This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에서 소개 뇌허혈 모델은 높은 재현성 경색 볼륨이 24 ~ 48 시간과 다른 접근 방법 8,15,17으로 MCA 결찰 후 7 일 결정 제공합니다. 이 MCAO 모델 연구에 사용 된 동물의 수를 최소화하는 다른 사람에 비해 낮은 사망률 (1 % 미만)을 갖는다. 사망률이 낮은 비율을 얻기 위해 중요한 단계 뇌졸중 유도 후 생존에 손상을 줄 수있는 감염을 방지하기 위해 적절한 무균 상태를 유지하는 것이다. 이 MCAO 모델은 또한 원하는 시간 매듭 후방 재관류 CCA 및 MCA 과도 결찰술 일시적인 모델로서, 병진 연구 18 임상 관련 모델 간주 영구 MCAO 모델로서 이용 될 수 없다 19. 이 방법은 성공적으로 마우스 및 래트 17,20 사용되어왔다. 이 모든 증거는 결찰에 의해 MCAO 여러 응용 프로그램과 뇌경색의 높은 다양한 모델을 나타냅니다. criti이 기술의 CAL 단계는 실체 현미경 침습 수술을 필요로한다는 것이다; MCA뿐만 아니라 광대뼈 손상되지로서 개두술은 매우 신중하게 수행되어야한다. 그러나 가짜 동물의 사용 수술에 의존하는 효과를 구별 할 수있는 유용한 도구가 제공 (수술하지만 CCA와 MCA 결찰을 실시한다 수행되지 않습니다). 이 기술에 따라 뇌 손상의 정도는 다양한 방법에 의해 정량화 될 수있다. 뇌 절편, Nissl 염색 및 카발리 의한 체적의 후속 추정 우리 프로토콜은 손상된 영역의 정확한 정량 분석​​이 가능하며 직렬 뇌 섹션이 또한 서로 다른 면역 분석에 이용 될 수 있기 때문에, 연구의 이러한 유형에서 사용 된 마우스의 수를 최소화한다. 이 방법론의보다 나은 성능이 Stereology를 소프트웨어에 사용 된 적절한 파라미터를 선택하는 것이 중요하다 (표 1) 번째를 추정 할 필요식 상이한 영역의 전자 량 : V = 1 / SSF는 * f를 * t의 *의 ΣP 난 (SSF는 t가 섹션의 평균 두께, 슬라이스 샘플링 분획이고, f는 그리드 간격의 면적이며 ΣP 구조 타격 포인트의 수). 결찰술 원위 MCAO은 백혈구 침윤 및 면역 세포 아 집단 뇌 손상 1-4 다음 염증 과정에 참여하는 8, 13를 특성화하는 것이 유용 할 수있다. 여기서는 뇌 면역 세포 특성화, 정확한 접근법 stereological 나은 여러 백혈구의 아 집단을 특성화 유세포 분석을위한 두 가지 방법을 제안한다. 직렬 뇌 절편을 살려, 호중구의 총수의 정량화 세포 샘플 재치 수의 세포의 총 수를 추정 광학 분별 법 (16)에 의해 달성 될 수있다하 방향 X에 편견 가상 계산 공간 사이의 균일 한 거리와 우리의 경우, 경색 영역을 관심의 전체 영역을 커버 편견 가상 계산 공간의 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 세트, Y 및 Z를이 방법에 대한 정확한 도구를 제공합니다 결찰 후 서로 다른 시간에 허혈성 뇌에 총 호중구 수를 추정한다. 이 본 연구에 도시되지 않았지만,이 프로토콜은 또한 허혈 21 후에 다른 침윤 백혈구 등의 허혈성 뇌에서 발견 된 임의의 다른 세포 집단의 정확한 정량 다른 호중구 개체군의 추정을 위해 사용될 수있다 (단핵구 / 대 식세포) 또한 생존 신경을 추정 또는 뇌졸중 후 신경의 정량. 것들 허혈 영역에서 호중구 부량 표 3에 나타낸 바와 같이, 원하는 영역의 정확한 추정을위한 가장 중요한 단계는, 해당 변수의 선택이다.이러한 매개 변수는 (ΣQ- 함께 카운트 세포의 총 수이고 N = ΣQ- X 1 / SSF X 1 / ASF X 1 / TSF를 수학 식을 이용하여 전체 포지티브 세포 수 (N)를 계산하는 Stereology를 소프트웨어에 사용될 분별, SSF는 ASF 샘플링 면적 분율이고, TSF는 샘플링 분획 두께) (5)이고, 부 샘플링 비율이다. 이 방법론은 다른 정량화 기법보다 느리지 만 (예를 들어, 조직, 대표적인 이미지 또는 필드 당 호중구 수의 밀도 측정의 MG 의한 호중구 마커의 분석), 그것은 공평하고 정확한 제공 고체 기법이 될 수있는 장점을 갖는다 세포 수의 정량. 뇌 백혈구 분리 방식은 바이어스 할 필요 생체 염색 또는 유전자 조작에 의해 시스템이없는 동시 식별 및 여러 면역 세포 아형의 정량화 수 있습니다. 특징 골수 페이지에서 정렬 이후 세포opulations 또는 면역 자기 분리가 이러한 유전자 또는 단백질 발현에 대한 추가 연구 하류 여러 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 방법으로 얻은 호중구, 단핵구 및 미세 아교 세포의 정확한 특성은 면역 조직 화학적 연구, 뇌의 선천성 면역 반응을 매개하는 다른 골수 세포에 특정 기능을 할당 할 수있는 장점으로 기존의 방법에 대해 높은 특이성을 제공합니다. 또한, 추가로 혈액 태어난 식세포 (는 CD11b + CD45 하이 CD68 +)와 같이, 적절한 라벨 다른 뇌 개체군을 특성화하도록 확장 될 수 있으며 다른 CNS 병리 또는 부상의 연구에 적용 할 수있다. 따라서이 기술은 뇌의 염증 반응의 이질성을 탐구하는 필수적인 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 제한을 변경할 수있는 새로운 뇌 조직으로부터 백혈구 현탁액의 제조에 상주세포 또는 항원 변경의 활성화 상태. 이 기술은 면역 조직 화학 연구에 비해보다 상세한 정 성적 특성 분석을 할 수 있지만, 그것은 세포의 분리에 기초하여 덜 정확한 정량화를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 우리 세포 격리 프로토콜의 효율은 다른 출판 방법론 9 유사하고이를 효율적으로 제어하고 MCAO 그룹 사이 또는 심지어 다른 처리 8 실시 MCAO 그룹 사이의 뇌 면역 세포의 수의 차이를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 해부 조직, 조직 파괴 절차 및 미엘린 제거한다. 조직 수집에 대해서, 정규화 단계 인해 상이한 박리 성능에 변동을 피하기 위해 (수집 된 조직을 칭량) &#39;도 포함될 수있다. 또한, 다른 그룹 사이 MCAO 정규화는 경색 량 통해 발생할 수 (미리 자기 R에 의해 결정esonance). 이 문제를 해결하는 또 다른 방법은 허혈성과 대조군의 전체 동측 반구를 사용하거나, 심지어 사용 된 동물의 수를 최소화하는 대조군으로서 마우스의 허혈성 반구 반대측을 사용하는 것이다. 이 방법은 각 절개 차이점을 회피 동안, 주요 단점이있다; 희석 배수는 독점적 동측 피질의 코어 및 경색 주변 영역에있는 골수 세포의 수를 셀의 총 개수를 증가 아니지만 의해 부가된다. 조직 파괴에 대해서는,이 프로토콜은 뇌 세포의 기계적 파쇄 단계 효소 처리를 방지하고 표면 항원 변조 9,22, 염증 세포 개체군의 추가적인 정성 및 정량 분석을위한 필수적인 문제를 방지를 나타낸다. 관심의 세포 현탁액의 제조뿐만 아니라, 뇌 샘플로부터 미엘린 제거 downst와의 간섭을 피하기 위해 추천 단계는이러한 면역 자기 세포 분리 또는 세포 계측법 (23, 24) 흐름으로 연 응용 프로그램. 이것은 여러 가지 방법, 예컨대 수크로오스 또는 퍼콜 구배, 또는 항 미엘린 비드를 사용하여 달성 될 수있다. 여기, 세포 수율을 개선하는 데 사용됩니다 수초를 제거하는 퍼콜 사용과 함께 뇌 세포 현탁액 분리, 기계적 중단을위한 다른 방법을 비교하고 25 생존 이전의 연구를 기반으로.

형태 학적 표현형 및 미세 아교 세포 유전자 발현의 변화뿐만 아니라, 혈관 외 유출 및 haematogenous 식세포의 활성화 및 호중구가 뇌 손상 1-4 다음 병리 생리 캐스케이드에서 핵심적인 역할을 수행 할 것으로 생각된다. 이 프로토콜은 두 가지 방식 허혈성 뇌 골수 세포의 다른 서브 세트들의 수를 추정하고 자신의 표현형을 특성화를 수행하기 위해 제공한다. 또한, 또한, 방법 경색을 평가 포함 원위부 중뇌 동맥 일시적 또는 영구적 결찰 (MCA) 및 총 경동맥 (CCA)로 구성되어 마우스에서 대뇌 허혈 실험 모델의 설명을 제공한다 stereological 소프트웨어를 사용하여 정확한 카발리 법에 의해. 허혈성 뇌의 골수 세포의 서브 세트를 결정하기에 첫 번째 방법은 광학 분별 접근법에 기초하여 5 stereological 방법이다. 이것은 대부분이며일반적으로 생명 과학 분야 stereological 프로브를 사용하고 오류 5-7의 낮은 계수와 높은 정확도를 제공한다. 이 때문에 섹션으로 조직의 분열의 세포 추정에 대한 편견을 피할 수로 조직이, 섹션으로 잘라 때이 세포 정량을위한 최고의 선택입니다. 이 방법은 숫자, 역학과 허혈성 조직 (8)의 침투 호중구 개체군의 표현형 변화를 특징 짓는 매우 강력한 방법입니다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 백혈구 현탁액을 분리 및 유동 세포 계측법에 의해이를 특성화하는 간단한 방법을 제공 캄파넬라 협력자 (9)로부터 개질 된 프로토콜에 기초한다. 종래의 면역 조직 화학 기법과 대조적으로, DIFF에 기초하여 자신의 골수 세포 (CD45 하이는 CD11b +)을 특성화 (LO는 CD11b + CD45) 미세 아교 세포를 구별 허용 유동 세포 계측법 및 침투CD45 9-13의 erent 발현 수준. 또한, 염증성 단구 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G - LY-6C 안녕은), 호중구는 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G +) 및 허혈성 조직의 다른 백혈구 부분 집합 구별 할 수있다. 이 접근법은 뇌 허혈 실험 모델에서 신경 염증을 평가하는 신뢰성 있고 신속한 분석을 제공한다. 그러나, 조직 처리가 활성화 상태와 반 정량적 특성을 제공 허혈성 조직에서 발견되는 다양한 세포 집단의 수에 영향을 미칠 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라 haematogenous 식세포와 호중구의 혈관 외 유출은 뇌졸중 후 뇌 손상에서 중추적 역할을하는 것으로 생각된다. 이 골수 세포 개체군은 서로 다른 표현형 및 기능을 표시하고 구별 할 필요가 있고 조직 손상에 대한 그들의 규제와 공헌을 연구하는 특징으로 할 수 있습니다. 정확한 stereological 방법 및 유세포 분석 :이 프로토콜은 뇌 면역 세포의 특성화를 위해 두 가지 방법을 제공합니다. stereological 체계적인 접근법은 랜덤 샘플링에 의해 추정이자 (뇌 경색)의 영역에서 세포의 총 수를 계산 광학 분별 법에 기초한다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 현탁액 백혈구를 분리 및 미세 아교 세포의 특성 분석을 허용 유세포들을 특성화하는 간단한 방법을 제공하고, 단핵구 및 호중구 허혈성 조직의 침투. 또한, 교리독점적 사망률의 낮은 속도 및 카발리 법으로 경색 량을 특성화 뇌 조직 학적 처리 절차 재현성 경색을 발생, 뇌 피질에 영향을 쥐 뇌허혈 모델 etails.

여기에 도시 뇌허혈 모델 선조체 관개 MCA의 lenticulostriatal 분기 (도 1)에 흡장되지 않으므로 선조체 조직에 영향을주지 않고 단독으로 본 피질 경색을 발생시킨다. Nissl 염색으로, 손상된 영역은 담색 피질 영역 (도 2)로 식별 할 수있다. 이 모델은 Nissl 염색 섹션에서 카발리 에리 방법에 의해 추정 MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) (그림 2) 후 24 시간에서 높은 재현성 경색 볼륨을 특징으로한다. 카발리 법에 의한 경색 부피의 추정 및 contralesional ipsilesional 반구 Gundersen 님의 에러 (CE)의 계수뿐만 아니라 경색 영역 (표 2)에서 반사되는 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 손상된 조직 부피는 3 mm에서뿐만 아니라 섹션 3.2.13에 수식을 이용한 %를 IH로 표현 될 수있다. 또한, 추정ipsilesional contralesional 영역과의 합계 용적의 경색 부피를 보정하고 손상된 조직 (표 2)의 과대 평가를 피하기 위해 부종 지수의 계산을 허용한다. 뇌 조직의 일련 단면 처리 감안 이것은 광학 분별 방법 (도 3 및 표 4)를 사용하여, 허혈 영역에 침투 호중구와 같은 세포의 아 집단의 총 수의 정확한 추정을 수행의 장점을 취할 수 표 3 매개 변수.이 프로토콜은 24 시간과 pMCAO (그림 3D) 후 마우스에서 82,856 ± 8,143 48 시간에 23,328 ± 3,623의 경색 지역에서 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 총 수를 추정하고있다. 이전의 연구와 일치, 호중구의 침윤 직접 경색 크기 (그림 3E)와 관련된다. t 추정광학 분별 법에 의해 호중구의 수는 그 Gundersen 님 (표 4)에 의해 반사되는 CE 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 백혈구 분리 및 특성화 프로토콜을 유동 세포 계측법은 허혈성 마우스의 ipsilesional 반구의 피질에서 47,922 ± 23,174 골수 세포의 분리를 할 수 있습니다. 이 세포 현탁액에있는 이벤트 총 10-30 %로 포함한다. 세포 파편 (그림 4)에 관련이 프로토콜에 존재하는 낮은 FSC 매개 변수를 사용하여 캡처 사건의 대부분. CD11b를 염색으로 CD11b + 세포는 이전에 표시된 바와 같이이 200 9에서 FSC 임계 값을 설정하여 상기 분석에서 제외 될 수 있음을, 세포 파편이 마커로 표지되지 않은 것을 시사하고, (도 4)보다 높은 FSC 값을 가지고 있음을 보여준다. 이 방법으로 얻은 세포 파편의 양에 따라 샘플 과정에 그 차이를 알 수ING (타이밍, 조직 보존, 시료 온도 효율적인 제거 미엘린 등) 그것을 차지하고있다. 또한, 셀 멤브레인의 사용은 시료에서 셀룰러 클램프의 존재를 피하기 위해 필요하다; 이 단계는 이전의 세포 얼룩을 수행해야합니다. CD11b를 발현하고 CD45에 기초도 5에 도시 게이팅 전략을 사용하여, 우리는 허혈성 조직에 침투 거주자 골수 세포를 구별 할 수있다. 허혈성 반구이는 CD11b + 인구 증가는 (도 4,도 5 및 표 5) 순으로 이들 세포의 대부분이 미세 아교 세포는 허혈 후 확산되어있는 것을 나타내는 CD45의 낮은 발현에 관련되는 가짜 그룹과 비교했을 때 . 허혈성 뇌는 CD11b + CD45 하이 셀 모집단의 출현에 의해 입증되는 바와 같이 이러한 차이 (인해 주변으로부터 세포 침윤에도 4 쉽다그림 5와 순진한와 가짜 뇌에서 적은 수이다 표 5). 뇌 허혈는 CD11b + 세포 침윤 인구의 기여는 매우 역동적 인 과정 4이다. 결찰에 의해 MCAO 모델에서, 30 % 내지 병변의 크기 및 특성이 행해졌 시간 따라 합계는 CD11b + 세포의 60 %로 변할 수있다. LY-6G + 세포로서 특성화 호중구, 그들이는 CD11b + CD45의 70-80 %가 포함 같이, 뇌허혈이 모델을 이용하여 허혈성 마우스 뇌 MCAO 이후 24 시간에서 발견되는 가장 많은 침윤 세포 집단이다 하이. LY-6C 하이 염증성 단핵 세포 - 세포의 나머지는 대부분으로 CD11b + CD45 하이 LY-6G의 하위 집단이다. 이 모델에서는, 본 인구 (24)로부터 48 시간 후 MCAO에 허혈성 뇌 영역의 수를 증가시키는 것이다. 그림 1 :. MCA의 결찰 수술 (A) 시간적인 근육의 수축 후에는, 작은 개두술은 마우스 두개골에서 수행된다. MCA는 매듭 또는 9/0 봉합사를 사용하여 매듭 결찰한다. (B) MCAO 모델에 의해 생성 된 대뇌 피질의 병변의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> 그림 2 : 카발리 에리에 의해 경색 볼륨의 정량화. (A) Nissl 염색 뇌 섹션의 대표 이미지 영구 MCA 결찰 후 24 시간. 높은 배율 Nissl 염색 후 hipocromatic 영역을 보여주는MCAO 후 손상된 영역 (코어)를 식별합니다. 경색 주변 (PI) 영역이 또한 도시되어있다. (B) (N = MCAO 이후, 일련 Nissl 염색 섹션 50 쥐를 24 시간을 카발리 방법을 사용하여 % 경색 반구 (%의 IH)로 표현 경색 량 정량 ). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> 그림 3 : 경색 영역 (24)에서 호중구 및 결찰 후 48 시간의 Stereological 정량화, 광학 분별 방법을 사용. MCAO 후 24 시간에서 허혈 영역에 침투 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 (A) 대표 이미지입니다. 경계 획정은 경색 영역을 보여줍니다. (B, C) ​​광학 분별에 의한 호중구 정량 광 해부학자의 예. (D) (24)의 경색 지역에서 총 호중구의 정량화 및 48 시간 (N = 4 마우스). (E)경색 (24)의 크기와 MCA 결찰 후 48 시간과 호중구의 수의 상관 관계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> 그림 4 :. 물리적 매개 변수 (SSC와 FSC)에 기초 순진, 가짜 허혈성 (MCAO 후 24 시간) 반구에서 얻은 뇌 백혈구의 대표 도트 플롯 분산 분석으로 CD11b (빨간색)을 표현하는 이벤트의 인구는 확인되었다 모든 그룹에서. 이 인구는 CD45의 발현에 따라 게이트 및 특징이었다. CD45 (녹색) 낮은 수준을 발현하는 세포는 허혈 및 비 허혈성 뇌 피질의 존재 및 소교 세포에 맞습니다. 대조적으로, 세포 (노란색) 높은 수준의 CD45를 발현 만했다허혈성 반구와 가짜 그룹의 낮은 정도에서 발견. 는 CD11b + CD45 안녕하세요 인구의 추가 분석 호중구 (LY-6G + 세포, 파랑)과 염증성 단핵구 (LY-6C 안녕 세포, 오렌지)가 주요 세포 뇌에서 발견 소집단 뇌졸중 후 24 시간을 침투 있음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">제발 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> 도 5 :. 허혈성 조직에 침투 된 골수 세포로부터 상주 차별화 전략 게이팅는 CD11b + 세포는 먼저 이소 타입 형광 강도 (A)에 따른 게이트 하였다. 허혈성 뇌의 세포 현탁액의 대표 도트 플롯은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 에또한,이 기술을 이용하여 취득한 이벤트들의 총 수 및 CD11b를 + 이벤트 수에 대한 일반적인 값은 (도시 아니 셀 / 허혈성 뇌 반구]. (A)는 CD11b + 세포의 CD45 형광 강도 분석을 패널에 나타낸다 게이트는 CD11b + 아군의 CD45와 CD11b를 표현의 B. 대표 도트 플롯 분석은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 또한, 허혈성 뇌 반구 당 획득 CD45 보라 CD45 안녕 세포의 전형적인 수가이 기술을 사용하여 (B)에 도시되어있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> 카발리 에리 방법에 사용되는 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (t) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> (1)/ 20 </td></tr><tr><td> 섹션 사이의 거리 </td><td> 600 μm의 </td></tr><tr><td> 그리드 간격 </td><td> 100 ㎛ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 경색 조직의 stereological 정량에 사용되는 매개 변수. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 결과 </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> 경색 </td></tr><tr><td> 지역 (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> 볼륨 (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> 볼륨에 대한 수정 프로젝션 이상 (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;강한&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 0 </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 1 </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) 알파 (Q) </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % 경색 반구 </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> 뇌 Oedema (IPS 권 / 계속 권) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 스테레오 탐정 소프트웨어 사용 카발리 법에 의해, contralesional ipsilesional 경색 부피의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td col광학 분별 사용 범위 = &quot;2&quot;&gt; 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (TSF) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> 프레임 높이를 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> 프레임 폭을 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> 안전 가드 </td><td> 2 μm의 </td></tr><tr><td> 광학 Disector 높이 </td><td> 14 μm의 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 프로브 분별 뇌허혈 후 호중구 침윤 stereological 정량화에 사용 파라미터. <table border="0" cellpadding="0" cellspa의 cing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> 광학 분별에 의한 호중구의 추정 </td></tr><tr><td> 샘플링 위치의 수 </td><td> (430) </td></tr><tr><td> 형상 인수 </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> 총 마커 카운트 </td><td> (166) </td></tr><tr><td> 광학 분별에 의해 추정 된 호중구 </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 분별 프로브 뇌 허혈 후 예상 침투 호중구의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 는 CD11b + </td><td> 호중구 </td><td> 단핵구 </td><td> 미세 아교 세포 </td></tr><tr><td> 소박한 </td><td> 25,863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191.4 </td><td> 19,012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> 샴 24 시간 </td><td> 24,563 ± 5,263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1124 ± 391.5 </td><td> 23,734 ± 2,910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 시간 </td><td> 47,922 ± 23,174 </td><td> 4874 ± 748.7 </td><td> 4826 ± 1345 </td><td> 35,395 ± 10,833 </td></tr></tbody></table> 표 5 : 접근 유동 세포 계측법과 뇌 허혈 후 추정 된 골수 세포의 대표 결과.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

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Research

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15.5K 조회수.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다. 

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The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

마우스에 영구 중간 대뇌 동맥 내고의 응용

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

연구

의학

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

영구적 인 뇌 혈관 폐색<em&gt;를 통해</em&gt; 더블 합자 및 절개

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

과도 대뇌 저산소증 - 허혈을 기반으로 혈전 성 뇌졸중 모델

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

세 쥐의 경동맥 폐색으로 영구 말초 중간 대뇌을 수행하면 두피 허혈 지속적인 장애를 연구하는

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

P10 쥐에서 신생아 뇌졸중의 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 모델

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.