건강 기금 R01EY018144 국립 연구소에 의해 지원.

1. 홀로 RBP의 생산, Refolding 및 HPLC 정화 <ol><li> pET3a 벡터는 N-말단에 6x 그의 태그로 인간의 RBP에 대한 cDNA를 숨겨와 BL-21cells을 변환 할 수 있습니다. 600 nm의에서 OD까지 carbenicillin 40 ML의 LB 미디어에서 37 ° C에서 흔드는의 변화 BL-21 세포를 성장 0.5에 도달합니다. 1mM에 IPTG를 추가하여 RBP 단백질 식을 유도. 37 박테리아를 성장 ° C 앞으로 5 시간. </li><li> E.coli에서 생산 RBP는 불용성 포함 기관의 대부분이 존재합니다. 20 분 10,000 XG에 포함 기관, 펠렛 세포를 풍부하게합니다. 그런 다음 동결 융해의 2주기에 의해 다음 단백 분해 효소 억제제 5 개 ML PBS에서 얼음에 세포를 sonicate. 아래 펠렛 4에 30 분에 20,000 XG에 포함기구 ° C. 표면에 뜨는을 제거하고 얼음에 펠렛을 유지. </li><li> 10 ML 7.5 M 구아니딘 히드로 클로라이드의 sonication하여 포함 몸 펠릿을 Solubilize. 최종 C 25 MM 트리스 버퍼, 산도 9.0 및 DTT의 반 볼륨 (5 ML)를 추가10 mm의 oncentration. 힘차게 완전히 줄이고 단백질을 변성을 실온에서 하룻밤 와류 믹서에 솔루션을 섞는다. </li><li> 4 ° C.에 20 분 동안 18,000 XG에서 불용성 물질을 제거하는 단백질 솔루션을 원심 분리기 스핀 후 새로운 튜브로 표면에 뜨는 전송과 얼음에 튜브를 놓습니다. </li><li> refolding 버퍼 네 개의 볼륨 (60 ML)를 (25 MM 트리스, 산도 9.0, 0.3 MM 시스틴, 3.0 밀리미터 시스테인, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 준비합니다. 가스를 제거하다는 refolding 버퍼. 또한 희미한 붉은 빛 아래에서 에탄올에 600 μl 10 MM의 레티놀을 준비합니다. 얼음의 어둠 속에서 보관하십시오. refolding 버퍼와 레티놀 솔루션을 모두 신선하게 조리 있어야합니다. </li><li> 단백질 솔루션과 최소 30 분을위한 얼음에 refolding 버퍼를 모두 진정해. 높은 온도는 가능성이 RBP를 refolded의 품질을 줄일 수 있습니다. 한 ML의 refolding 버퍼 dropwise와 턴 10 μl 레티놀 솔루션 단백질 솔루션은 강력 얼음의 비커에 혼합되는 동안을 추가합니다. 모든 refolding 버퍼와 레티놀 때까지이 단계를 반복합니다추가됩니다. 5 시간의 어둠 속에서 얼음에 반응을 감동하세요. </li><li> 4 ° C.에 30 분에 24,000 XG에서 refolding 반응을 스핀 다운 그것은 바로 refolding 반응 후 집계를 제거하는 것이 필수적입니다. </li><li> 10 ML에 Amicon 울트라 15 농축기 (MWCO 10 K)를 사용하여 표면에 뜨는 솔루션을 집중. 이 레벨보다 더 refolded 솔루션을 집중하지 마십시오. 너무 많이 집중하는 것은 단백질 집계 될 올바르게 접혀 RBP의 최종 수율과 품질을 낮춰합니다. 차가운 PBS 100 ML에 집중 샘플을 희석. 이 단계의 목적은 니켈 정화에 영향을 refolding 반응에 구성 요소를 제거하는 것입니다. </li><li> 4 ° C.에 20 분에 24,000 XG에서 솔루션을 한 번 더 돌려 그것은 어떤 침전물을 제거하는 것이 중요합니다. 이 50 ML 튜브, PBS로 세척 된 각 함유 한 ML 니켈 NTA 슬러리에 표면에 뜨는을 전송합니다. 한 시간 동안 4 ° C에서 튜브를 회전합니다. 희석 솔루션 f를 잠복기가또는 1 시간 제거해야 misfolded 단백질의 강우량을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 3 분 500 XG에서 튜브를 스핀 다운. 조심스럽게 표면에 뜨는 제거합니다. 아무거나의 부동을 제거해야합니다. 각 튜브 30 ML에서 차가운 PBS를 추가합니다. 다시 돌리고 표면에 뜨는을 제거합니다. 당신이 튜브에 있지만 구슬 아무 것도 보이지 않을 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 빈 항목에 니켈 NTA 수지를 전송합니다. 10 MM 이미 다졸, PBS 500 MM NaCl의 20 열 볼륨과 수지를 씻으십시오. PBS 100 MM 이미 다졸의 5 열 권에 그의-RBP를 Elute. 오랜 기간 동안이 솔루션을 저장하고 냉동은 최종 수율과 품질을 감소하지 마십시오. 최상의 결과를 들어, 즉시 HPLC에 의해 RBP를 정화. </li><li> 25 MM 트리스, 산도 8.4, 120 MM NaCl에 대한 니켈 NTA 수지에서 정화 그의-RBP를 Dialyze. 농축기는 버퍼 교환에 사용할 수 있습니다. ° C 오른쪽 각 실행하기 전에 4에 10 분에 16,000 XG에서 원심 분리하여 HPLC 용 클리어 샘플. </li><li> 이온을 사용하여 HPLC에 홀로 RBP 정화교환 한 ML / 분에서 모바일 위상은 25 MM 트리스, 산도 8.4을 사용하여 NaCl 단계 기울기 (220 MM 12 분, 360 MM 15 분, 1,000 MM 15 분)에 의한 열 AX-300. NaCl 농도가 상승함에 따라 홀로 그 .. RBP는 APO-RBP 동안 출시와 RBP,이 칼럼 (그림 1)에 바인딩 숙박 misfolded 있습니다. RBP의 refolding이 최적으로 수행되지 않을 경우, RBP (예는 그림 1에 RBP-I을 misfolded) 전체 준비를 predominate 수 있습니다 misfolded. </li><li> 360 MM NaCl의 정상 분수에서 제대로 접 홀로 RBP를 복구 할 수 있습니다. 조심스럽게 올바르게 접혀와 그의-RBP를 misfolded의 용출 프로파일을 모니터링 할 수 있습니다. 1000 MM NaCl에서 대부분 그의-RBP이 출시됩니다 misfolded. </li><li> 홀로 RBP를 포함하는 분수는 풀링 집중, 4 ° C.에서 하루 아침에 PBS에 대한 dialyzed 아르 분광 광도계에 의한 최종 수율과 품질 (330 nm/280 nm 정도)를 확인합니다. 제대로 접 제품은 1 (그림 1)보다 약간 높은의 330 nm/280 nm의 비율이 있어야합니다. </li><li> produc에전자 APO-RBP는 정화 홀로 RBP에 헵탄의 동일한 볼륨을 추가, 4 ° C.에서 하루 아침에 돌려 부드럽게 섞는다 4 ° C에서 10 분 동안 16,000g에서 원심 분리기 조심스럽게 새로운 튜브 (인터페이스에서 침전물을 피해)에 하단에 수성 단계를 전송합니다. 각 3 시간에 부화를 사용하여 프로세스 세 번을 반복합니다. 330 nm의 피크가 배경 수준으로 감소가 있는지 확인하는 Nanodrop 분광 광도계에 흡수를 확인합니다. </li></ol> 2. STRA6 - 촉매 레티놀 자료와 레티놀로드의 실시간 모니터링 <ol><li> 4에 밤새 차단 카세인 (피어스) 200 μl와 검은 색 96 - 웰 Microfluor-2 판을 (열 과학) 차단 ° 플라스틱에 홀로 RBP의 특이 현상 스틱 킹을 방지하기 위해 C. 차단 카세인은 우리가 테스트 된 모든 차단 솔루션의 최고 차단 효과를 제공합니다. </li><li> 갓 STRA6 또는 제어 셀을 표현하는 세포로 만든 멤브레인은 해밀턴 주사기 (Gasti를 통해 PBS를 사용하여 세탁 및 전달PBS의 균일 한 현탁액을 생성하기 위해) 6 번 # 1710을 ght. 우리는 일반적으로 반응 당 100mm 요리에 성장 세포의 1백분의 1 1 / 20 일부터 파생 된 멤브레인을 사용합니다. </li><li> PBS 200 μl를 한 번 Microfluor-2 판의 코팅 우물을 씻는다. 막 정지 (물론 당 50 μl)의 추가 전에 얼음에 판을 냉각. </li><li> 레티놀 형광의 실시간 모니터링은 여기 필터 320ex와 방출 필터 460-10로 POLARstar 오메가 (BMG Labtech)의 형광 광학를 사용하여 측정된다. 이 프로그램은 엔드 포인트 독서 모드로 설정되어 있습니다. 시간 간격이 다양하지 않을 경우 플레이트 모드는 시간 과정을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 때마다 포인트에서 신호는 10 측정 (2 mm의 직경 궤도 평균)의 평균이며, 이익이 1800로 설정되어 있습니다. 플레이트는 각 측정하기 전에 두 번 궤도 흔들림을 사용하여 500 rpm으로 10 초에 흔들리고 있습니다. </li><li> 레티놀 릴리스 분석을 시작하려면 우물이 m을 읽는 종점을 사용하여 한 번 읽기홀로 RBP 전에 송시는 (일반적으로 1 μM 최종 농도) 0 분에 추가됩니다. 즉시 홀로 RBP이 추가로 반응은 1-3 시간에 지속적으로 모든 5-10 분 모니터링된다. 레티놀 로딩 분석, 모든 트랜스 레티놀을 (일반적으로 1 μM 최종 농도)를 시작하려면 것은 희미한 붉은 빛 아래에있는 우물에 추가됩니다. APO-RBP이 0 분에 추가되기 전에 플레이트는 한 번 읽습니다. 가능한 한 빨리 APO-RBP이 추가로 반응은 1-3 시간에 지속적으로 모든 5-10 분 모니터링된다. </li><li> 모든 측정이 완료되면, 데이터 분석 용 Microsoft Excel에 오메가 데이터 분석 소프트웨어 (BMG Labtech)에서 원시 데이터를 (그림 2에 표시된 예) 다운로드 할 수 있습니다. 때마다 포인트는 모든 실험 조건의 판독을 포함하는 파일을 생성합니다. 20 시간 포인트가있는 경우 예를 들어, 데이터 분석에 대해 하나의 엑셀 파일로 20 파일을 통합. </li><li> 데이터 분석의 경우, 0 분의 레티놀이나 홀로 RBP를 추가하기 전에 형광 신호를 배경 신호를로 간주됩니다d는 모든 시간 지점에서의 최종 형광 신호에서 차감. 배경 신호가 낮은 빼는 방법, 홀로 RBP의 레티놀 형광에 비해 있지만 배경은 멤브레인에 의한 빛의 분산의 특이 현상의 영향을 제거하고 0 분에 추가 홀로 RBP이나 레티놀의 레티놀 형광에 초점을 수 있습니다. </li></ol> 3. CRBP-I에 홀로 RBP에서 레티놀의 STRA6 - 촉매 교통의 실시간 모니터링 <ol><li> 레티놀 - EGFP 최근 41 설립 된 새로운 형광 공명 전송 (걱정) 쌍입니다. 홀로 RBP에서 EGFP-CRBP-I는 레티놀-EGFP를 측정하여 실시간으로 모니터링에 STRA6 - 촉매 레티놀 전송이 초조해. 6XHis 태그 (EGFP-CRBP-I)와 EGFP-CRBP-I 융합 단백질은 포유류의 세포에서 생산되고 실험 전에 니켈 NTA 수지에 정화되어 있습니다. EGFP-CRBP-I은 4 ° C.에서 시간의 짧은 기간 동안 단백 분해 효소 억제제와 PBS에 저장 될 수 있습니다 또는 융합 단백질 전s은 (는) -80 ° C에서 작은 aliquots에 냉동. </li><li> 반응하기 전에 차단 Microfluor-2 판 이상 설명한 바와 같이 세포막을 준비합니다. 막 정지 (물론 당 50 μl)의 추가 전에 200 μl PBS로 한 번 Microfluor-2 판의 코팅 우물을 씻는다. </li><li> 실시간 레티놀-EGFP 걱정은 동시 결투 방출 형광 광학을 사용하여 여기 필터 320ex와 방출 필터 460-10 및 510-10로 POLARstar 오메가를 사용하여 측정된다. 이 프로그램은 엔드 포인트 독서 모드로 설정되어 있습니다. 시간 간격이 다양하지 않을 경우 플레이트 모드는 시간 과정을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 때마다 포인트에서 신호는 10 측정 (2 mm의 직경 궤도 평균)의 평균이며, 게인은 채널 당 1800로 설정되어 있습니다. 플레이트는 각 측정하기 전에 두 번 궤도 흔들림을 사용하여 500 rpm으로 10 초에 흔들리고 있습니다. </li><li> 반응, EGFP-CRBP-I (일반적으로 1 μM 최종 농도)를 시작하려면하는 것은 우물에 추가됩니다. 플레이트에서 읽을 수 있습니다홀로 RBP하기 전에 엔드 포인트 독서 모드를 사용 CE는 0 분에서 추가됩니다. 즉시 홀로 RBP이 추가로 반응 측정하여 지속적으로 1-2 시간마다 5-10 분 모니터링된다. </li><li> 모든 측정이 완료 한 후, 위에 설명 된대로 데이터 분석 용 Microsoft Excel에 오메가 데이터 분석 소프트웨어의 원시 데이터를 (그림 3에 표시된 예) 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> 레티놀-EGFP는 수용체 / 기증자 방출 피크 (47)의 비율로 동적 변경에 의해 계산됩니다 초조해. 이 비율을 계산하는 방정식 41은 [(510t -510 B) / (460t -460 B)], 어디에서 510t, 510 B, 460t, 그리고 460 B는 반응 개시 후 510 nm의에서 배출량을 나타냅니다 ( t = 시간 지점), 레티놀이나 홀로 RBP 전에 510 나노 미터에서 반응 (t = 시점)의 개시 후 460 nm의에서, (B = 배경) 추가하고, 레티놀이나 홀로 RBP 전에 460 nm의에서 추가됩니다 (B = 배경), 각각. </li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

RBP 생산 및 정화 절차를 제대로 접 RBP을 생성에 중요한 때문에 우리는 여기서 최적화 된 RBP 생산 프로토콜을 공유 할 수 있습니다. misfolded RBP 종의 가능성과 RBP를 세균 제작도 HPLC 정화에 세균 단백질의 추적 금액의 존재 감안할 때, 그것은 RBP에 관한 결론을 확인하기 위해 혈청에서 기본 RBP를 사용하는 도움이됩니다. 상업적으로 사용할 수 있습니다 소변 RBP는 APO-RBP와 홀로 RBP 48,49 등의 RBP...

비타민 A는 인간의 생존과 거의 모든 인간의 장기의 적절한 작동을 위해 필수적이며 유기 분자이다. 비타민 A 유도체 (retinoids)는 비전 1,2 및 배아 발달 동안과 성인 조직 3-6 유전자 발현과 단백질 번역 조절을위한 빛의 감지 등 다양한 생화학 및 세포의 행사에 참여하고 있습니다. 레티놀이 체계적으로 확산 할 수있는 능력을 가지고 있지만, 진화는 플라즈마 레티놀 결합 단백질, 비타민 높은 효율성과 특이성을 달성하고 7-10 임의의 확산과 관련된 독성을 피하기 위해 혈액에서 교통에 대한 특정 캐리어 단백질을 세웠 어. RBP에 바인딩과 비타민을 차지 고친 화성 수용체가이 1970 년대 11-13에 가설되었다. RBP 수용체 14-31의 존재에 세 수십 년 동안 축적 된 증거에도 불구하고, 수용체 가설 인해 existenc에 몇 년 동안 논의되었습니다홀로 RBP의 잘못된 정의 5. 홀로 RBP의 올바른 정의는 레티놀과 RBP 사이의 높은 연관성 1:1 복잡한 것입니다. 유기 용매에 의한 홀로 RBP의 반복 추출 APO-RBP를 생성 할 필요가 있습니다. 이 정의는 RBP 7,9,32-35 또는 RBP 수용체 14-31,36-42를 공부 거의 모든 실험실에서 사용됩니다. RBP 수용체의 존재를 증명하는 데 사용 된 홀로 RBP의 잘못된 정의는 APO-RBP 무료로 레티놀의 급성 혼합입니다. 비타민의 RBP 수용체의 기능 때문에 홀로 RBP의 이해는 홀로 RBP의 레티놀을 공개하는 것입니다 레티놀은 (같은 홀로그램의 잘못된 정의에 의해 제안으로 시작하는 무료있는 경우, RBP 수용체는 레티놀 이해에 더 역할을하지 않을 - RBP). multitransmembrane 도메인 단백질 등의 RBP 수용체의 최근 식별이 STRA636 전화를 비타민에서의 기능은 홀로 RBP 36-43에서 호응을 강력히 RBP하지 않는 가설에 대한 주장STRA6이 intracellularly 40에 위치한 구 transmembrane의 extracellularly있는 N-말단과 도메인과 C-말단를 가지고 계시 비타민 A. 자세한 분석을 제공하는 수용체가 필요합니다. transmembrane 6과 7 사이에 위치한 것은 필수 RBP 구속력을 도메인 39입니다. STRA6는 LRAT과 비타민 홀로 RBP의 이해에 CRBP-I 모두에 커플 링하지만, LRAT도도 CRBP-I는 절대적으로 강화 STRA6 활동을 41 필요합니다.합니다 홀로 RBP에서 레티놀 자료를 catalyze하는 STRA6의 능력은 비타민 A 통풍 관 활동을 41의 핵심입니다. 의 레티놀을 발표 할 STRA6에 의존함으로써, 비타민 RBP의 게재는 비타민 A 높은 특이성과 효율성과 주변 조직의 세포를 타겟팅 할 수송 할 수 있습니다. 홀로 RBP 정의와 준비의 중요한 중요성은 홀로 RBP 정의 DIF에 따라 세 관련 최근 논문으로도 RBP 수용체의 존재에 대한 역사적 논쟁이 아니라 그림이되지만,원본과 올바른 정의 44-46에서 ferent. 첫 번째 논문은 RBP 수용체에게 44 공부를 할 수있는 RBP 수용체의 존재를 승인하는 데 사용 된 홀로 RBP 정의를 사용했습니다. 두 번째 및 세 번째 논문은 훨씬 가능성이 레티놀에 대한 공부를했다 RBP 45,46과 적절한 복잡한을 형성하기 위해 만든 홀로 RBP의 세 번째 정의를 내놓았다. 이 연구는 3 H-레티놀과 함께 홀로 RBP를 (도 못 APO-RBP) 혼합하여 3 H-retinol/RBP을 준비했습니다. 이 분석 3 H-retinol/RBP이 형성되고 과도한 무료 3 H-레티놀 45,46를 제거하지 않은이 없었 때문에, 3 H-retinol/RBP에서 3 H-레티놀의 이해를위한 분석되지는 않지만 무료입니다 3 H-레티놀 확산 분석. 그것은 STRA6이 LRAT 38 또는 CRBP-I 41에서 무료로 레티놀의 세포 이해를 강화하지 않는 이전에 표시되어 있습니다. 거의 모든 레티놀은 혈액에 RBP에 바인딩되며 감지가 fre 없습니다전자 레티놀. RBP 수용체의 주요 기능은 홀로 RBP 41에서 레티놀의 이해 동안 홀로 RBP에서 레티놀 출시를 catalyze하는 것입니다. 레티놀은 인위적으로 발표 또는 45,46로 시작하는 자유 형식에 경우, RBP 수용체가 필요하지 않습니다. 올바르게 홀로 RBP는 RBP의 올바른 준비를 보여주는 준비에 따라 assays에 비해 무료 레티놀 확산 분석에서 얻은 크게 다른 결과는 기능 assays에 대한 중요합니다. RBP는 인간의 혈청 41에서 정화하지만, 절차는 복잡하고 수율이 낮 될 수 있습니다. 다른 방법은 E.에 RBP을 생산하는 것입니다 대장균. 때문에 E. 대장균이 제대로 RBP 같은 이황화 채권의 하나 이상의 쌍 포유류의 분비 단백질을 접는 할 수있는 능력이 없습니다, 그것은 refold RBP와 올바르게 접혀 단백질을 정화하는 것이 필수적입니다. Misfolded 단백질은 다르게 다양한 assays에서 수정 접힌 RBP에서 동작하지뿐만 아니라, 저장 중 단백질 집계을 유발할 수 있습니다. 같은 이유로, APO-RBP은 높은 품질의 홀로 RBP에서 생산된다. 우리는 고품질의 RBP에게 세균 표현, refolding 및 HPLC 정화를 통해 레티놀과 함께로드 100 %를 생산하려면 여기를 최적화 프로토콜을 설명합니다. HPLC 정화가 잘못 접 RBP뿐만 아니라, RBP는 신호 전달의 assays에 사용하는 경우 심각한 유물을 일으킬 수 있습니다 중요한 세균 오염을 제거뿐만 아니라. 우리는 또한 STRA6으로 레티놀 전송을 공부하는 두 민감한 실시간 모니터링 기술을 설명합니다. 두 기술은 고품질의 RBP에 따라 달라집니다. 공간 제한으로 인해 방사능 retinoid 기반 및 HPLC 기반 비타민의 고전 기법을 이해의 assays는 여기에서 설명하지 않습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 구아니딘 히드로 클로라이드 </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> 시스틴 </td><td> 시그마 </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> 시스테인 </td><td> 시그마 </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 어부 </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 </td><td> 어부 </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> 레티놀 </td><td> 시그마 </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> 어부 </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 어부 </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> 니켈 NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> 이미 다졸 </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> 헵탄 </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> 차단기 카세인 </td><td> 찌르다 </td><td> 37,528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon 울트라 15 농축기 (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 판 </td><td> 어부 </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> 해밀턴 주사기 Gastight # 1710 </td><td> 어부 </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

비타민 A는 시력을 위해 필수적이며, 성장 / 거의 모든 인간의 장기 차별화. 플라즈마 레티놀 결합 단백질 (RBP)은 혈액의 원칙과 비타민의 특정 항공사입니다. 우리는 여기 생산하고 고친 화성 RBP 수용체 STRA6에 의한 비타민 A의 전송을 공부하고 홀로 RBP와 두 개의 실시간 모니터링 기술을 정화 할 수있는 최적화 된 기술을 설명합니다. 첫 번째 기술은 가능한 고품질 비타민에 홀로 RBP (100 레티놀과 %로드) A 교통 assays의 대량 생산 할 수 있습니다. RBP 자료 비타민 RBP 준비에 쉽게와 세균 오염 유물을 일으킬 수 misfolded 있기 때문에 우수한 품질의 RBP는 기능 assays를위한 필수적입니다. 전기 생리학 등의 실시간 모니터링 기술은 막 수송의 연구에 중요한 공헌을 만들었습니다. RBP 수용체 - 매개 레티놀 전송은 실시간으로 최근까지 분석되지 않았습니다. 여기에 설명 된 두 번째 기술은 정말이에요이다STRA6 - 촉매 레티놀 자료 나로드의 L-시간 분석. 세 번째 기술은 홀로 RBP에서 세포의 레티놀 결합 단백질 I (CRBP-I)에 STRA6 - 촉매 레티놀 전송의 실시간 분석이다. 이 기술은 RBP 수용체의 비타민 A 이해 메커니즘을 드러내는 높은 감도와 해상도를 제공합니다.

우리는 홀로 RBP와 레티놀을로드하는 APO-RBP로 (그림 2)와 실시간 분석에서 STRA6 - 촉매 레티놀 자료의 HPLC에 의한 홀로 RBP 생산 및 정화 (그림 1), 실시간 분석을 보시려면 여기를 대표 결과를 제공 홀로 RBP에서 EGFP-CRBP-I에 STRA6 - 촉매 레티놀 전송 (그림 3). 거의 대부분 잘못된 이황화 채권의 존재로 인해 misfolded됩니다 refolding없이, RBP는 박테?...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

여기 고품질의 비타민 A / RBP의 복잡하고 STRA6, RBP 수용체가 비타민에게 교통편을 공부하는 두 실시간 모니터링 기술을 생산하는 최적의 기술을 설명합니다.

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K 조회수.  University of California, Los Angeles. 여기 고품질의 비타민 A / RBP의 복잡하고 STRA6, RBP 수용체가 비타민에게 교통편을 공부하는 두 실시간 모니터링 기술을 생산하는 최적의 기술을 설명합니다.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

연구

생물학

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

형광 공명 에너지 전송과 리간드 - 수용체 상호 작용의 실시간 모니터링

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...