JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund&#8212;Memorial Hermann Foundation.

1. EML 세포 배양 및 시스템과 정렬 자기 셀 사용 린-CD34 + 린-CD34- 세포의 분리 형광을 활성화 셀 정렬 방법 <ol><li> 줄기 세포 인자 컬렉션 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포 배양 배지의 제조 : <ol><li> 37 ° C 세포 배양 인큐베이터에서 5 % CO 2에서 25cm 2 플라스크 (표 1)에 10 % FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양 BHK 세포. </li><li> 세포가 80로 성장할 때 - 90 % 합류, PBS 10 ml로 한 번 세포를 씻으십시오. 단층 0.25 % 트립신 EDTA 용액 5 ㎖를 첨가하고, 세포가 분리 될 때까지 실온 (RT)에서 5 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> 피펫은 아래로 부드럽게 솔루션 위는 세포의 덩어리를 분쇄한다. 트립신 활동을 중지하기 위해 플라스크에 완전한 DMEM 5 ML을 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> 배지를 제거하고 신선한 BHK 세포 배양 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁. </lI&gt; <li> 전송이 새로운 75cm이 플라스크에 단계 1.1.4에서 세포 현탁액 ㎖의 플라스크에 신선한 BHK 세포 배양 배지 (48)를 가하여. </li><li> 문화 BHK을 이틀 동안 세포는 배양 배지를 수집한다. 통로 0.45 μm의 필터를 통해 매체. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 매체를 저장합니다. </li></ol></li><li> EML 세포 배양 : <ol><li> 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 BHK 세포 배양 배지 (표 1)을 함유 EML 염기성 배지에서 배양 EML 세포 (현탁액). </li><li> 피크 밀도가 6 미만 × 105 세포 / ml의 낮은 세포 밀도 (0.5~5 × 105 세포 / ㎖)에 EML 세포를 유지한다. 1의 비율로 2-3 일마다 셀을 분할 : 5. 항로 EML 세포를 부드럽게하고 10 세대 계대 후 문화를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 리니지 양성 세포의 고갈 : <ol><li> 200 XG에 FO에서 원심 분리에 의해 EML 세포를 수확R 5 분 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> PBS로 세포를 재현 탁하고 혈구와 세포를 카운트. (세포 격리 시스템의 제공자에 의해 제공되는 지침 참조) 셀의 개수에 따라 셀 후속 분리 단계에서 항체 농도를 결정한다. </li><li> 리니지 음 (선형 적)을 분리 계보 항체 칵테일 (바이오틴 결합 된 단일 클론 항체의 칵테일을 사용하여 세포 CD5, CD45R (B220), CD11b를, 안티 - GR-1 (LY-6G / C), 7-4 및 테르-119 ) 및 제조업체의 지침에 따라 자기 활성화 세포 분류 시스템. </li></ol></li><li> 린-CD34 + 린-CD34- 세포의 분리 : <ol><li> 5 분 동안 200 XG에서 단계 1.3.3에서 선형 적 세포를 스핀 다운. PBS로 세포 펠렛을 재현 탁하고 혈구와 세포를 카운트. </li><li> FACS 버퍼로 두 번 세포를 씻으 200 XG에서 세포 펠렛5 분. </li><li> 각각 숫자 1, 2, 3, 4, 5 다섯 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 레이블. 10 6 세포 (튜브 당 10 6 세포) 당 100 μL FACS 버퍼로 세포를 재현 탁. </li><li> 관 1 관 2 항 - 마우스 CD34 FITC 항체의 1 μg의를 추가하고 부드럽게 튜브를 섞는다. </li><li> 어둠 속에서 1 시간 동안 4 ° C에서 모든 튜브를 품어. </li><li> 관 (1), APC - 복합 리니지 칵테일 항체의 0.25 관 (3)에 PE - 복합 안티 SCA1 항체의 μg의, 20 μL에에 리니지 칵테일 항체 APC - 복합의 PE - 복합 안티 SCA1 항체 0.25 μg의 20 μl를 추가 관 (4). </li><li> 부드럽게 튜브를 혼합하고 어둠 속에서 추가로 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 배양한다. </li><li> 세포에 FACS 버퍼의 300 μl를 추가하고 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 3 회 FACS 버퍼 500 μL와 세포를 씻으십시오. </li><li> FACS 용 BU 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁ffer. </li><li> 보상을 설정하기위한 튜브 2, 3, 4 및 5에서 셀을 사용한다. FACS 아리아를 사용하여 관 (1)의 린-SCA + CD34 + 린-SCA-CD34- 세포를 분리. </li></ol></li></ol> 2. 높은 처리량 시퀀싱을위한 RNA 준비 및 라이브러리 생성 <ol><li> 격리, 품질 분석 및 RNA의 정량화 : <ol><li> 제조 &#39;프로토콜 다음 린-CD34 + 각각 트리 졸을 사용하여 린-CD34- 세포로부터 전체 RNA를 추출합니다. </li><li> 제조의 프로토콜 다음과 같은 오염 된 DNA를 사용하여 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase의 I)를 제거합니다. 선택적으로, 더 사용하기 위해이 단계에서 -80 ° C에서 RNA를 저장합니다. </li><li> 공급 업체가 제공하는 지침에 따라 Bioanalyzer를 사용하여 총 RNA의 품질을 평가. RNA 무결성 번호 (RIN) 9 이상의 맥주와 RNA 샘플을 사용합니다. </li></ol></li><li> 라이브러리 생성 및 높은 처리량 시퀀싱 : 참고 :이 프로토콜은 Illumina의 플랫폼을 사용하여 RNA-SEQ에 대해 설명합니다. 에다른 시퀀싱 플랫폼은 다른 라이브러리 제조 방법이 요구된다. <ol><li> 라이브러리 준비를 위해 샘플 당 높은 품질의 총 RNA의 0.1-4 μg의를 사용합니다. 보통 총 RNA 2 μg의 10 5 EML 세포로부터 추출 될 수있다. </li><li> RNA 정화 및 분열, 제 1 및 제 2 가닥 cDNA 합성, 최종 수리, 3 RNA 시퀀싱 샘플 준비 시스템을 사용 &#39;공급자의 지침에서 상세한 표준 절차에 따라, adenylation, 어댑터 라이 게이션 및 PCR 증폭을 종료한다. <ol><li> 긍정적으로 올리고-DT에게 자기 구슬을 사용하여 폴리 -A의 mRNA를 선택하고 mRNA의를 조각. </li><li> 된 cDNA를 수득하고이어서 이중 가닥의 cDNA를 생성하도록하는 cDNA의 두번째 스트랜드를 합성 임의 프라이머를 사용한 역전사를 수행한다. </li><li> 3 &#39;오버행을하고 5 채우기&#39;제거 DNA 중합 효소에 의해 돌출을. 아데 3 &#39;서로 결찰로부터의 cDNA 단편을 방지 종료한다.</li><li> dscDNA의 양단에 다중 색인 어댑터를 추가합니다. DNA 조각의 농축을위한 PCR을 수행합니다. </li></ol></li><li> 분광 광도계를 사용하여 라이브러리의 농도에 대한 정보를 획득하기 위해 A260 / A280을 측정한다. </li><li> 라이브러리의 품질을 평가하고 Bioanalyzer를 사용하여 DNA 단편의 크기 범위를 측정한다. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 이 부분에 사용되는 소프트웨어의 참고로, (표 2)를 참조하시기 바랍니다. <ol><li> 하류 분석을위한 데이터 파일 처리 : <ol><li> .bcl (기본 호출 파일)로 변환 CASAVA 소프트웨어 (Illumina 사, 버전 1.8.2)를 사용하여 파일을 .fastq하는 파일. <ol><li> 리눅스 시스템의 &#39;터미널&#39;를 발사. 일루미나 HiSeq2000 시퀀싱 시스템에서 데이터 파일이 들어있는 데이터 폴더로 이동합니다. 결과 폴더 &#39;NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /&#39;를 입력한다고 가정 해 봅시다그림 S1A의 명령과의 데이터 폴더를 입력합니다. </li><li> 리눅스 시스템에서 CASAVA 1.8.2을 설치합니다. , outputfolder &#39;는 정렬되지 않은&#39;가정하자 변환하기위한 구성 파일을 준비도 S1B의 명령을 사용한다. 하나의 .fastq 파일이 각 샘플에 대해 생성하기 위해 --fastq 클러스터 카운트 0 옵션을 사용합니다. 생성 된 .fastq 파일은 gz 인 형식으로되어 있습니다. 다운 스트림 분석 (그림 S1B)를 위해 압축을 풉니 다. </li><li> &#39;정렬되지 않은&#39;폴더가 생성 된 후, &#39;정렬되지 않은&#39;폴더 (그림 S1C)로 이동합니다. </li><li> 변환 프로세스를 시작합니다 그림 S1D의 명령을 사용합니다. &#39;-j&#39;매개 변수는 사용되는 CPU 번호를 제공합니다. </li><li> 시스템이 변환 과정을 완료 한 후, &#39;정렬되지 않은&#39;폴더 (그림 S1E)에서 결과 폴더로 이동합니다. </li><li> &lt;그림 S1F의 명령을 사용하여/ strong&gt;을 각각의 샘플 폴더 아래 .fastq 파일로 .fastq.gz 파일의 압축을 해제합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 새로운 성적표를 검색 및 턱시도 스위트 룸 (26)를 이용하여 발현 수준을 평가 : <ol><li> RNA-SEQ는 (에서 얻은 UCSC 버전 mm9, 마우스 참조 게놈을 읽어 쌍 엔드지도 <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a> 사용) Tophat 소프트웨어를 사용하여 (버전 1.3.3) 27 나비 넥타이는 매퍼 (버전 0.12.7) (28)을 참조하십시오. Tophat는 발현 수준의 추정 정확도를 개선하기 위해 &quot;-no-소설 juncs&quot;옵션과 함께 제공된다. <ol><li> 매핑 프로세스가 구현 될 폴더 .fastq 파일을 넣어. , 쌍을 이루는 엔드 시퀀싱 샘플 2 .fastq 파일 (Example1.read1, Example1.read2로 이름을 변경)가 가정의 매핑 (시스템 설정에 따라 매개 변수를 조정)을 할 그림 S2의 명령을 사용합니다.&quot;-p&quot;매개 변수는 사용되는 CPU 번호를 제공합니다. &quot;-r&quot;및 &quot;-mate-STD-DEV&quot;파라미터 QC 라이브러리로부터 얻거나 (도 S2)는 정렬의 서브 세트로부터 판독 추론 될 수있다. </li></ol></li><li> 커프스 소프트웨어를 사용하여 RNA 전 사체에 읽어 매핑 (버전 1.3.0) (29)를 조립합니다. 주석 알려진 유전자의 파일 (Tophat에 의해 사용되는 동일한 .gtf 파일) 및 Tophat에 의해 생산 .bam 파일을 사용하여 실행 커프스. <ol><li> Tophat가 실행을 완료 한 후, 같은 폴더에, 사체 및 추정 사체 발현 수준을 구성하는 커프스 단추를 실행하는 그림 S3A의 명령을 사용합니다. &#39;GenomeSeqMM9&#39;폴더에 &#39;mm9_repeatMasker.gtf&#39;및 게놈 시퀀스 파일은 UCSC 게놈 브라우저에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 그 결과 genes.expr과 transcripts.expr 파일은 유전자와 성적 증명서 (동종)의 발현 값이 포함되어 있습니다. 복사 및 붙여 넣기엑셀 파일의 내용은 파일 및 스프레드 시트 응용 프로그램 (그림 S3B)로 조작 할 수 있습니다. </li><li> 신규 한 증명서를 식별하기 위해 참조 &#39;mm9_genes.gtf&#39;파일로 생성 된 &#39;transcripts.gtf&#39;파일을 비교해도 S3C에서 명령을 사용한다. </li><li> 결과 .tmap 파일 비교 결과가 포함되어 있습니다. 복사하여 Excel 파일에 파일의 내용을 붙여 스프레드 시트 응용 프로그램에서 조작 할 수 있습니다. 클래스 코드와 성적 증명서는 &#39;U&#39;는 (그림 S3D) 제공 파일 .gtf 기준에 비해 &#39;소설&#39;로 간주 될 수 있습니다. 참고 : 값이 0.1 미만인 경우 다운 스트림 분석의 편의를 위해, 0.1 FPKM 값을 설정합니다. 참고 : 단계 3.2.3 - 3.2.6은 새로운 성적표 &#39;식 추정의 정확도를 향상하고자하는 사람들을위한 선택 사항입니다. 매핑 및 사체 구조가 연구 될 필요가 있기 때문에, 훨씬 더 긴 시간이 걸릴유엔 번 이상. </li></ol></li><li> 기본 매개 변수를 사용하여 Tophat 실행 한 다음 그림 S3E의 명령을 사용하여 생성 .gtf 파일에 커프스 단추를 실행합니다. </li><li> 도 S3F에 명령을 사용하여 기준 게놈 .gtf 파일 생성 .gtf 파일 비교. </li><li> 단계 3.2.2.4에 설명 된대로 결과 .tmap 파일을 구문 분석합니다. 복사하여 Excel 파일에 파일의 내용을 붙여 스프레드 시트 응용 프로그램에서 조작 할 수 있습니다. 클래스 코드와 성적 증명서는 &#39;U&#39;는 것으로 간주 할 수있다 &#39;소설&#39;제공 파일 .gtf 기준에 비해. </li><li> 단계 3.2.5 후, 기준 .gtf 파일로서 사용될 수있다 폴더 .combined.gtf 파일이있다. 신규 성적 FPKM보다 정확한 추정을 획득하기 위해 단계 3.2.1 및 3.2.2에 기재된 바와 같이 Tophat과 커프스의 두 번째 실행이 수행 될 수있다. </li></ol></li><li> differentiall 감지Y는 DESeq 패키지 (30)를 이용하여 유전자를 표명했다. <ol><li> DESeq의 입력은 판독 원시 카운트 테이블이다. 이러한 테이블을 얻으려면, HTSeq 웹 사이트에서 다운로드 할 수 있습니다 HTSeq 파이썬 패키지와 함께 배포되는 htseq 카운트 스크립트를 사용 ( <a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a> ) . <ol><li> samtools, Python 및 htseq 카운트 programsare이 시스템에 설치되어 있는지 확인합니다. 그림 S4A의 명령을 사용하여 tophat 출력 원시 읽기 카운트 번호를 얻습니다. </li><li> &#39;Raw_Count_Table.txt&#39;Excel을 사용하여, &#39;ExperimentDesign.txt&#39;파일을 준비합니다. 복사 및 DESeq의 R 패키지 (그림 S4B)에 대한이 .txt 형식으로 내용을 저장합니다. </li><li> 시스템에 R 프로그램을 설치합니다. 터미널에 입력 &#39;R&#39;키를 누릅니다 ENTER.A 화면 메시지 것 appearas는 그림 S4C에 보여 주었다. </li><li> &#39;Raw_C 읽기그림 S4D의 명령을 사용하여 R에 ount_Table.txt &#39;,&#39;ExperimentDesign.txt &#39;. </li><li> 그림 S4E의 명령을 사용하여 DESeq 패키지를로드합니다. </li><li> R (그림 S4F)에서 인수 분해 조건. </li><li> 정규화 카운트 테이블에 부정적인 이항식의 테스트를 실행하기 위해 그림 S4G의 명령을 사용합니다. </li><li> .csv 파일에서 출력 중요한 차등 발현 유전자에 그림 S4H의 명령을 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> Excel을 사용하여 샘​​플에서 조회 전사 인자 &#39;(TF가) FPKM 값. 교차 DE 유전자 테이블과 TF가 테이블. 유전자는 차동 전사 인자를 발현되는 두 테이블에 속한다. <ol><li> 웹 사이트로 이동 <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> 및 전사 인자를 다운로드합니다. 그런 다음 &lt;(Excel에서 드 전사 인자를 조회<html> 강한&gt; 그림 S5). </li></ol></li><li> UCSC 게놈 브라우저 시각화를위한 .bigwig 파일을 생성. <ol><li> 웹 사이트에서 &#39;bedtools&#39;소프트웨어 패키지를 다운로드 <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> 시스템 (31)에 소프트웨어를 설치합니다. 웹 사이트에서 UCSC 도구 &#39;bedGraphToBigWig&#39;를 다운로드 <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> 시스템에 소프트웨어를 설치합니다. </li><li> .bam 파일이 들어있는 폴더에서 .bed 파일에 tophat에 의해 생성 .bam 파일을 변환 그림 S6A의 명령을 사용합니다. </li><li> .bed 파일이 생성되면, .bigwig 파일을 생성하기 위해도 S6B에서 명령을 사용한다. 파일 &#39;ChromInfo.txt&#39;는 다음 URL에서 얻을 수 있습니다 :arget = &quot;_blank&quot;&gt; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz. </li><li> UCSC 게놈 브라우저에 대한 사용자 정의 트랙을 준수하십시오. 웹 사이트를 참조하십시오 <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a> UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 사용자 정의 트랙을 표시하는 방법에. </li></ol></li></ol><img alt="그림 S1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg" /> 그림 S1 : .bcl 파일을 변환하는 CASAVA 소프트웨어를 사용하여 파일을 .fastq합니다. <img alt="그림 S2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg" /> 그림 S2는 : 매핑 Tophat를 사용하여 게놈을 참조하는 읽습니다. <img alt="그림 S3" fo:con텐트 폭 = &quot;5 인치&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52104 / 52104supplementalfig3.jpg&quot;/&gt; 도 S3 : 신규 사체와 발현 량 추정의 검출. <img alt="그림 S4" fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg" /> 그림 S4 : 패키지를 DESeq 사용하여 차등 발현 유전자를 호출. <img alt="그림 S5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg" /> 도 S5 : 발현 된 전사 인자의 식별. <img alt="그림 S6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg" /> 그림 S6 : 데이터 시각화에 대한 매핑 결과를 변환.

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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones.">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li><li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. 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The authors have nothing to disclose.

포유 동물의 사체는 34-38 매우 복잡하다. RNA-SEQ 기술은 유전자 발현 분석을위한 다른 방법에 비해 많은 장점을 가지고 사체 분석, 신규 성적 검출 및 단일 뉴클레오타이드 변이 검색 등의 연구에서 점점 더 중요한 역할을한다. 도입부에서 언급 한 바와 같이, 그 마이크로 어레이 혼성화 아티팩트를 극복하고 새로운 사체 드 노보를 식별하는데 사용될 수있다. RNA 시퀀싱의...

조혈 줄기 세포는 성인 골수 틈새에 주로 존재 희귀 혈액 세포이다. 이들은 혈액을 보충하기 위해 필요한 세포 및 면역 시스템 (1)의 제조를위한 책임이있다. 줄기 세포의 일종으로서, 조혈 모세포는자가 재생과 분화를 모두 할 수있다. 조혈 모세포의 운명 결정을 제어하는 메커니즘을 해명,자가 재생 (self-renewal) 또는 분화 중 하나를 향해, 혈액 질환 연구 및 임상 사용 2 조혈 모세포의 조작에 유용한 지침을 제공 할 것입니다. 연구자들이 직면 한 문제는 조혈 모세포가 유지되고 매우 제한적으로 시험 관내에서 확장 될 수 있다는 것이다; 그들의 자손의 대부분은 부분적으로 문화 2에서 차별화된다. 전체 게놈 규모에서 자기 갱신 및 분화 과정을 조절 키 레귤레이터를 식별하기 위해, 우리는 모델 시스템으로서 마우스 원시 조혈 전구 세포 라인 EML을 사용했다. 목세포주는 쥐의 골수 3,4에서 파생된다. 다른 성장 인자가 공급되면, EML 세포는 시험 관내에서 5 적혈구, 골수 및 림프 세포로 분화 할 수있다. 중요한 것은,이 세포주 배양 배지가 multipotentiality 유지 여전히 줄기 세포 인자 (SCF)를 함유하고에서 다량으로 전파 될 수있다. EML 세포는 자기 갱신 린 - SCA + CD34 +의 아 집단으로 분리 부분적 표면 마커 CD34 및 SCA 6에 근거 린 - SCA-CD34- 세포를 구별 할 수있다. 단기 조혈 모세포, SCA + CD34 + 세포와 마찬가지로 자기 갱신 할 수 있습니다. 빠르게 린-SCA + CD34 + 린-SCA-CD34- 세포의 혼합 인구를 재생 및 6 증식을 계속할 수 SCF, 린-SCA + CD34 + 세포로 치료합니다. 두 집단은 형태에 유사하며 C-키트의 mRNA와 단백질 6 비슷한 수준을 가지고있다. 린 - SCA-CD34- 세포는 IL-3 대신 SCF 3을 함유하는 배지에서 증식 할 수있다. UnveilinG 조혈 초기의 발달 전환 세포 및 분자 메커니즘의 더 나은 이해를 제공 할 것입니다 EML 세포 운명 결정의 핵심 규제. 자기 갱신 린 - SCA + CD34 + 및 부분적으로 분화 된 린 - SCA-CD34- 세포 사이의 기본적인 분자 적 차이를 조사하기 위해, 우리는 발현 된 유전자를 확인하기 위해 RNA-SEQ을 사용했다. 전사 인자는 세포의 운명 결정에 결정적으로 우리는 특히, 전사 인자에 초점. RNA-SEQ의 프로필과 게놈 7,8로부터 전사 된 RNA를 정량화 (NGS) 기술 차세대 시퀀싱 기능을 이용하는 최근에 개발 된 방법이다. 간단히, 총 RNA는 폴리 초기 template.The RNA 템플릿은 다음 역전사 효소를 이용하여 cDNA를로 변환으로 선택하고 조각. cDNA 라이브러리 구축 속담 비 저하 된 RNA를 사용하여 전체 길이의 RNA 전 사체를 매핑하기 위해 중요하다. 끝까지 마음을 위해시퀀싱 포즈, 특정 어댑터 서열의 cDNA의 양단에 추가된다. 그리고, 대부분의 경우, cDNA의 분자는 PCR에 의해 증폭되고, 높은 처리량 방법으로 서열 분석. 서열 분석 후, 생성 된이 기준 게놈 전 사체 데이터베이스에 정렬 될 수 읽는다. 수는 기준 유전자지도를 카운트하고,이 정보를 유전자 발현 량을 추정하는데 사용될 수 있음을 읽는다. 또한 비 유기체 모델 9 transcriptomes의 연구를 가능 기준 게놈없이 드 노보를 조립할 수 읽는다. RNA-SEQ 기술은 또한 접합부 동종 10-12, 신규 전 사체 (13)와 유전자 융합체 (14)를 검출하는데 사용되어왔다. 단백질 코딩 유전자의 검출에 더하여, RNA-SEQ도 같은 비 - 코딩의 RNA의 전사 수준을 소설을 검출하고 분석하는 데 사용될 수 긴 siRNA와 등 (18) RNA 15, 16, 마이크로 RNA (17), 비 - 코딩. 때문에 t의이 방법의 정밀도 그는, 그것은 단일 염기 변이 (19, 20)의 검출에 이용되고있다. RNA-SEQ 기술의 출현 전에 마이크로 어레이 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해 사용되는 주요 방법이었다. 사전 설계된 프로브를 합성하고,이어서 마이크로 어레이 슬라이드 (21)를 형성하도록 고체 표면에 부착된다. mRNA를 추출하여 cDNA를 변환된다. 역전사 과정에서 형광 표지 된 뉴클레오티드의 cDNA에 편입되고하는 cDNA 마이크로 어레이는 슬라이드에 혼성화 될 수있다. 특정 지점에서 수집 된 신호의 세기는 그 스폿 (21) 상에 특이 적 프로브에 결합 된 cDNA의 양에 의존한다. RNA-SEQ 기술에 비해, 마이크로 어레이는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. RNA-SEQ 기술의 사용을 제한 할 때 상대적으로 높은 배경 수준에서 신규 전 사체를 검출 할 수있는 동안 첫째, 마이크로 어레이 유전자 주석의 기존 지식에 의존 GENE 발현 수준이 낮습니다. 때문에 배경 및 신호의 포화, 마이크로 어레이의 정확성은 모두 높은 및 낮은 발현 유전자 7,22에 대한 제한, 반면 게다가, RNA-SEQ 기술은 탐지 (8,000 배) 7 훨씬 높은 동적 범위를 가지고있다. 마지막으로, 마이크로 어레이 프로브는 하나의 샘플 (23) 내의 다른 사체의 상대적인 발현 수준을 비교할 때 결과를 덜 신뢰성있는 그들의 혼성화 효율, 다르다. RNA-SEQ은 마이크로 어레이에 비해 많은 장점을 가지고 있지만, 데이터 분석은 복잡하다. 이것은 많은 연구자들이 여전히 RNA-SEQ 대신 마이크로 어레이를 사용하는 이유 중 하나입니다. 다양한 생물 정보학 도구 RNA-SEQ 데이터 처리 및 분석 (24)에 요구된다. 여러 차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 중 454, Illumina 사, SOLID 및 이온 런트는 가장 널리 사용되는 것들이다. (454)는 최초의 상용 NGS 플랫폼이었다. 다른 시퀀싱 플랫폼 달리같은 Illumina의 고체로, 454 플랫폼은 더 이상 읽을 생성 길이는 25 (평균 700 기본 읽기). 인해 더 이상 높은 효율 (25)을 조립 자신에 transcriptiome의 초기 특성에 대한 더 나은 읽습니다. 454 플랫폼의 주요 단점은 시퀀스의 megabase 당 높은 비용이다. 생성 일루미나와 SOLID 플랫폼이 증가 숫자와 짧은 길이로 읽습니다. 시퀀스의 megabase 당 비용은 454 플랫폼보다 훨씬 낮다. 때문에 일루미나와 SOLID 플랫폼 읽고 단락의 큰 숫자로, 데이터 분석이 훨씬 더 계산 집약적이다. 이온 토렌트 플랫폼에 대한 시퀀싱 장비 및 시약의 가격은 저렴하고 시퀀싱 시간은 25 짧습니다. 그러나, 에러율 시퀀스 megabase 당 비용이 높은 일루미나 SOLID 플랫폼과 비교된다. 다른 플랫폼은 자신의 장점과 단점을 가지고 데이터 분석을위한 다른 방법이 필요하다. 괞 찮아TForm 클래스는 시퀀싱 목적과 자금의 가용성에 따라 선택해야합니다. 이 논문에서, 우리는 예를 들어 일루미나 RNA-SEQ 플랫폼을. 우리는 EML 세포자가 재생과 분화에 중요한 레귤레이터를 조사하기 위해 모델 시스템으로서 EML 셀을 사용하고, 발현 량의 계산 및 신규 사체 검출 용 RNA-SEQ 라이브러리 구축 및 데이터 분석의 상세한 방법을 제공 하였다. 우리는 EML 모델 시스템 (2)에서 RNA-SEQ 연구 때 기능 테스트 (예 shRNA를 녹다운) 조혈 분화의 초기 단계의 분자 적 메카니즘을 이해하는 강력한 방법을 제공하여 결합 된 우리의 이전의 간행물에 도시 한와 같이 작용할 수 일반적으로 세포의자가 재생과 분화의 분석을위한 모델.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD34 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Lineage Antibody Cocktail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558074</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special offer sysmtem</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 75cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 25cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068-015</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140071</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30228.02</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Isolation of lineage negative cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoVue Plus spectrophotometer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9569-62</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482; Napco&#8482; 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-497-002&#160;</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#174; Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>RNA exraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq&#8482; RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2002</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis

조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는 백혈병과 림프종 등 많은 질병에 환자의 조혈 시스템을 다시 이식 치료를 위해 임상 적으로 사용된다. 조혈 모세포의자가 재생과 분화를 조절하는 메커니즘을 해명하는 연구 및 임상 사용을 위해 조혈 모세포 응용 프로그램에 대한 중요하다. 그러나 의한 시험 관내에서 증식 그들의 무능력 조혈 모세포의 대량을 얻을 수 없다. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 본 연구를위한 모델 시스템으로, 마우스 골수 유래 세포주, EML (적혈구, 골수 및 림프) 세포주를 사용 하였다. RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 점점 유전자 발현 연구를위한 마이크로 어레이를 대체하는 데 사용되어왔다. 여기서는 EML 세포 자기 갱신 및 분화의 조절에 중요​​한 요소 가능성을 조사하기 위해 RNA-SEQ 기술을 사용하는 상세한 방법을보고한다. 이 문서에서 제공하는 프로토콜은 세 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 파T는 어떻게 문화 EML 세포와 별도의 린-CD34 + 린-CD34- 세포에 대해 설명합니다. 프로토콜의 두 번째 부분은 총 RNA 준비 및 높은 처리량 시퀀싱에 대한 후속 도서관 건설을위한 자세한 절차를 제공합니다. 마지막 부분은 RNA-SEQ 데이터 분석을위한 방법을 설명하고 린-CD34 + 및 CD34- 린 - 세포 간의 발현 된 전사 인자를 식별하는 데이터를 사용하는 방법을 설명합니다. 가장 현저하게 발현 된 전사 인자는 EML 세포 자기 갱신 및 분화를 제어하는​​ 전위 키 레귤레이터 인 것으로 확인되었다. 이 글의 토론 섹션에서, 우리는이 실험의 성공적인 성능을위한 주요 단계를 강조 표시합니다. 요약하면, 본 연구는 EML 세포에자가 재생과 분화 잠재력 레귤레이터를 식별하기 위해 RNA-SEQ 기술을 사용하는 방법을 제공한다. 확인 된 주요 요인은 시험관과 내가 다운 스트림 기능 분석을 실시한다n 개의 생체.

린 - CD34 + 및 CD34- EML 린 - 세포에서 차별적으로 발현 된 유전자를 분석하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 기술을 사용 하였다.도 1은 절차의 흐름을 도시한다. 자기 세포 분류에 의한 혈통 부정적인 세포의 분리 후, 우리는 린-SCA + CD34 + 및 FACS 아리아를 사용하여 린-SCA-CD34- 세포를 분리. 린 풍부한 EML 세포는 항 CD34, 안티 SCA1 리니지 칵테일 항체로 염색 하였다. 만 선형 적 세포 SCA1 및 CD34 발현의 ?...

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Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K 조회수.  The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston.  RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다. 

비디오: Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

연구

생물학

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...