우리는 시스템 microfluidic 장치를 설계에 대한 조언과 설치의 가공 부품 하버드 대학에서 롤랜드 연구소에서 직원 조슈아 에델 개발에 자신의 도움을 Chandran Sabanayagam 감사합니다. 우리는 유용한 정보를 UIUC에서 유용 롤랜드 연구소와 보스턴 대학에서 멜러 그룹의 회원들과 토론하고, T. 하의 그룹의 구성원을 인정합니다. 마지막으로, 우리는 국립 과학 재단 (PHY - 0701207) 및 보건 국립 연구소 (GM075893)에서 재정 지원을 주셔서 감사합니다.

1 - microfluidic 셀을 조립 microfluidic 세포가 융합하여 만든 패턴, 갓 청소 석영 커버 슬립에 두께 2mm, polydimethylsiloxane (PDMS) 디스크. PDMS 디스크는 버퍼의 제어 흐름, 각각 버퍼 저수지와 주사기 펌프에 연결된 입구와 콘센트 유연한 모세 혈관으로 액세스할 4 가지 30 μl 사각형 실이 포함되어 있습니다. 흐름 세포는 유리 창문하여 뒷면에 지원하고 온도를 조절하기 위해 열전 요소를 냉각 물을 포함하는 사용자 정의 만든 셀 홀더에 배치됩니다. <ol><li> 패턴 PDMS 디스크를 만들려면 1 부분 경화 에이전트 10 부품 실리콘 엘라스토머 기지를 섞어 잘 혼합하고 진공에서 1 시간 동안 degassing 둡니다. </li><li> 부드럽게 microfluidic 전지 금형에 엘라스토머 믹스를 부어. 우리의 경우, 이것은 부정적인 포토 레지스트로 만든 네 스트립 (1x10 1x10 4 X 3 X 300 μm의)와 1 &quot;실리콘 웨이퍼이다. 70 뜨거운 접시에 치료 맡겨 ° C가 두 시간 동안. </li><li> 조심스럽게 면도날을 사용하여 금형의 치료 PDMS 디스크 껍질. 30 초 동안 양쪽 표면을 산화 플라즈마에 의해 1 &#39;유리 창 (채널의 양쪽에 8 X 2mm 지름 사전 뚫고 구멍을 포함)에 디스크를 융합. PDMS 디스크의 평면쪽으로 유리 창문을 (채널을 포함하지 않는 측면) 퓨즈. </li><li> 이 채널에 도달할 때까지 각각의 유리 창문의 구멍을 통해 2 인치 긴 유연한 융합 실리카 모세관 튜브를 삽입합니다. 먼저 바늘을 삽입 후 모세관과 함께 다음과 같은 것은이 과정을 촉진 수도 있습니다. 퀵 - 캐스트와 같은 빠른 경화 실리콘 주조 화합물을 사용하여 유리 창 구멍을 밀봉합니다. </li><li> 에탄올과 물을 채널 린스, 30 초 동안 갓 청소, 1 인치 원형 석영 커버 슬립과 함께 셀 플라즈마 활성화. 우리는 피라 냐는 물고 기지 너한테 줄을 사용하여이 표지 전표 청소 제안 *. 챔버 스를 밀폐, 채널을 포함하는 세포의 측면에 커버 슬립을 후세. </li><li> 실온에서 하룻밤 치료 조립 세포를 남겨주세요. </li></ol> * 피라 냐가 H 2 O 2, H 1:2.5 비율 2 SO 4의 솔루션입니다. 커버 전표를 청소하려면 90에서 피라 냐는 물고 기지 너한테에 젖어 ° C를 20 분. 2 - 분자 고정을 위해 표면을 활성화 핵산 연구의 경우 단순한 표면 고정 제도는 먼저 코팅의 유리 또는 biotinylated 소 혈청 (BSA) 알부민 후 streptavidin과 함께 석영 커버 슬립을 구성되어 있습니다. 이것은 biotinylated 샘플은 상온에서 일 높은 특이성과 함께 움직일 수 있습니다. <ol><li> 주사기와 바늘을 사용하여 쉽게 버퍼 주사에 대한 모세 혈관 유연한 튜빙을 연결합니다. </li><li> 0.1 버퍼 biotinylated BSA의 MG / ML의 솔루션을 주사 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 50 MM NaCl는 0.02 μm의 필터를 사용하여 필터링) 적어도 30 분 채널과 부화에. </li><li> 버퍼의 흐름 300-500 μl은 챔버 내부에 기포가 트랩되지 않도록주의하고, 채널에서 모든 무료 biotinylated BSA를 제거합니다. </li><li> 0.1의 솔루션을 주사 버퍼에 MG / streptavidin의 ML 15 분 알을 품다. 그런 다음 3 단계를 반복합니다. </li><li> biotinylated 샘플의 3-5 PM 솔루션을 통해 흐름. 형광 분자의 범위를 확인하기 위해 표면 검사를 수행합니다. 필요하다면, 더 나은 보험을 얻기 위해 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 10 분 부화하고 3 단계를 반복합니다. </li></ol> microfluidic 세포는 광학 인코딩 DC 모터를 사용하여 정밀 (최대 25mm) 운동을 허용하는 전동 XY 스테이지에 탑재하고, 고급 (1 NM) 모션 두 폐루프 압전의 액츄에이터를 사용하는 (Physik Instrumente 모델 M - 014 또는 이와 유사한 것). 이 중 앞이나 샘플 고정을 위해 표면을 활성화하면 할 수 있습니다. 3 - 이미징의 버퍼 (IB)를 준비 IB는 Trolox으로 효소 산소 청소 시스템과 트리 플렛 끄는로 이루어져 있습니다. IB가 지속적으로 하룻밤을 통해 플러시되기 때문에, 적어도 10 ML은 사전에 준비되어야합니다. <ol><li> 0.8 % 10 ML W / V D - 글루코오스, 적어도 35 MM 트리스 - HCL 산도 8.0 탈이온수에 NaCl 50 MM를 준비합니다. 버퍼의 높은 농도는 두 가지 이유 때문에 중요하다 : 해소 Trolox는 솔루션을 시어지다되며, 효소 반응은 시간이 지남에 따라 솔루션의 산도를 낮춰드립니다. 이 솔루션은 긴 수명을 가지고 있기 때문에 그것은 주식 솔루션으로 저장할 수 있습니다. </li><li> 몇 분 동안 vortexing 후&gt; 10 분 흔들어하여 1 단계에서 준비 버퍼에 Trolox 5 MG를 디졸브. Trolox는 산도&gt; 7 시에 물에 매우 용해되지 않으므로이 단계를 서두 르 지마. 0.2 μm의 필터와 10 분 진공 degassing두고 사용하여 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 60 μl 웨이트를 혼합하여 &quot;gloxy&quot;효소 솔루션을 준비R, 5 배 버퍼 A, 카탈 라 아제 20 μl, 1 MG 포도당 산화 효소와 10 100 μl가 MG / ML BSA 20 μl. 0.22 μm의의 원심 분리기 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 부드럽게 공기 거품의 형성을 피하기 위해 3 단계에서 &quot;gloxy&quot;솔루션과 함께 2 단계에서 버퍼를 섞는다. </li><li> 흐름 속도를 제어하는​​ 기계 주사기 펌프를 사용하여 5 μl / 분 일정한 속도로 채널을 통해 IB를 흐름. 버퍼로 다시 용해에서 대기 산소를 방지하기 위해 IB 저수지에 거품이 아르곤 가스. </li></ol> 표면 검사, 단일 분자 강도 흔적의 분자 현지화 및 인수는 자동 데이터 수집 1 수 LabView 프로그램에 의해 제어됩니다. 이 프로그램은 0.1 μm의 / MS의 속도, 0.2 μm의 해상도에서 20x20 μm의 두 영역을 검색합니다. 데이터는 즉시 강도 - 가중 배경 카운트 위의 모든 픽셀의 위치를​​ 얻을 수로 처리됩니다. 고정화 분자가 발견되면, 그들은 공촛점 볼륨 및 기증자와 수용체의 형광단의 농도로 하나 하나가 모두 fluorophores의 photobleach 때까지 시간의 함수로 기록 이동됩니다. 단계는 다음 100 μm의 거리에 새로운 기원로 이동 프로그램이며, 스캔 과정은 반복됩니다. 4 - 대표 결과 아래 표면 활성화 이전과 분자 고정 준비 현미경에 장착 후에 조립 microfluidic 세포를 보여주는 몇 가지 이미지가있다. 채널이 성공적으로 활성화되면, 표면 검사 직접 기증 여기 후 기증자 염료 (녹색)와 수용체 (빨간색)의 방출을 보여주는 아래 그려져 스캔과 유사해야합니다. 이러한 분자는 탐색 볼륨으로 하나씩 이동하며 형광이​​ 두 염료의 photobleach 때까지 시간이 지남에 기록됩니다 단일 분자 흔적에 표시됩니다. 다음과 같은 성분부터 차례로 생물 학적 관심의 분자의 구조와 역학을 탐구하는 데 사용되는 순간 기증자 - 수용체의 분리에 알려줍 걱정 효율성을 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /> 그림 1 : 네 채널 Microfluidic 세포, 입구 / 출구 모세 혈관 각. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /> 그림 2 : 측정 준비 현미경에 장착 휴대폰. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="그림 3" border="0" /> 그림 3 : SM - 안달 측정을위한 설정. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">여기를 클릭</a> 그림 3의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="그림 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="그림 5" border="0" /> 그림 4와 5 : 고정의 표면 검사의 빨간색과 초록색 채널 녹색 레이저로 흥분 분자를 무서워. 더 큰 버전을 보려면 클릭하세요 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">그림 4</a> , 또는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">그림 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="그림 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="그림 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="그림 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="그림 9" border="0" /> 피규어 6, 7, 8, 9 : 기증자의 강도 궤도 (녹색)와 DNA 분자 8, 10, 16, 간격 18 basepairs에 표시된 수용체 (적색) fluorophores. 의 더 큰 버전을 보시려면 클릭하세요 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">그림 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">그림 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">그림 8</a> , 또는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">그림 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

위의 프로토콜의 특정 시스템 및 염료 (TMR 및 ATTO647N)의 구체적인 선택을 위해 최적화되어 있지만, 그것없이는 유일한 입증 방법을 의미하는 것입니다. 최근 protocatechuic 산성 (PCA) / ​​protocatechuate - 3 ,4 - dioxygenase (PCD)의 구성 대체 산소 청소 시스템은 특정 염료 4 photostability를 증가 표시했다. 이들은 특히 Cy5 5, 일부 염료의 지속적인 점멸을 억제하지 않을 수도 있지만, 이와 같은 β - 메르 캅 토 에탄올 (BME) 같은 다른 플렛 - 상태 quenchers는 대신 Trolox에 사용할 수 있습니다. (BSA) 비오틴 - streptavidin - biotinylated 소 혈청 알부민을 통해 고정이 핵산 연구에 대한 선호하는 선택지만 그것이 아닌 구체적인 접착력 1 방지할 수 있기 때문에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 코팅 표면이 좋은 단백질의 연구에 가장 적합합니다. 또한 하위 회절 - 제한된 크기 vesicles 그것은 표면의 상호 작용 6에 의해 영향을받을 수있는 경우에 관심 생분자을 캡슐 화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 형광 강도 흔적를 얻기위한 실리콘 애벌란치 photodiodes 갖춘 공촛점 설정을 사용합니다. 이 프로토콜은 CCD 카메라가 장착된 총 내부 반사 형광 현미경의 (TIRF)와 동일하게 작동합니다. 에 관계없이 현미경의 사용, 기증자 및 수용체의 신호가 올바르게 7 수정 때 앵스트롬 접근 공간적 해상도에 알려줄 수 SM - 초조해.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

형광 공명 에너지 전달은 (무서워) 현미경이 널리 등 핵산 및 단백질과 같은 생물 학적 관심 분자의 구조와 역학을 연구하는 데 사용되었습니다. 단일 분자가 고정화 분자의 (SM - 프렛) 측정을 걱정하는 것은 오랜 관찰을 허용 시스템 효과적으로 모두 염료가 시간 흔적으로 photobleach - 결과까지 그 분 밀리초에서 timescales 광범로 biomolecular 역학에 대한 리포트입니다. 통계 분석에 대한 흔적을 다수의 인수를 촉진하기 위해 프로세스가 자동화되어야하며 샘플 환경을 단단히 전체 측정 시간 (~ 12 시간)를 통해 제어되어야합니다. 이것은 단일 분자의 수천의 심문은 밤새 수있는 자동 스캔 공촛점 현미경, 그리고 제한된 산소 컨텐츠와 버퍼의 제어 교류를 허용하고 전체 측정 기간 동안 일정한 온도를 유지 microfluidic 세포를 사용하여 수행됩니다. 여기서 우리는 microfluidic 장치를 조립하는 방법과 DNA를 고정에 대한 표면을 활성화하는 방법을 보여줍니다. 그럼 우리가 fluorophores의 photostability과 수명을 최대화하기 위해 버퍼를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 시간이 해결 단일 분자의 자동 수집을 위해 설치 준비에 관련된 단계는 DNA 분자의 흔적이 무서워 보여.

Watch this Scientific Journal Video about Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules at JoVE.com

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K 조회수.  Boston University. 이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

비디오: Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

연구

생물학

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

원자력 교통 단일 분자 이미징

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

절연 및 Chlamydomonas Centrioles의 단일 입자 재건을 위한 형광 이미징

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...