습니다. JC 및 MP에 대한 글래스고 대학교 자금 지원; 및 Wellcome Trust(217093/Z/19/Z) 및 Medical Research Council(MRV0109721)을 GJG에 제공합니다.

모든 동물 실험은 동물 사용에 대한 현지 법률 및 지침을 준수했으며 글래스고 대학의 지역 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 영국 내무부 프로젝트 라이센스의 후원하에 1986년 영국 동물 과학 절차법에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되었습니다. 이 연구에서는 사내에서 사육된 성인 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 젊은 여성 (8-12 주)의 사용은 임신 성공률이 높기 때문에 권장됩니다. 수컷은 여러 차례의 번식에 재사용 할 수 있습니다. 그림 1 은 혼합된 뉴런 및 신경교 배양을 생성하는 설명된 방법의 개략도를 나타냅니다.
1. 조직 배양 소모품의 제조
<ol><li>Class 2 안전 캐비닛 내부에 현미경 커버슬립이 들어 있는 접시 및/또는 접시를 준비합니다. 배양 기간 동안 무균 상태를 보장하기 위해 모든 시약 또는 오토클레이브를 멸균하십시오.</li>
	<li>적절한 부피의 BA-PLL(붕산 완충액[BA][50mM 붕산, 12.5mM 사붕산나트륨, pH 8.5] 중 13.2μg/mL 폴리-L-라이신하이드로브로마이드[PLL])을 각 웰(6웰 플레이트에서 1,000μL/웰, 96웰 플레이트에서 100μL/웰, 부피는 표 1에 요약됨)에 추가합니다. 현미경 커버슬립의 경우 200개의 멸균 커버슬립이 들어 있는 직경 9cm의 조직 배양 접시에 20mL의 BA-PLL을 넣고 소용돌이쳐 고르게 분포시킵니다.</li>
	<li>37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>현미경 커버슬립이 들어 있는 각 웰 또는 접시에서 BA-PLL 용액을 제거하고 멸균수 20mL를 추가하고 커버슬립을 휘젓고 물을 제거하여 세척합니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하십시오. 커버슬립이 포함된 접시의 경우 최종 세척 시 조직 배양 접시에 멸균수를 남겨두어 커버슬립을 쉽게 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 피펫으로 가능한 한 많은 액체를 제거하고 최소 2시간에서 하룻밤 동안 건조시키십시오.</li>
	<li>코팅된 플레이트를 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다. 참고: 폴리-l-라이신(BA-PLL) 용액으로 준비된 붕산은 매번 새로운 PLL을 추가하여 최대 3회까지 재사용할 수 있습니다. BA-PLL을 4°C에서 보관하십시오. PLL은 세포가 달라붙어 성장할 수 있도록 하기 때문에 접시는 BA-PLL로 처리됩니다. 이 처리가 없으면 약 1주일의 배양 후에 세포가 들어 올려져 더 이상 분화할 수 없습니다.</li>
</ol>2. E17 배아 뇌의 해부
<ol><li>한 마리 또는 여러 마리의 암컷 마우스와 수컷 마우스를 함께 수용합니다. 암컷에게 매일 점액 마개가 있는지 확인하여 짝짓기가 이루어 졌음을 나타냅니다. 참고: 모든 "연결된" 암컷 마우스는 정확한 임신 시작 날짜를 보장하기 위해 수컷과 분리되어야 합니다. 임신을 확인하기 위해 마우스의 무게를 측정하거나 육안으로 모니터링 할 수 있습니다.</li>
	<li>예를 들어 이산화탄소(CO2) 농도 상승, 치명적인 마취 과다 복용 또는 목 탈구와 같은 지역 동물 복지 지침 및 법률에 따라 적절한 방법을 사용하여 E17에서 임신한 마우스를 도태합니다. 참고: 선택한 방법은 배아를 방해해서는 안 됩니다. 이 연구에서는 이산화탄소 가스 농도 상승에 노출된 후 대퇴 동맥을 절단하여 사망을 확인하는 방법을 사용하여 임신한 댐을 도태했습니다.</li>
	<li>도태된 임신한 마우스를 해부 보드에 등에 올려 놓습니다. 고정할 필요는 없지만 경험이 없는 연구원이 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 집게를 사용하여 복부의 정중선을 꼬집습니다. 날카로운 가위를 사용하여 자궁에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하면서 생식기에서 흉곽까지 정중선을 통해 피부와 복막을 통해 복부를 잘라냅니다.<ol><li>쥐의 자궁에는 두 개의 뿔이 있으며, 각 뿔에는 일반적으로 1-5개의 배아가 들어 있습니다. 어머니에게서 배아가 들어있는 자궁을 제거하고 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>태반 측면의 난황 자루를 자르고 배아가 손상되지 않도록 주의하고 난황 자루에서 배아를 제거합니다.</li>
	<li>즉시 배아를 참수하십시오. 목이 잘린 머리를 얼음 위에 칼슘(Ca 2+)과 마그네슘(Mg2+)(HBSS-/-)이 없는 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)과 함께 접시에 넣습니다. 참고: 유전자형 분석이 필요한 경우 유전자 분석을 위해 이 단계에서 꼬리를 제거할 수 있습니다. 여러 유전자형이 예상되는 경우 각 배아의 머리를 별도로 보관하여 배양해야 합니다.</li>
	<li>각진 집게를 사용하여 머리를 왼쪽을 향하도록 옆으로 눕힙니다.</li>
	<li>집게의 한쪽 가장자리로 눈을 뚫고 다른 쪽 턱을 단단히 잡습니다.</li>
	<li>목덜미에서 시작하여 끝을 향해 정중선을 따라 두피의 피부를 부드럽게 찢습니다.</li>
	<li>흰색 타원형으로 눈에 띄는 척수를 통해 들어가면 각진 집게를 사용하여 정중선을 따라 두개골을 부수고 뇌를 노출시킵니다.</li>
	<li>두개골을 위쪽을 향한 쪽에서 부드럽게 떼어내어 뇌를 노출시킵니다.</li>
	<li>두개골에서 뇌를 들어 올려 뇌가 완전히 제거되면 두개골을 처리합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 조밀 한 혈관을 가진 얇은 막으로 눈에 띄는 수막을 제거하십시오.</li>
	<li>얼음 위에 2mL의 HBSS-/-가 들어 있는 비쥬( 재료 표 참조)에 뇌를 넣습니다.</li>
	<li>나머지 브레인에 대해 2.6-2.13단계를 반복하여 비쥬당 최대 4개의 브레인을 추가합니다.</li>
	<li>비쥬에 250 μL의 10x 트립신을 넣고 비쥬를 흔들어 뇌를 분쇄합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 알림: 이 시점부터 모든 단계는 멸균 조직 배양 후드에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>2mL의 대두 트립신(SD) 억제제(Leibovitz L-15, 대두에서 0.52mg/mL 트립신 억제제, 40μg/mL DNase I, 3mg/mL 소 혈청 알부민[BSA] 분획 V, 표 참조)를 37°C에 두어 -20°C에서 해동합니다.</li>
	<li>뇌가 포함된 각 비쥬(최대 4개의 브레인을 포함하는 비쥬당)에 SD 억제제 2mL를 넣고 비쥬를 다시 흔들어 고르게 분산시킵니다. 참고: SD 억제제는 트립신 활성을 감소시켜 샘플의 불필요한 소화를 방지하고 세포 생존율을 보존합니다.</li>
	<li>원심분리하지 않고 각 비석에서 상층액 2mL를 제거하고 세포 덩어리가 옮겨지지 않도록 주의하면서 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>현탁액을 두 번 흡인하여 5mL 주사기에 부착된 19G 바늘로 비석에 남아 있는 세포를 분쇄합니다. 이것은 두꺼운 점액과 같은 혼합물을 생성합니다.<ol><li>21G 바늘을 사용하여 두 번 더 반복하십시오. 덩어리가 남아 있으면 21G 바늘로 한 번 더 분쇄합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>23G 바늘을 사용하여 비쥬에서 동일한 15mL 원심분리 튜브(단계 2.18부터)로 세포를 옮깁니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 모든 상층액을 제거하고 필요한 세포가 들어 있는 바닥의 느슨한 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 다른 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>상층액을 RT에서 200 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 참고: 이 단계는 필수는 아니지만 많은 세포가 필요하거나 배아가 적은 경우 이 단계를 수행하여 상청액에서 가능한 한 많은 세포를 복구할 수 있습니다.</li>
	<li>10mL의 도금 배지(PM)(49% Dulbecco's modified eagle medium[DMEM], 1% 페니실린/스트렙토마이신[Pen/Strep], 25% 말 혈청, 25% HBSS with Ca 2+ 및 Mg2 +[HBSS+ /+]; 재료 표 참조), 두 펠릿을 함께 결합하고 재현탁하여 전체 세포 현탁액을 만듭니다.</li>
	<li>트립판 블루와 혈구계 또는 디지털 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세고 PM으로 세포 현탁액을 1.8 x 106 cells/mL의 농도로 희석합니다.</li>
</ol>3. 셀 도금
<ol><li>표 1에 자세히 설명된 대로 필요한 부피의 세포 현탁액을 필요한 형식에 추가합니다: 6웰 형식의 경우 웰당 1,000μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 커버슬립당 100μL.</li>
	<li>37°C에서 5%-7%CO2로 2-4시간 동안 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포가 부착되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>배지를 제거하고 새로운 분화 배지(DM+: 10μg/mL 인슐린을 포함한 DM-)로 보충합니다. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50nM 하이드로코르티손, 10ng/mL 비오틴, 2.5mL 100x N1 배지 보충제; 재료 표 참조). 볼륨은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 떠 있는 커버슬립을 누릅니다.</li>
</ol>4. 문화 유지
참고: 이러한 배양은 최적의 성장과 분화를 지원하기 위해 매주 세 번 먹이를 주어야 합니다. 배양은 DIV (days in vitro) 실험을 위한 최적의 건강 및 성숙도에 도달할 것이다 21. 세포는 최대 28 일 동안 배양 할 수 있으며, 그 후에 배양 물은 빠르게 퇴화됩니다.
<ol><li>DIV12까지 주 3회, 6웰 형식의 경우 웰당 500μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 3개의 커버슬립이 포함된 접시당 500μL를 제거하고 6웰 형식의 경우 웰당 600μL, 96웰 형식의 경우 웰당 60μL를 추가하여 상층액의 일부를 신선한 DM+로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).</li>
	<li>DIV13부터 주당 3회, 6-웰 형식에서 웰당 500 μL, 96-웰 형식에서 웰당 50 μL, 또는 3개의 커버슬립을 포함하는 디쉬당 500 μL를 제거하고, 6-웰 형식에서 웰당 600 μL, 96-웰 형식에서 웰당 60 μL을 추가하여, 상청액의 일부를 신선한 DM-으로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).</li>
</ol>

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위한 배아 마우스 뇌 혼합 세포 배양

<ol>
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중추신경계는 뇌에서 척수까지 이어지는 복잡한 네트워크로, 주로 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 미세아교세포 등 다양한 세포 유형으로 구성되어 있다1. 각 세포는 항상성을 유지하고 CNS 9,10,11의 문제에 대한 적절한 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 모든 세포 유형을 포함하는 배양 시스템은 뇌?...

중추신경계(CNS)에 대한 이해를 높이는 것은 많은 신경염증 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료 옵션을 개선하는 데 중요합니다. 뇌, 척수, 시신경 내에서 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크인 CNS는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 이들의 선천성 면역 세포인 미세아교세포로 구성됩니다1. 체외 접근법은 종종 의미있는 연구를 수행하는 데 필요한 마우스의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 그러나 CNS의 복잡한 특성으로 인해 세포주를 사용하여 생체 내 상황을 요약하는 것은 불가능합니다. 혼합 신경 세포 배양은 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙 2,3에 따라 관련 모델에서 신경(면역학) 문제를 조사하는 데 매우 유용한 연구 도구를 제공합니다.
Thomson et al.은 앞서 언급한 모든 주요 CNS 세포 유형으로 분화하는 태아기 척수 세포를 이용한 세포 배양 방법을 설명했다4. 이 시스템은 또한 시냅스 형성, 수초 축삭 및 Ranvier의 노드를 가지고 있습니다. 이 배양 방법의 주요 한계는 척수이기 때문에 뇌를 유용하게 모델링하지 못하고 배아 13일(E13) 척수로부터의 세포 수율이 수축한다는 것입니다. 따라서 조사할 수 있는 실험 조건의 수가 제한됩니다. 따라서 본 연구는 동물에 대한 요구량을 줄이기 위해 세포 수율이 증가한 뇌의 특성을 재현하는 새로운 세포 배양 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다.
Thomson et al. 출발점으로 우리는 순전히 태아기 쥐의 뇌에서 파생된 세포 배양 모델을 개발했습니다. 이러한 배양은 척수 배양과 동일한 세포 집단, 상호 연결성 및 치료 옵션을 가지고 있지만 비교에 의한 수초화가 적습니다. 그러나 세포 수율이 약 3배 더 높은 CNS in vitro 모델을 갖는 것이 더 효율적이며, 더 적은 수의 마우스와 더 적은 배아 처리 시간을 필요로 합니다. 당사는 현미경 분석을 위한 유리 커버슬립과 고처리량 연구를 위한 96웰 플레이트를 포함한 다양한 크기의 플라스틱 웰 플레이트를 사용하는 등 여러 다운스트림 응용 분야 및 스케일에 맞게 이 고유한 배양 시스템을 최적화했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4549-100ML</td>
			<td>To digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm TC Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11339283</td>
			<td>Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td>To collect cells into pellet for resuspension in plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710012040</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304432</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710006030</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15869152</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Bijoux</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DIS080010R</td>
			<td>To put brains intp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>To plate out cells for high-throughput testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-123-284</td>
			<td>For flow cytometry staining of astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0108-5/45-PO</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501</td>
			<td>For DM+/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td>For boric acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101825</td>
			<td>For flow cytometry staining of neurons and astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103139</td>
			<td>For flow cytometry staining of microglia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101243</td>
			<td>For flow cytometry staining of microglia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-10G</td>
			<td>For SD Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6319</td>
			<td>Mature oligodendrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0149</td>
			<td>To plate out cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21969-035</td>
			<td>For DM+/-, and for plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>18047019</td>
			<td>For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td>For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td>Live / Dead stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0102-SS135-PO</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w Ca Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9269-500ML</td>
			<td>For plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Ca Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>For brains to be added to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>For plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td>For DM+/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1</td>
			<td>Alpha-Laboratories</td>
			<td>019-1971</td>
			<td>Microglia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>For DM+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15</td>
			<td>GIbco</td>
			<td>11415-049</td>
			<td>For SD Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA409S</td>
			<td>Myelin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit</td>
			<td>BioTechne</td>
			<td>DY478-05</td>
			<td>ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 media supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td>For DM+/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Neuronal stem/progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PA578499</td>
			<td>Neuronal cell body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Immature oligodendrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-119-155</td>
			<td>For flow cytometry staining of oligodendrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>For DM+/-, and for plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysinehydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI31</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Axons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tetraborate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732-100G</td>
			<td>For boric acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For lysing cells for RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003-100MG</td>
			<td>For SD Inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing mixed neuronal and glial cell cultures from embryonic mouse brains to study infection and innate immunity

중추신경계(CNS)의 모델은 생체 내에서 발견되는 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크를 요약해야 합니다.중추신경계는 주로 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성됩니다. 동물 사용을 대체하고 줄이기 위한 노력이 증가함에 따라 선천성 세포 특성을 탐색하기 위해 다양한 시험관 내 세포 배양 시스템이 개발되어 CNS 감염 및 병리에 대한 치료제를 개발할 수 있습니다. 특정 연구 질문은 (유도된) 만능 줄기 세포와 같은 인간 기반 세포 배양 시스템으로 해결할 수 있지만 인간 세포로 작업하는 것은 가용성, 비용 및 윤리와 관련하여 고유한 한계가 있습니다. 여기에서는 배아 마우스 뇌에서 세포를 분리하고 배양하기 위한 고유한 프로토콜을 설명합니다. 그 결과 혼합 신경 세포 배양은 생체 내 뇌에서 발견되는 여러 세포 집단과 상호 작용을 모방합니다. 현재의 동등한 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은 뇌의 특성을 더 밀접하게 모방하고 더 많은 세포를 확보하므로 임신한 마우스 한 마리에서 더 많은 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 비교적 쉽고 재현성이 높습니다. 이러한 배양은 96웰 기반 고처리량 스크리닝, 24웰 현미경 분석, 유세포 분석 및 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위한 6웰 배양을 포함하여 다양한 규모로 사용하도록 최적화되었습니다. 이 배양 방법은 시험관 내 방법의 편리함과 함께 CNS의 일부 복잡성의 맥락에서 감염 및 면역을 조사하는 강력한 도구입니다.

Improving our understanding of the central nervous system (CNS) is critical to improve therapeutic options for many neuroinflammatory and neurodegenerative diseases. The CNS, a complex network of interconnected cells within the brain, spinal cord, and optic nerves, comprises neurons, oligodendrocytes, astrocytes, and their innate immune cells, the microglia1. An in vitro approach can often drastically reduce the number of mice required to perform meaningful research; however, the complex nature of the CNS makes it impossible to recapitulate the in vivo situation using cell lines. Mixed neural cell cultures provide an extremely valuable research tool to investigate neuro(immuno)logy questions in a relevant model, in line with the Replacement, Reduction and Refinement (3Rs) principles2,3.
Thomson et al. described a cell culture method using prenatal spinal cord cells that differentiate into all the aforementioned main CNS cell types4. This system also has synapse formation, myelinated axons, and nodes of Ranvier. The main limitation of this culturing method is that, being spinal cord, it does not usefully model the brain, and the cell yields from embryonic day 13 (E13) spinal cords are constricting. Thus, this limits the number of experimental conditions that can be investigated. Therefore, this study aimed to develop a new cell culture system that recapitulates the characteristics of the brain with increased cell yield to reduce the requirements for animals.
Using Thomson et al. as a starting point, we developed a cell culture model derived purely from prenatal mouse brains. These cultures have the same cell populations, interconnectivity, and treatment options as the spinal cord cultures, except there is less myelination by comparison. However, having a CNS in vitro model with an approximately threefold higher cell yield is more efficient, requiring fewer mice and less time processing embryos. We optimized this unique culture system for multiple downstream applications and scales, including using glass coverslips for microscopy analysis and various sizes of plastic well plates, including 96-well plates for high throughput research.

저자 스포트라이트: 감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 마우스 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교세포 배양 확립  

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

The ultimate research question of my project is to figure out how we can manipulate the innate immune responses of the central nervous system to protect against viral infections. Currently, we research their response to the profoundly antiviral protein interferon beta. An experimental challenge is generating enough cells to allow for detailed investigation.Each result needs to be validated using multiple techniques and this can, unfortunately, result in many animals being culled. Due to the large number of cells generated by this novel culture technique, many different experimental conditions can be investigated from one pregnant mouse. Additionally, using in vitro alternatives, where possible, also greatly decreases animal suffering.This method reduces and refines animal use, closely following the principles of the three Rs.This culture method can be used to address many different research questions using a variety of readout methods such as ELISA, qPCR, microscopy and flow cytometry. This technique could help other researchers to reduce and refine their animal usage. We hope to improve our understanding of the innate antiviral response, modulating it to protect against opportunistic viruses such as human polyomavirus 2, or John Cunningham virus, as it is commonly known, the primary agent of PML which can be a severe side effect of immune suppressive drugs used to treat MS and other diseases.

현미경 검사 법 유리 커버슬립에서 자란 배양액은 현미경으로 분석하는 데 이상적입니다. 배양의 발달을 시각화하기 위해 커버슬립을 DIV0(세포가 부착된 후)부터 DIV28까지 여러 시점에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정했습니다. 배양물은 앞서 설명한5 와 같이 신경교 마커로서 NG2(미성숙 희소돌기아교세포) 및 네스틴(신경줄기/전구 세포), 신경 표지자로서 SMI31(?...

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이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

내 프로젝트의 궁극적 인 연구 질문은 바이러스 감염으로부터 보호하기 위해 중추 신경계의 선천성 면역 반응을 조작 할 수있는 방법을 알아내는 것입니다. 현재 우리는 심오한 항 바이러스 단백질 인터페론 베타에 대한 반응을 연구하고 있습니다. 실험적 과제는 자세한 조사가 가능하도록 충분한 세포를 생성하는 것입니다.각 결과는 여러 기술을 사용하여 검증해야 하며 불행히도 많은 동물이 도태될 수 있습니다. 이 새로운 배양 기술에 의해 생성된 많은 수의 세포로 인해 한 마리의 임신한 마우스에서 다양한 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한 가능한 경우 시험관 내 대안을 사용하면 동물의 고통을 크게 줄일 수 있습니다.이 방법은 세 가지 Rs.This 배양 방법의 원칙에 따라 동물 사용을 줄이고 개선하여 ELISA, qPCR, 현미경 및 유세포 분석과 같은 다양한 판독 방법을 사용하여 다양한 연구 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 다른 연구자들이 동물 사용을 줄이고 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 타고난 항바이러스 반응에 대한 이해를 향상시키고, 인간 폴리오마바이러스 2 또는 일반적으로 알려진 바와 같이 PML의 주요 약제인 존 커닝햄 바이러스(일반적으로 알려진 바와 같이)로부터 보호하기 위해 이를 조절하여 MS 및 기타 질병을 치료하는 데 사용되는 면역 억제제의 심각한 부작용이 될 수 있기를 바랍니다.

establishing-mixed-neuronal-glial-cell-cultures-from-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

1.7K 조회수.  University of Glasgow. 내 프로젝트의 궁극적 인 연구 질문은 바이러스 감염으로부터 보호하기 위해 중추 신경계의 선천성 면역 반응을 조작 할 수있는 방법을 알아내는 것입니다. 현재 우리는 심오한 항 바이러스 단백질 인터페론 베타에 대한 반응을 연구하고 있습니다. 실험적 과제는 자세한 조사가 가능하도록 충분한 세포를 생성하는 것입니다.각 결과는 여러 기술을 사용하여 검증해야 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: 감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 마우스 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교세포 배양 확립  

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

연구

신경과학

Murine E17 Embryonal Brain Dissection, Cell Plating, and Maintenance

Begin by placing a sacrificed pregnant mouse on its back on a dissection board. Using forceps, pinch the abdominal midline. With a pair of sharp scissors, cut the abdomen through the skin and the peritoneum from the genitalia to the rib cage over the midline.Remove the uterus containing the embryos and place it immediately on ice. Carefully cut through the yolk sac on the placental sides and remove the embryos. Then, place the decapitated embryonic heads into an iced dish containing calcium and magnesium-deficient HBSS.Place the head into a 35-millimeter dish facing left. Pierce one eye with the edge of the forceps, firmly holding the chin with the other. Gently tear the scalp skin from the nape along the midline towards the snout.Use the angled forceps to enter through the white oval spinal cord and crack the skull open along the midline, exposing the brain. Gently peel the skull away from the sides. Then, lift the brain out of the skull and dispose of the skull.Use forceps to remove the meninges. Place the brains in a bijou containing two milliliters of calcium and magnesium-deficient HBSS. Add 250 microliters of 10X trypsin to the bijou.Triturate the brains by shaking the bijou and then incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius. Next, add two milliliters of soybean trypsin inhibitor to each bijou. Shake to disperse the inhibitor evenly.Without centrifuging, transfer two milliliters of the supernatant from each bijou into a 15-milliliter centrifuge tube. Using a 19-gauge needle attached to a five-milliliter syringe, aspirate the suspension twice to triturate the remaining cells in the bijou. Repeat aspiration twice with a 21-gauge needle.Using a 23-G needle, transfer the cells from the bijou into the 15-milliliter centrifuge tube containing the cell supernatant and centrifuge at 200 G for five minutes at room temperature. Using a five-millimeter serological pipette, transfer all the supernatant into a new 15-milliliter centrifuge tube without disturbing the pellet. Repeat centrifugation.Add 10 milliliters of the plating media to a tube containing the combined pellets from both centrifugation steps and mix well to create a whole suspension. Stain the cells with trypan blue and count using a hemocytometer or a cell counter. Plate the cells by adding the required volume of the murine E17 embryonic brain cell suspension into a well plate.Incubate the cells at 37 degrees Celsius under 5 to 7%carbon dioxide for two to four hours. After removing the media, add new differentiation media to each well. Press down any floating cover slips using a sterile pipette tip.Maintain cultures by removing part of the supernatant and replacing it with fresh differentiation media three times each week. Cultures were visualized by immunofluorescence staining for NG2 and nestin as developmental markers, SMI31, MBP, and NeuN as neuronal markers, and CNP, GFAP and Iba1 as glial markers Infection of cultures with neurotropic Semliki Forest virus affected the oligodendrocytes and the neurons. qRT-PCR investigations of the infected cells demonstrated upregulation of the chemotactic cytokine Ccl5 mRNA in cultures treated with interferon beta.ELISA studies displayed increased Ccl5 in the supernatant, thus displaying a correlation between mRNA and protein expression. Flow cytometric studies of single-cell suspension showed that 70%of the cells remained viable. A large number of microglia, neurons, and astrocytes were present, while oligodendrocytes were the least abundant.