대뇌 허혈 재관류의 이 2용기 폐색 마우스 모형은 치기의 병생리학을 조사할 수 있습니다. 이 모델은 허혈성 뇌의 면역 세포와 대뇌 허혈 -재퍼주입 후 행동 적자에 침투하는 뇌의 대량의 안정적인 경부 볼륨을 유도할 것입니다. 이 모델에서는, 피질 영역에서 경색이 발생하고 사망률이 낮습니다.
결찰 MCAO 재퍼퓨전 모델은 황실 MCA의 크기를 노출하기 위해 두개골 절제술이 필요하기 때문에 크기를 쉽게 확인할 수 있으며, 시술 중에 단위 MCAO의 혈류가 중단되는지 여부를 검사하는 것은 간단하다. 수술 전까지 생쥐에게 물과 음식에 무료로 접근할 수 있도록 하십시오. 수술 도구를 자동 클렌브하고 70 %의 에탄올을 사용하여 수술 테이블과 장비를 소독하십시오.
8-12주 된 마우스를 마취한 후, 단단한 발가락 핀치를 사용하여 테스트할 때 페달 반사가 없는지 확인하십시오. 마우스가 마취 하에 있는 동안 눈 건조를 방지하기 위하여 수의사 연고를 사용하십시오. 혈압을 모니터링하려면 먼저 모발을 제거한 다음 비침습적 혈압 시스템과 생리적 모니터링 시스템을 사용하여 직장 온도와 동맥 혈액 가스를 모니터링합니다.
예방 항생제로 마우스를 피하로 주입하십시오. 다음으로, 가열 패드에 마우스를 supine 위치에 놓습니다. 피부를 노출하려면 전기 클리퍼를 사용하여 복부 목 부위와 오른쪽 눈과 오른쪽 귀 사이의 부위의 털을 면도합니다.
에필라팅 크림으로 동물의 몸에서 털을 제거하고 수술 부위를 70%에탄올로 소독합니다. 그런 다음 홍채 가위를 사용하여 목에 1 센티미터 길이의 중간 선 절개를 자른다. 홍채 집게로, 조심스럽게 물리적 인 부상을 일으키지 않고 미주 신경에서 무료로 일반적인 경동맥을 해부하고, 동맥을 분리하는 5-0 실크 봉합사를 사용합니다.
다음으로, 홍채 가위를 사용하여 오른쪽 눈과 오른쪽 귀 사이의 중간점에서 두피에 0.3 센티미터 절개를 합니다. 마이크로 가위를 사용하여, zygomatic과 squamosal 뼈를 노출하는 측두근 근육을 잘라. 마우스를 스테레오 해부 현미경 아래에 놓고 마이크로 드릴을 사용하여 오른쪽 해반 중간 뇌 동맥 바로 위에 2 밀리리터 구멍을 만듭니다.
10-0 봉합사를 사용하여 오른쪽 단위 MCA의 트렁크를 리게이트하고 비외상성 동맥류 클립을 사용하여 오른쪽 CCA를 가리키게 합니다. 허혈의 원하는 기간 후, MCA와 CCA에 혈액 흐름을 복원하는 봉합및 동맥류 클립을 제거합니다. 봉합사 클립을 사용하여 머리에 피부 절개를 밀봉하고 자궁 경부 피부 절개를 수술 접착제로 밀봉하십시오.
통증 완화를 위해 buprenorphine피칸을 피하로 주입하십시오. 동물의 체온을 가열 패드에 섭씨 36.5도 또는 영하 0.5도로 유지하고 마취에서 완전히 회복될 때까지 방치하거나 다른 동물의 회사로 돌려보내지 마십시오. 마지막으로 마우스를 오토클레이브 케이지에 배치하여 완전히 복구된 후 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있습니다.
홍채 가위를 사용하여 마취되고 참수 된 마우스의 머리 피부에 절개를하여 두개골을 노출하십시오. 그런 다음 작동 가위를 사용하여 정면 뼈의 전방을 자르고 홍채 가위를 사용하여 두개골을 처진 봉합사를 따라 잘라냅니다. 뼈 가롱어로 정면과 정수리 뼈를 옆으로 밀어 내고 뇌를 노출하십시오.
뇌를 제거하고 마우스 뇌 매트릭스에 배치합니다. 면도날을 사용하여 2밀리리터 코로날 슬라이스를 구하고 5밀리리터 튜브에 2%TTC의 5밀리리터를 넣습니다. 마우스 뇌 매트릭스를 사용하여 관상 슬라이스를 얻을 때 절단 크기는 다른 뇌에서 동일해야합니다.
절단 크기는 뇌 조각의 크기에 영향을 미치며, 이는 또한 경색 크기의 계산에 영향을 미칩니다. 뇌슬라이스를 2%TTC와 1X PBS로 섭씨 37도에서 10분 동안 염색한 다음 10%의 포르말린으로 두 번 헹구습니다. 24 시간 동안 실온에서 10 %의 포르말린에 뇌 슬라이스를 수정합니다.
티슈 페이퍼에 있는 뇌 슬라이스를 건조하여 과도한 포르말린을 흡수하고, 깨끗한 플라스틱 슬라이드에 배치하고, 로스트랄에서 코달로 방향을 지정하고, 또 다른 깨끗한 플라스틱 슬라이드로 덮습니다. 스캐너를 사용하여 슬라이드를 스캔합니다. 슬라이드를 뒤집어 서 반대쪽을 스캔합니다.
ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 먼저 열고 이미지의 배율을 설정하여 각 섹션의 경색 영역을 계산합니다. 그런 다음 프리핸드 선택을 사용하여 경색 영역을 선택하고 관심 있는 ROI 관리자 영역을 사용하여 관심 영역을 측정합니다. 마지막으로, 각 섹션의 광원 영역을 합산하고, 단면 두께에 따라 결과를 곱하여 총 경색 볼륨을 추정한 다음 원고에 설명된 대로 완전한 통계 분석을 합니다.
이 MCAO 재관류 시술 절차 동안 허혈 지속 시간 증가는 오른쪽 MCA 영역의 대뇌 피질에서 허혈 유발 된 경피성 경피량 및 뉴런 손실의 다른 학위를 생산. 또한, 허혈은 MCAO 재퍼퓨전 후 48시간 후에 동물의 운동 활성을 감소시다. 대뇌 허혈 -reperfusion 후, 말초 면역 세포의 대부분은 허혈성 뇌의 ipsilateral 반구에 침투.
또한 이 2용기 폐색 모델이 MCAO 모델과 비교했을 때, 이들의 경피량은 크게 다르지 않았다. 마이크로 드릴은 두개골에 구멍을 만들 때 신중하게 사용해야합니다. 부적절한 행동으로 MCA에서 출혈을 쉽게 유발할 수 있습니다.
MCA는 손상되어서는 안되며 결찰 절차 전후에 출혈을 피해야 합니다. MCA 폐색 및 재관류 상태는 레이저 도플러에 의해 확인할 수 있습니다. 이 방법은 MCA의 혈류 상태를 확인할 수 있다.
