Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. 단백질 샘플 및 버퍼 준비 <ol><li> 샘플 준비 : 관심의 단백질을 정화하고 젤 여과 컬럼으로 또는 초 원심 분리에 의해 이전에 실험에 단백질을 주입하여, 모든 집계가 제거되어 있는지 확인 (100,000 XG 충분 보통 10 분에서). 주 : 바람직한 고순도의 단백질 제제는 필수는 아니지만. SPR 성공적으로보다 적게보다는 완벽한 정제를 함께 심지어 총 추출 8,9로 사용되어왔다. </li><li> 버퍼 준비 : <ol><li> ( &quot;버퍼를 실행 중&quot;이라고, 또는 RB) 실험의 버퍼를 준비합니다. 프로토콜은 여기에 설명을 위해, 50 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨 및 0.05 % (w / v)의 DDM (N- 도데 실 β-D​​-말토 사이드)를 사용한다. 버퍼 조성물의 선택은 쉽게 공부 시스템에 따라 변경 될 수 있음을 유의하십시오. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 모든 버퍼 및 단백질 시료를 필터링합니다. 필터가 단백질 - 있는지 사전에 확인호환. 일반적으로, 최근에 판매 SPR 플랫폼은 인라인 드 GASSER를 포함; 이 경우, 탈 가스되지 않은 경우 종래에 사용하는 버퍼. </li><li> 밤새 투석 완충액 또는 불일치를 피하기 위해 RB에 대해 샘플을 희석한다. 고점도의 화학 물질을 사용하는 경우 투석 (또는 버퍼 교환 된 임의의 다른 방법)이 특히 바람직하다 (예를 들어, 수 크로스, 글리세롤, DMSO). 펌프 흡입구에 RB 병을 연결하기 전에 별도의 튜브에 따로 RB 10 ㎖를 유지합니다. </li></ol></li><li> 20 ㎍ / ml의 ~ 최종 농도로 농축 RB 리간드 스톡을 희석. 높은 농도, 높은 흐름과 짧은 주사 반대로 엄지 손가락의 규칙으로, 안정적인 리간드 고정화, 저 유량에서 더 이상 주사 낮은 리간드 농도를 사용합니다. </li><li> 원하는 농도 RB에 분석을 희석. 전형적으로, 10 배 희석액을 10 nm의 10 μM에서 알 친화 시스템의 농도 범위를 테스트한다. 항상 시작먼저 낮은 농도. </li></ol> 2. 센서 칩 <ol><li> 칩 선택 : 니트릴 산 (NTA) 올리고 히스티딘 태그로 단백질을 캡처하기에 적합한 결합 된 칩을 사용합니다. </li><li> 칩 사용 : <ol><li> 새로운 칩을 사용하는 경우, 칼집에서 칩을 꺼내 증류수 (DDW)으로 가볍게 씻어 섬세한 와이퍼를 사용하여 조심스럽게 남아있는 액체를 건조하고, 금 층 표면에 닿지 않도록해야합니다. (칩이 제대로 배치 할 때 삽입이 원활) 올바른 방향으로 다시 칼집에 칩을 놓습니다. </li><li> 칩을 재사용하는 경우, 버퍼에서 저장된 칩을 꺼내 전술 한 바와 같이 부드럽게 DDW 건조 깨끗이 씻어 원래 칼집에 배치합니다. 주 : 칩 비특이적 정크 물질의 축적은 그 생존력을 &#39;에 영향을 미칠 수있다. 이는 리간드 고정화 및 포스트 스트립 핑 된 RU를 비교함으로써 모니터링 될 수있다. 많은 측정 할 수 있지만같은 NiNTA 칩을 사용하여 수행, 장수의 문제는 &#39;명확한&#39;하지 않고 다른 칩 사이에 크게 다릅니다. </li></ol></li><li> 칩 도킹 : 센서 칩 문을 열고 칼집에 칩을 놓습니다. 새로운 칩을 사용하는 경우, 입력은 칩의 일련 번호는 사용 기록을 유지한다. 문를 눌러 &#39;독 칩&#39;을 닫습니다. </li></ol> 3. 온도 설정 <ol><li> 25 ° C (또는 선호하는 실험 온도)에 칩 셀 온도를 설정합니다. </li><li> 선택 사항 : 실험을하는 동안 안정적으로 단백질을 유지하기 위해 7 ° C에 샘플 구획​​을 설정합니다. </li></ol> 로드 및 스트리핑 4. 솔루션 H 2 O에 RB (RB 같이 최종 농도로 EDTA 용액에 세제를 추가)에 RB 0.5 mM의 NiCl 2, 350 mM의 EDTA, 0.25 % SDS, 및 H 100mm의 염산 :로드 및 제거에 대한 다음과 같은 솔루션을 준비 2 O. 마이크로 원심 분리기 욕조를 사용하는 경우ES하지 지정된 튜브 SPR, 튜브의 캡을 차단하는 것을 잊지 마세요. 5. 프라임 SPR 악기 RB와 6. 새로운 실행을 시작합니다 <ol><li> 실험 기간 동안 사용되는 유량을 설정한다. 여기에 설명 된 결과를 얻으려면 50 μL / 분에 흐름을 설정합니다. 참고 :이 매개 변수는 실험 기간 동안 수정 될 수 있습니다. </li><li> 유로 및 참조 빼기를 정의합니다. 여기에 설명 된 경로 된 Fc = 1 된 Fc = 2, 뺄셈 된 Fc = 2-1 결과 집합을 구하십시오. 참고 :이 프로그램은 실시간으로 측정 된 두 세포의 뺄셈을 표시합니다. 이 매개 변수는 실험 기간 동안 변경 될 수 있음을 유의하십시오. </li><li> 적합한 샘플을 선택 랙 (이는 샘플 량 소비에 영향을 미칠 수있다). </li><li> 결과 파일을 저장합니다. </li></ol> 7. 실험 사이클 각 실험 사이클로 구성되어, EA에서 수행 주사의 명확한 기록을 유지CH주기 및 리간드 &quot;로딩 버퍼의 빈 주입하고, 다른 사이클에 주입 분석 물을 분리. <ol><li> 사이클 1 : 칩 준비와 니켈로드 <ol><li> 6.1 및 6.2 단계에있어서의 흐름과 경로가 설정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 1 분 먹다 남은 음식을 씻어 350 mM의 EDTA를 주입한다. </li><li> 10 μL / 분으로 설정 흐름. </li><li> 2 분 동안 0.5 mM의 NiCl 2를 주입한다. 주 : 이제 칩 수지 니켈 이온으로 코팅된다. </li></ol></li><li> 사이클 2 : 고정을 리간드 <ol><li> 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 2로 설정 흐름. </li><li> 분자량 10 ~ 20 배이다 RU 값에 도달 할 때까지 리간드를 주입​​한다. 예를 들어, RU는 500 ~ 1,000 50 kDa의의 리간드를로드합니다. 달성 RU 값의 기록을 보관합니다. </li><li> 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 1로 설정 흐름. </li><li> A. 리간드의 그 제어에 도움을 줄 감산 sensogram FC (= 2-1) 모니터와 같은 RU 값까지 리간드 B (대조군)을 주입주입 길이. </li><li> 50 μL / 분, 유로 된 Fc 된 Fc = 1 = 2로 설정 유량이, 기준선까지 5-20 분 동안 세척 시스템 (FC = 2-1)를 안정화시킨다. </li></ol></li><li> 사이클 3 : 빈 주입. 따라서, 주입 분석 물 자체를 제외하고, 피 분석 물 주입되는 모든 컴포넌트들을 포함 빈 빼기 위해 봉사한다. 주 : 사출 길이는 평형 (신호 고원)에 도달하는데 걸리는 시간에 따라 변할 수있다. <ol><li> 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 1 된 Fc = 2, 된 Fc = 2-1 빼기로 설정 흐름. </li><li> 30 초 동안 ( &#39;대기&#39;로 이하 함) &#39;대기&#39;명령을 삽입 (안정 기준을 가지고). </li><li> 15 초 RB를 주입한다. 참고 분사의 기간들은 미리 평형 반응 속도 상수 (K 대부분의 a)에 따라, 상이한 시스템마다 다를 것이다. </li><li> 해리 상을 기록 120-600 초를 기다립니다. 참고 :이 단계의 길이에 따라 달라집니다 <em&gt; K D : 해리는 더 이상이 단계는 할 필요가 느리다. 매우 느린 해리 단지 (K d를 &lt;10-4 초 -1)의 경우, 10 ~ 15 분을 기다린 후 (나중에 참조) 재생 표면 진행합니다. </li></ol></li><li> 사이클 4 : 분석 주입 <ol><li> 복사 / 기준 주입 (사이클 3) 그래서이 두 주사 나중에 뺄 수에 사용되는 정확한 조건을 붙여 넣습니다. 검체 용액을 보유 하나 대조 용액을 잡고 하나의 랙의 슬롯의 위치를​​ 변경. 예상 K의 D보다 약간 농도를 선택합니다. 사전 지식을 사용할 수없는 경우, 좋은 출발점으로 1 μM을 선택한다. </li></ol></li><li> 사이클 5 : 버퍼 주입 <ol><li> 반복주기 3. </li></ol></li><li> 사이클 6 : 분석 주입 <ol><li> 반복주기 4. </li></ol></li><li> 사이클 7 : 칩이 벗겨 <ol><li> 50 μL / 분으로 설정 흐름. &lt;/ 리&gt; <li> 1 분 동안 350 mM의 EDTA를 주입한다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 이 칩에 손상을 줄 수 있으므로 3 분의 단일 주사를 사용하지 마십시오. </li><li> 1 분 동안 0.25 % SDS를 주입한다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 이 칩에 손상을 줄 수 있으므로 3 분의 단일 주사를 사용하지 마십시오. </li><li> 기준 레벨에 도달하지 않은 경우, 추가 제거 단계로서 1 분 동안 100 mM의 염산을 주입. </li><li> 대기 모드로 전환 &#39;최종 실행&#39;명령을 삽입합니다. </li></ol></li><li> 칩 저장 <ol><li> 센서 칩의 도킹을 해제하고 장비를 꺼내. </li><li> , 칼집에서 센서를 꺼내 표면에 손이 닿지 않도록, DDW 씻어하고, RB를 포함하는 50 ML 튜브에 장소. 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 8. 데이터 분석은 평가 소프트웨어 지정 사용 <ol><li> 동역학 파라미터 유도 전에 SPR에 의해 얻어진 원 데이터를 처리하는 다음 단계를 수행한다. <ol><li> 평가 소프트웨어를 사용하여, 오픈결과 파일은 선택주기는 3-6 된 Fc = 2-1 (참조 데이터를 차감). </li><li> 축 이동 : <ol><li> 디스플레이 사이클 3-6. </li><li> 제로 네 곡선의 기준선 (각 사이클에서 초기 30 초 대기 시간)의 Y 축값. </li></ol></li><li> 네 개의 곡선의 X- 축에 맞 춥니 다. 발음 기능을 선택합니다 (예를 들어, 분사 개시 또는 마무리 스파이크) 완벽 X 축을 따라 네 개의 곡선을 정렬합니다. 제로 분석 (또는 제어 버퍼)의 시작 시간을 설정합니다. </li></ol></li><li> 참조 뺄셈 <ol><li> 사용 Y 축에서 찾을 수 커브 감산 동작 메뉴를 순환 시프트 (6)의 곡선으로부터 사이클 4 및 5 사이클 곡선의 곡선으로부터 사이클 (3)의 곡선을 뺀 배경 응답을 뺀다. 참고 : 그것은 표면의 굴절률에 영향을했을 수 있습니다 (분석과 관련이없는) 어떤 비특이적 구성 요소를 말살로이 단계를 수행하는 것이 중요합니다. <ol><li> t의 감산 곡선을 저장그는 다른 이름으로 프로젝트의 시트. </li></ol></li><li> &quot;이중 감산 곡선&quot;이들 곡선 참조 : 1 감산 모두 주사 수행 2-1 감산하며, 두 번째는 다른 하나의 곡선을 감산한다. 참고 : 이러한 두 참조는 SPR 실험에서 골드 표준입니다. </li><li> 앞서 설명한 바와 같이 축 이동을 수행하여 감산 곡선을 오버레이. </li></ol></li><li> 반응 속도 상수 및 모델 피팅의 결정 <ol><li> 운동 실험을 실시 <ol><li> 운동 상수 판정 용 데이터의 신뢰성을 갖도록 6-7 분석 물 농도의 일련의 주입한다. 에서 분석 농도를 선택 2-3 배 희석에, 추정 K D 아래의 10 배에 위의 10 배. 이상 (위 참조)을 두 번 참조 빼기에 사용되는 &quot;제로&quot;의 농도를 포함합니다. 3 회 반복하고 임의의 순서로 주사를 실시한다. </li><li> 맞 춥니 다및 모델 피팅 시도하기 전에 Y 축 및 X 축에 대하여 모든 커브 빼기. </li></ol></li><li> 모델 피팅 <ol><li> 적절한 분석 프로그램을 선택합니다. 주 : 대부분의 사용 가능한 피팅 프로그램은 피팅과​​ 운동 상수의 결정에 적용 할 수있는 몇 가지 모델을 제공합니다. </li><li> 분석과 피팅에 대한 리간드 사이의 상호 작용 (1) : 가역적 인 1 가정 간단한 모델 (랭 뮤어)를 적용합니다. 데이터를 설득하는 것이 더 복잡한 상호 작용의 존재에 대한 다른 실험 방법에서 사용할 수 있습니다하지 않는 한, 항상 간단한 랭 뮤어 모델을 사용하고 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
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All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR은 분자 상호 작용을 연구하는 고감도 방법이며, 과도 (아직 중요) 상호 작용의 실시간 모니터링을 제공하는 유일한 방법은 많다. 예는 다른 방법 (풀 - 다운 분석법 리포좀 침강 분석법 6)에 의해 검출 될 수없는 본 명세서 과도 상호 작용한다. 다른 방법 (정량적 또는 정 성적 관계없이) 측정을 평형 제한되어 있지만 또한, SPR은 미리 평형 동역학을 측정 만 기술 중 하나이다. <p class="jo...

단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI); 형성과 단백질 복합체의 해리는 많은 생물학적 과정 (예를 들어, 복제, 전사, 번역, 신호 전달, 세포 - 세포 통신)의 주요 이벤트입니다. PPI의 반 정량적 연구는 종종 풀다운 또는 면역 침전 실험을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 (유사한) 기술로 인해 이러한 기술에 내재 된 세척 단계로 측정 할 수있다 친화의 범위 (낮은 마이크로 몰과 높은 친 화성을) 제한됩니다. 이러한 &quot;엔드 포인트&quot;기술은 종종 큰 생물학적 결과의 일시적인 또는 선호도가 낮은 상호 작용을 식별 할 수 없습니다. 또한, 이러한 접근 방식의 시간 해상도는 극도의 반응 속도보다 느리다 보통 수주 제한된다. SPR은 인해 높아진 감도와 뛰어난 시간 해상도 1, 2에 이러한 단점을 극복한다. SPR과 같은, 라벨없는 방법(질량 변화를 검출 할 수있는 것이면), 분자 상호 작용은 측정 할 수있다. PPI 이외에, 그것은 광범위 단백질 - 리간드, 단백질 약물 (또는 작은 분자), 단백질 DNA, RNA 및 단백질 상호 작용 3-5을 특성화하는데 사용되어왔다. 결과 기록 및 실험 조건과 유연한 실험 설계의 신속한 수정을 가능하게 실시간에 그려집니다. SPR 기반 악기 뒤에 물리적 원리는 질량이 변화에 따라 센서면에서의 굴절률의 변화를 측정하는 광학 시스템의 이용이다. 상호 작용 파트너 (이하 리간드) 중 하나는 폴리머 매트릭스 칩과 상기 제 분자 (이하, 피검) 표면 상에 고정화 흐르게된다. 분석 물에 결합하는 리간드 칩 표면에 질량을 변화. 이러한 질량의 변화는 직접적으로 비례 표면의 굴절률의 변화에​​ 관한 것이다. 그 결과를 실시간으로 플롯 및시간의 함수로서 반응 단위 (RU)로 표시. 이러한 플롯은 sensogram이라고한다 (예를 들어, 그림 1). SPR은 상호 작용의 전체 시간 코스를 따르기 때문에, 미리 평형 운동 속도 상수는 평형 친화도에 부가하여, 유도된다. 아래에 설명 된 바와 같이, 주어진 시스템의 사전 평형 동작은 많은 정보를 보유하고, 혼자 평형보다 매우 다른 관점을 제공한다. 시스템이 교정되면, 실험은 매우 빠르며 (나노 그램 양하는 마이크로 그램) 단백질 물질의 소량을 필요로한다. 주어진 시스템의 전체 운동 정보를 수집하는 일 달성 될 수있다. SPR의 높은 민감도는 다른 기술 6을 사용 불가능 측정을 제공한다. 그러나이 감도는 위양성 데이터의 주요 원인이 될 수 있기 때문에 &#39;양날의 칼&#39;이다. 반사 지수에 영향을 미치는 요인은 기록 sensogram에 그려집니다. 같은 AP로방법은 적절한 제어는 가양를 제거하는 데 사용되어야하며, 상호 보완적인 접근 방식의 지원은 매우 좋습니다. 도 1은 NTA 코팅 센서 칩을 이용하여 SPR 실험의 진행을 도시한다. 패널에 sensogram는 NTA 매트릭스 위에 니켈 이온 (unsubtracted 데이터)의 주입을 도시하고, 패널은 BD 음성 대조군 세포로부터 유도 된 신호를 감산 한 후 데이터를 표시. 빨간색과 파란색 화살표는 각각 주입 시작과 끝을 보여준다. 분사가 종료 될 때까지의 칩 상에 리간드를 고정화 서서히 질량을 변경한다. 리간드의 분사 종료 후 관찰 안정 고원 표면 (그림 1B, 사이클 2)에 대한 리간드의 안정적인 관계를 반영한다. 안정한 기준선이 달성되면 버퍼 리간드 마도 주입 &#39;빈 제어 &quot;로서 기능 레퍼런스 셀 (사이클 3도 1b)을 통해 주입되고,되고분석에서 차감. 주입하면, 작은 변화는 칩을 통해 대량의 흐름을 반영, 기록됩니다. 그러면 별도의주기 (도 1b, 4 사이클)에서, 분석 물을 주입하고; RU의 점진적 증가는 리간드 분석의 관계를 나타냅니다. 평형에 도달 할 때까지 결합 부위가 점차 점유해진다. 즉시 분사가 종료로, RU에의 감소는 복잡한의 분리를 반영합니다. 미리 평형 평형 속도 상수가 도출 될 수 sensograms부터. (후에 참조) (1) 분석 물과 리간드 사이의 일시적인 상호 작용을 도시도. 상호 작용이 더 안정되면, RU 수준의 감소는 더 낮은 K D를 반영 느리다. 여기서 우리는, 동종의 기판 -6,7- 단백질 결합 막 수송 체 (세제가 용해) 및 그 기능 파트너 간의 상호 작용을 특성화 목표 SPR 실험을 설명한다. 선택 모드엘 시스템은 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 수송, Archeaglobus 오글로 부스 풀기 두스의 ModBC-A이다. 이 시스템은 요금 &#39;온 / 오프&#39;, 그 재현성이 높은 결과 잡음비 높은 신호를 선택하고, 고전 하였다. 또한, 동체 ABC 트랜스 포터는 중요한 부정적인 컨트롤을 제공 할 수 있습니다. 수송 체는, ModBC (리간드)을 세제, 정제 상에 고정화 칩을 이용하여 막으로부터 추출 하였다. 그 용해 작용 파트너 모다는 피 분석이다. 음성 대조군 리간드, 다른 ABC 트랜스 포터는 RbsBC ( &quot;리간드 B&quot;)를 사용한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

본원에 기재된 시스템에서는, NiNTA 칩 그의 태깅 막 수송 -6,7- 고정화하기 위해 사용된다. 호모 다이머이기 때문에, 각각의 수송은 이중 그것 NiNTA 칩에 결합 개선, 태그됩니다. 니켈로드, 리간드 (관심 수송)을 따라하는 것은 RU 3,500 ~까지 된 Fc = 2에 고정화 (프로토콜주기 2, 그림 2A 블랙 라벨). 다음에, 동일한 흐름 및 분사 기간, 리간드 B (제어 리간드)를 사용하는 것은 초기까지...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다.

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.5K 조회수.  The Technion-Israel Institute of Technology.  표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다. 

비디오: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

연구

생물학

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

형광 공명 에너지 전송과 리간드 - 수용체 상호 작용의 실시간 모니터링

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...