이 기술의 전반적인 목표는 생체 내의 피질 뉴런 아키텍처에 대한 유전자 발현 조작의 효과의 평가입니다. 중성 전기화에 기초한 절차에 대한 이 절차의 첫 번째 주요 장점은 유전자 발현 수준의 미세한 제어입니다. 구체적으로, 이러한 통합 파이프라인은 뉴런 세포구조 조절에 대한 유전자 발현의 작은 변화에 의해 높은 결함의 생체 내 평가를 가능하게 한다.
더욱이, 이식 시험의 쌍 구조는 통계적으로 유의한 결과를 얻기 위하여 필요한 동물 수에 있는 거대한 감소를 허용합니다. 이 기술은 타우 EGFP 형질전환 배아에서 유래한 전구체 풀을 이용합니다. 이 풀은 두 개의 렌티바이러스 믹스에 감염되는 두 개의 하위 풀로 세분화됩니다.
녹색 테스트 풀과 공동 주입될 노란색 컨트롤 풀을 얻으려면. 체외 팽창의 이틀 후에, 결과 신경 구는 분리되고, 1대 1로 혼합되고, 마우스 심실 공간에 모세관으로 주입됩니다. 10 일 후, 관상 측면에 면역 형광은 테스트 및 제어 뉴런 사이의 비교를 허용하기 위해 수행됩니다.
마지막으로, 면역스테인화된 섹션은 형태 매개변수의 최종 평가를 위해 이미지화되고 골격화됩니다. 생체 내 이식 전에 전구체 녹색 풀을 준비하십시오. 이전에 타우 EGFP 설립자와 짝을 이었던 임신 한 댐에서 수확 한 E12.5 배아는 PBS 용액에서 멀티 웰 플레이트의 개별 우물에 설정됩니다.
청색 광등 아래에서 육안 검사를 통해 신속하게 유전자형. 해부된 녹색 코르티체를 단일 세포로 분리합니다. 증식 매체에서 세포를 다시 일시 중단하고 두 개의 동등하게 크기의 하위 풀로 세분화합니다.
전용 렌티바이러스 믹스로 각 하위 풀을 감염시다. 각 믹스에는 빨간색 라벨 바이러스 또는 블랙 컨트롤 바이러스가 포함되어 있습니다. Tet-Off 구동 된 변형 또는 제어 발현에 대한 바이러스뿐만 아니라 각각.
각 렌티바이러스는 8의 감염의 복합성에서 관리되어야 합니다. 독시사이클린의 밀리리터 당 2 마이크로그램으로 증식 배지에 감염된 세포를 플레이트. 세포를 인큐베이터로 옮기고 37도에서 2 일 동안 둡니다.
2 일 후, 두 하위 풀은 작은 신경 구의 현탁액으로 나타나야합니다. 균일하게 적색 형광 단백질을 표현하거나 하지 않습니다. 전구체의 엔지니어링 후 P0 백색 실험실 새끼의 이식에 대한 평가 배열을 설정합니다.
각각 1.5밀리미터와 1.12밀리미터의 영원하고 내부 직경이 있는 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용합니다. P1000 풀러로 모세관을 당깁니다. 먼저 끌어당기는 프로그램을 입력합니다.
둘째, 모세관을 홀더에 넣고 조입니다. 셋째, 프로그램을 시작하고 두 개의 뽑아 낸 미세 모세 혈관을 가져 가라. 모세관 끝을 메스와 함께 손으로 자르고 스테레오 현미경 아래에서 200-250 마이크로미터의 외부 직경으로 팁을 얻습니다.
마지막으로, 플라스틱 지지대위에 모세혈관을 닫은 페트리 접시에 놓고 후드 아래에 옮습니다. 광섬유를 소독하고 후드 아래에 놓습니다. EGTA 및 패스트 그린 마스터 믹스를 혼합하여 셀 트레이서 용액을 준비하고 후드 아래에 다시 놓습니다.
세포 현탁액 을 위해 실험실 밀봉 필름의 작은 조각을 잘라. 그리고 마지막으로, 0.3 밀리리터 주사기에 배치 된 밀리리터 멸균 독시 사이클린 당 1 밀리그램의 용액을 준비합니다. 사출 튜브는 두 개의 라텍스 튜브에서 제조됩니다.
라텍스 튜브의 한쪽 끝에 하드 플라스틱 입 조각을 고정합니다. 그런 다음 모세관 홀더를 다른 라텍스 튜브의 한쪽 끝으로 고정합니다. 운전자 세균에 대한 장벽으로 0.45 마이크로미터 멸균 필터에서 두 라텍스 튜브의 자유 끝을 연결합니다.
결과 흡기 튜브 어셈블리를 플라스틱 홀더에 배치하여 후드 아래에 보관합니다. 별도의 튜브에서 신경구를 수집, 테스트 및 제어합니다. 원심 분리 신경권 현탁액및 PBS에 의해 상신을 대체한다.
이 시퀀스를 두 번 더 반복합니다. 원심 분리 신경권 현탁액, 트립신 용액에 의해 상체를 교체하고, 세포 펠릿을 위아래로 피펫, 4, 5 회. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 5 분 동안 인큐베이터에 세포를 둡니다.
트립신 억제제 용액으로 트립신을 차단합니다. 원심 분리기 세포, 신선한 증식 배지에서 다시 중단. 두 풀의 세포를 계산하고 증식 배지에서 마이크로리터 당 100, 000 세포로 농도를 조정합니다.
그런 다음, 테스트 및 제어 세포를 혼합 1:1과 형광 현미경의 밑에 결과 혼합을 확인합니다. 마지막으로, 후드 아래에 얼음에 믹스를 놓습니다. 수술 운영자 지역에서 멀리 떨어진 테이블에 어머니와 새끼와 함께 케이지를 준비합니다.
복구 케이지를 카트에 놓습니다. 어머니의 케이지에서 가져온 톱밥을 바닥에 넣고 복구 케이지를 램프 아래에 놓습니다. 옆으로, P0 새끼의 마취를위한 알루미늄 호일로 덮여 얼음 상자를 설정합니다.
이식 직전에 1-10부분량의 세포 추적제 용액을 1부세포 현탁액에 추가하고, 실험실 밀봉 필름의 조각에 생성된 혼합물의 3개의 마이크로리터를 발견한다. 시원한 알루미늄 호일에 1분간 새끼를 놓고 완전히 마취되어 있는지 확인합니다. 한편, 유리 모세관에 주입 믹스의 3 마이크로 리터를 흡인.
마취 된 강아지의 머리를 70 %에탄올로 부드럽게 닦으십시오. 다음으로, 광섬유에 위치하여 피질 반구를 명확하게 식별합니다. 앞쪽에 모세관을 입력하고 심실 구멍에 액세스합니다.
그 일을 하는 동안, 혈관을 손상 하지 주의. 신경절 눈명성의 손상을 방지하기 위해, 30도 에 의해 측면으로 바늘을 회전. 부드럽게 구멍에 세포를 주입하고 빠른 녹색을 통해 자신의 확산을 모니터링합니다.
5~10초 동안 기다립니다. 유리 바늘을 제거하고 셀 서스펜션을 흡인하지 않도록 주의하고 적절한 폐기 쓰레기통에 버리십시오. 마취에서 강아지 회복하기 전에, 이식 후 트랜스 제닉 발현을 유지하기 위해 내회적으로 독시 용액150 마이크로 리터를 주입하십시오.
주입 후, 복구를 위해 램프 바로 아래에 새끼를 놓습니다. 새끼를 5~10분 동안 그곳에 두고 완전히 깨어 나면 어머니와 함께 케이지에 놓습니다. 수술된 새끼를 2~3시간 동안 관찰하여 어머니가 새끼를 받아들이도록 하십시오.
0.5mg/mL 독시사이클린과 자당을 함유한 식수를 케이지에 공급하여 형질표현을 유지한다. 이식 4일 후에 물을 함유한 독시사이클린을 독시없는 물로 대체하십시오. 따라서 미상 후 뉴런에서 트랜스 유전자를 활성화시킨다.
6 일 동안 독시없는 정권에 마우스를 유지하고 P10에서 안락사. 안락사 된 새끼에서 두뇌를 수정 4%PFA, 4도에서, 하룻밤. PFA 용액을 제거하고 30% 자당 용액으로 교체하십시오.
뇌가 바이알 바닥으로 가라앉을 때까지 뇌를 4도 로 둡니다. 극저온 배지로 채워진 일회용 임베딩 몰드로 뇌를 옮기십시오. 포함된 뇌를 80도 동결합니다.
저온을 사용하여 60 미크론 두꺼운 관상 섹션을 잘라. 항-GFP, 항 RFP 면역 형광 및 DAPI 용액으로 이를 카운터스테인에 대한 공정 섹션. 표시된 대로 공초점 현미경의 작업 매개 변수를 적절히 설정합니다.
면역 분석 슬라이스의 사진을 수집, RFP 신호 분포의 GFP 양성 뉴런 풍부한 사진 필드를 선택. 이미지를 ND2 파일로 내보내고 TIFF 파일로 이미지를 최대 z 프로젝션을 생성합니다. 세포 유전자형의 후속 뉴런 골격화 블라인드를 허용하려면 적색 신호를 숨깁니다.
이렇게 하려면 조정 레이어를 추가합니다. 레벨을 선택하고 빨간색을 선택합니다. 출력을 0으로 설정합니다.
그리고 같은 파일을 저장합니다. 골격화는 이후 원래 일반 빨간색 파일에 대한 이전에 액세스할 수 없었던 새 운영자에 의해 수행됩니다. 숨겨진 각 빨간색 파일에 대해 파일을 열고 기본 이미지에 도면 레이어를 추가하고 연필 도구를 선택합니다.
GFP 신호를 기준으로 소어를 추적합니다. 그런 다음, 중성염을 추적합니다. 마지막으로, 뉴런 실루엣을 포함한 뮤틀리레이어 파일을 저장합니다.
뉴런 골격의 후속 분석은 어느 작업자에 의해 수행 될 수있다. 각 mulitlayer 파일을 열고 검은 색 배경이있는 새 빈 16 비트 회색 크기 파일을 만듭니다. 뉴런 당 하나.
기본 이미지에서 회색 스케일 파일에 이르기까지 단일 뉴런 실루엣을 복사하여 붙여 넣습니다. 다층 파일로 돌아가서 조정 층을 끄면 신경 유전자형을 공개하십시오. 16비트 그레이스케일 파일을 저장하여 해당 뉴런 유전자형에 추가합니다.
ImageJ에서 회색 스케일 이미지를 하나씩 가져오고 NeurphologyJ 플러그인으로 골격을 분석합니다. 선택한 NeurophologyJ 기본 데이터, 중성기 길이의 총 영역, 부착 점 및 끝점을 스프레드시트에 수집하고 이차 형태 매개 변수를 계산하기 위해 사용합니다. 우리가 제안하는 엔지니어링 프로토콜은 의도 된 트랜스 게네스 세트와 함께 조사의 뉴런의 대다수를 결합 할 수 있습니다.
더욱이, 그것은 변환된 세포 집단 내의 질적 발현 수준의 실질적인 균질성을 달성할 수 있다. 우리의 절차의 주요 특징은, 그것은 쌍 구성입니다. 테스트 및 제어 전구체 풀은 별도로 설계되고, 1:1을 혼합하고, 마지막으로 공동 이식됩니다.
이 쌍을 이루는 접근 방식은 별개의 유전자형에 특별히 연결된 결과 차이의 검출을 용이하게 할 것입니다. 이 예에서, 우리는 이식된 새끼의 관상 단면을 분석했습니다, Foxg1의 심실 공동 주입 후에 10 일 과발 현현 신경 전구체 및 대조그들. 뉴런 그룹의 이미지는 공초점 현미경 검사법으로 획득되었습니다.
Z 스택 파일은 최대 투영을 계산하는 데 사용되었습니다. 뉴런 실루엣은 수동으로 추적되었습니다. 여기서, 녹색과 노란색 실루엣은 Foxg1 과발현 및 제어 뉴런을 각각 나타냅니다.
마지막으로 NeurphologyJ 분석에 의해 얻은 기본 매개 변수는 그림과 같이 이차 형태지수의 계산에 사용되었습니다. 이것은 연구원이 주어진 유전자의 혼합발현이 생체 내의 중성염 발달 다트의 미세한 통제에 발휘할 수 있다는 충격을 평가할 수 있는 간단한 프로토콜입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 두 가지입니다.
뉴런 형태발생에 관여하는 유전자의 기존 수는 해당 성소 성소 선의 부재시 생체 내에서 기능적으로 특징지어질 수 있다. 그리고 중요한 통계 결과를 얻기 위해 분석에 필요한 동물수가 적습니다.
