This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).

1. 지질 준비 <ol><li> 투명 유리 튜브로 원하는 양의 지질 나누어지는. 사용 E. 콜라이 극성 지질 추출물하지만 대부분 지질 조성물을 사용할 수있다. 지질이 분말 형태 인 경우, 20 ㎎ / ㎖의 농도로 이들을 클로로포름에 재현 탁. 모든 용매가 증발 할 때까지 N 2 가스에서 RT에서 지질을 건조. </li><li> 펜탄의 지질을 재현 탁 클로로포름의 남은 흔적을 제거하기 위해 다시 가스 N 2를 일정하게 건조시킨다. 드라이 모든 용매를 증발 할 때까지. 건조 동안 지질이 아래쪽 형성 치밀한 질량보다는 튜브의 아래쪽을 덮는 제 균일 한 막 분포되도록 부드럽게 회전 튜브. </li><li> 재구성 버퍼 함유 세제를 추가 (300 mM의 KCl을 50 mM의 시트르산, 25 mM의 K 2 HPO 4의 pH 4.5, 35 mM의 CHAPS)은 지질을 용해. 단백질이 CHAPS에 가난하게 허용하는 경우이 단계에서 다른 중성 세제를 사용하십시오. </li><li> Resuspen물 목욕 초음파기를 사용하여 선명도 지질 거라고. 짧은 (30 초 - 1 분)와 짧은 (30 초 - 1 분) 펄스를 최대 전력에서 물 초음파기 목욕의 중심에 튜브를 담가 일시 중지합니다. 이 솔루션은 명확하게해야한다. 주 : 최종 명확성 정도 달성​​ 사용될 특정 지질 조성에 의존한다. 심지어 동일한 명목상 지질이 단계 중 일부 뱃치 간 변이는 것도 가능하다. 잔류 헤이즈를 원심 분리에 의해 제거 될 수 현탁액 중의 큰 입자에 의한 광의 산란에 기인한다. </li><li> 20 ~ 60 분 동안 실온에서 재현 탁 지질을 품어. </li></ol> 2. Proteoliposome 형성 주 : 몇 가지 전략은 리포좀으로 세제 용해 된 단백질을 삽​​입하기 위해 사용될 수있다. CLC-EC1은 투석은 잘 작동하기 때문에 선택 6,9,10의 방법이다. <ol><li> 로 정제 된 단백질을 추가 원하는 단백질로 지질 μg의 O를 표현 (P / L) 비율 (<html> F 단백질 / mg의 지질). P / L 비의 선택은 실험의 목적에 의존한다. <ol><li> 목표는 관심있는 단백질의 활성을 평가 높은 P에 재구성하는 경우 각 리포좀 단백질의 여러 복사본을 포함합니다 / L&#39;들, 신호를 최대화한다. 각 소포 평균 한 단백질에 포함되도록 활성 및 / 또는 단백질의 단일 전송 레이트를 수치화하기 위해, 낮은 P / L&#39; s의 포아송 희석 정권 재구성한다. 각 체제를 사용하는 경우보다 깊이 분석을위한 7 단계 및 토론을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 다양한 섭생에 대한 최적의 P / L 값을 결정하려면, 8,11-13 단백질 농도의 함수로서 활성의 완전한 적정을 수행한다. 그러나, 활성 단위의 분자량 (MW가 kDa의 표시)하는 모든 단백질을 다음 P / ℓ를 초기 값을 절반으로 사용될 수있는 공지되어있다 : PG &quot;/&gt; <img alt="식 (2)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> 미리 유체 접촉 투석 튜브 또는 카세트에 단백질과 지질 혼합물을로드합니다. 500-1,000x 지질 재구성 버퍼의 양을 함유하는 비이커에 투석 장치를 배치 (즉, 지질 부유 1 ㎖를 1 L 버퍼) 부드러운 교반하에. <ol><li> 변경 버퍼 간격&gt; 3 시간에 3-4 회. 모든 솔루션 변화에서, 카세트 / 튜브 및 증류수로 비커를 씻어 신선한 재구성 버퍼 비커를 입력합니다. 솔루션 변화 1-2 O / N 간격을 포함합니다. 용액 변경의 정확한 수와 기간이 사용될 정확한 지질 및 세제에 의존한다. </li></ol></li><li> 마지막 단계가 완료된 후, 투석 용기로부터 제거 리포좀 튜브들을 분취 플래시 -80 ° C에서 액상이 N 또는 동결 그들을 동결. </li></ol> 3. 녹화 환경 &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 참고 : 녹화 설정 (그림 2A)이 두 개의 챔버 (평면 바닥 실린더, ~ 3-4 ml의 부피), CL로 구성 - 전극, 아날로그와 pH 측정기 (아래 참조) 디지털 전기 출력, 디지타이저 및 적절한 수집 소프트웨어와 컴퓨터 나. <ol><li> pH 미터 전극을, 컴퓨터에 연결되어 디지타이저 pH 미터의 출력 - CL을 연결한다. 하나의 챔버에서 기준 전극과 다른 (그림 2B)에서 레코딩 와이어를 놓습니다. 주 : 칼 ΔV가 양수 (단계 6.4 및 7.2 참조)의 경우에는 와이어 극성이 맞는지. </li><li> 기록 챔버 (그림 1B)에서 교반 막대와 볶음 접시에 챔버를 놓습니다. 교반 막대를 전극에 접촉하지 않도록하십시오. </li><li> 한천 다리 (그림 2B) (100 mM의 KCl을 2 % 아가로 오스)를 사용하여 챔버를 연결합니다. 100 mM의 KCl을의 한천 다리를 저장합니다. </리&gt; </ol> CL 4. 준비 - 전극 <ol><li> 과거와 -possibly- 작동하지 않는 pH 전극을 가져 가라. 완전히 실버 와이어를 공개 유리막 브레이크. </li><li> 조심스럽게 메스 블레이드를 사용하여 실버 와이어에서 코팅을 제거합니다. H 2 O와의 EtOH 풍부한 양을 사용하여 와이어를 청소합니다. </li><li> 전선까지 50ml을 (또는 표백제)의 포화 용액에 장소의 AgCl의 균일 한 어두운 코트 덮여있다. </li></ol> 단일 층 소포 5. 준비 <ol><li> 실험 전에 밤, 외부 버퍼 15 ㎖ (1 ㎜의 KCl, SO 4, 25 mM의 구연산, 산도 4.5 150 mM의 K 2) 흔들리는 부드러운와가 (저어하지 않음)에 세파 덱스 G-50 구슬의 1g 팽창 사용하기 전에 실온에서 최소 3 시간. 각 실험은 부어 구슬 ~ 3 ㎖가 필요합니다. 기껏해야 몇 일 동안 4 ° C에서 부어 구슬을 유지합니다. </li><li> 리포좀을 실온에서 해동하는 동안, 각 열 ~ 3m 부어부어 G-50 구슬의 리터. RT 중력 흐름에 의해 그들을 말리면; 이것은 일반적으로 1 ~ 2 분 걸립니다. </li><li> 0.4 m 테플론 차단을 사용하여 미니 압출기를 통해 테오에게 11 번을 돌출시켜 단일 층 소포를 준비합니다. </li><li> 플라스틱 둥근 바닥 튜브에 열을 놓습니다. 여분의 용액을 제거하기 위해 열을 스핀. 임상 원심 분리기에서 1,400 XG에 20 ~ 30 초 동안 원심 분리기. </li><li> 13 X 100mm 유리 튜브의 흐름을 통해, 장소 열을 버리고 컬럼에 돌출 된 소포의 100 μl를 추가합니다. 임상 원심 분리기 500 XG에서 1 분 동안 열을 스핀. </li><li> 단계 6.5의 기록 챔버에 첨가한다 관류 ~ 200 μL의 수집. </li></ol> 6. 유출 측정 <ol><li> 레퍼런스 (접지) 100mm의 챔버의 KCl 2㎖ 및 외부 버퍼의 1.8 ml의 배치 (1 mM의 KCl을을 150 mM의 K 2 SO 4, 25 mM의 시트르산, pH를 4.5) 기록 챔버. 내부 사이의 약간의 삼투압의 불균형외부 솔루션에 영향을주지 않습니다 </li><li> 취득 프로그램을 시작합니다. 이 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다, 기준이 평형을 보자. </li><li> 신호를 안정적으로 기준선 (리포좀 준비하고 건조 컬럼)에 도달하면 (도 3a)을 촬영을 시작. </li><li> 시스템 (그림 2A)를 교정 된 10 mM의 KCl 용액 15 μl를 추가합니다. </li><li> 리포좀을 추가합니다. 테오 (그림 3A)에서 - 작은 점프 인해 외부 CL의 불완전한 제거로 볼 수 있습니다. 베이스 라인이 안정 될 때까지 기다립니다. </li><li> 발리 노마 이신 (Valinomycin) 추가 (1 mg의 EtOH 중 / ㎖에서 1 μL)은 유출 (그림 3A)를 시작합니다. </li><li> 유출은 시간 물론 고원까지 (그림 3A)를 실행하자. </li><li> 모든 리포좀 (그림 3A)을 용해 할 수있는 외부 버퍼에 준비 1.5 M β-옥틸 글루코 시드 (β-OG)의 40 μl를 추가합니다. 촬영을 완료합니다. </li></ol> 7. 데이터nalysis <ol><li> ASCII 또는 텍스트 형식에서 추적 파일을 내보내고 선택의 분석 프로그램으로 가져옵니다. </li><li> 다음 사항 (도 3A)에서 전압을 측정한다 : 기록의 시작시 (0 V); 교정 펄스 (CAL V)을 첨가 한 후; 리포좀 (리포의 V)을 첨가 한 후; 유출 (V 지느러미)의 끝에; 세제 (V 어린 아이)을 첨가 한 후, 기준 전압 그래서 V 0 = 0. </li><li> 실험의 값을 결정 네른스트 - 플랑크 식을 사용하여 <img alt="식 (3)" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> 측정하여 <img alt="수학 식 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> 여기서 권 칼 μL의 교정 펄스의 부피로 표현 된 실험의 시작에서 챔버 체적은 1800이다1 - 교정 펄스와 mm 단위로 외부 버퍼의 농도 ΔV CAL은 교정 펄스 후에 측정 MV에서 점프입니다 난, [CL] CAL /에서하면 CL 있습니다. 참고 : α의이 경험적인 결정은 세 가지 목적을 수행합니다 : 그것은 시스템이 제대로 응답하는지 보장, 실험 사이에 악기의 응답의 일관성의 측정을 제공뿐만 아니라 실수는 솔루션 결정에 만든되지 않았 음을 확인합니다. </li><li> 다음 각 단계 후에 CL 농도를 계산한다 : <img alt="식 (5)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="식 (6)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="식 (7)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> 400분의 3 인자는 2000 μL의 최종 부피로 15 μL 교정 펄스의 희석에서 온다. </li><li> Calcul각 단계, 지느러미 ΔCl의 사러가 / / TOT에서 [CL]의 변화를 먹었다. </li><li> 와 CL (t)에 V (t)를 변환 <img alt="식 (8)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> 직접 중요한 지점에서 [CL] 값을 결정하고 내부 통제로 계산 된 값으로 비교합니다. </li><li> 추적을 정상화 CL 확인해의 리포 = 0, CL 확인해 무비 = 1 그래서 <img alt="식 (9)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> 하기 식 유출 경시 맞는 : <img alt="식 (10)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> CL 실험적으로 측정함으로써 결정된다 누설 - - L는 Cl의 비율이다 τ와 동일한 조건에서 제조 된 무 단백질 리포좀으로부터 유출이 공정의 시간 상수이다. </li><li> V, 초기 속도를 계산한다 : 여기서 ΔCl 핀은 밀리몰의 표현 및 V는 μL의 챔버의 체적이다. </li><li> 전송 속도 / 전도도를 계산 <img alt="식 (12)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> P는 P / L이고, MW는 활성 착물 ​​kDa의 분자량으로 표현 </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

정제 음이온 선택적 채널 또는 리포좀에 재구성 수송에 의해 매개 교통 - 우리는 상세한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명했다. CLC-EC1을 기 - 사용 된 예는 원핵 H + / CL이었다. 고려중인 이온에 적합한 하나의 AgCl 전극 : 그러나, 방법론 용이 리간드 12,13,15, 11,12 전압 또는 AG로 대체하여 다른 음이온 선택성 15,16 스포츠 의해 게이트 된 채널을 연구하기에 적합 할 수있다. 전극이 CL 이외의 이온에 대한 선택적 - 이러한 H의 +로, I - F는 -, 상업적으로 사용할 수 있습니다. 중요한 단계 및 가정의 몇 가지의 토론은 다음과 같습니다. 푸 아송 희석 가정의 한계 단일 속도 (식 7-9)의 유도는 포아송 희석 정권, 대부분의 리포좀의 계속 유효합니다아인 하나의 활성 단백질 소낭에 지정된 여러 복사본을 갖는 확률이 낮고, 소포 인구의 거시적 유출 시정 아니라 단일 단백질을 함유하는 리포좀에 의해 근사되도록. 사실, CL의 비교 - 저 (블랙, 0.2 ㎍ / ㎎), 높은 P / ℓ (회색, 5 ㎍ / MG)에서 CLC-EC1과 재구성 리포좀에 의해 매개 유출 시간 코스 (그림 3C)를 보여줍니다에서 후자의 경우는 유출 반응 속도는 전체 리포좀의 작은 부분이 0 단백질이 포함되어 있다는 것을 나타 내기 위해, 빠르고 F 0 감소된다. CL의 총량 - 양 소포 샘플에 포함 된 두 개의 샘플 소포의 전체 내부 볼륨이 유사한 것을 재구성 된 단백질의 양의 크기에 영향을주지 않음을 나타내는 각각 ~ 0.7 ~ 0.55 μmoles 필적했다 소포. 7 수학 식하는 높은 P / L 유출 시간 코스 맞춤은 τ의 값을 생성<html> ; 소포 만 ~ 6 %가 발견 ~ 31 %는 달리 활성 CLC-EC1 이합체를 포함 없음을 나타내는 (5 ㎍ / MG) = 8.8 초와 f 0 (5 ㎍ / MG) = 0.06, 때 P는 / L = ㎎ / 0.2 μg의. 따라서, 높은 P / ℓ의 단일 회전율의 추정치는 450 ~ γ CL입니다 - 초 -1, 거의 낮은 P / L에서 얻은 것보다 및 게시 된 데이터 8, 14의 낮은 6 배. 따라서, 높은 P에서 재구성 된 리포좀에서 유출 시간 과정의 분석 / L의이 재구성 된 단백질의 단일 전송 속도를 과소 평가하는 것입니다. 따라서, 정확하게 재구성 정확하게 단백질의 양을 결정하는 것이 핵심적이다 신규 단백질의 단일 전송 속도를 결정하고, 포아송 희석 정권 낮은 P / L&#39; s로 작동하도록. 이것은 이상적으로 작동하도록 최적 체제를 식별하는 전체 단백질 적정 분석을 결정함으로써 달성된다. 복합체의 활성 질량의 결정 텐트 &quot;&gt; 전술 한 분석은 활성 착물의 화학 양론이 알려져 있고 복원 된 단백질이 완전히 활성화되는 것을 가정한다. 그러나, 새로운 제제에 대한 이들 양이 사전에 알려지지 않을 수도있다.이 경우에는 직접 이러한 매개 변수를 결정할 수있다 지질 비율에 다른 단백질에 F 0 년대을 측정하여 <img alt="식 (13)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq13.jpg" /> 여기서 p는 단백질 농도는, <img alt="식 (14)" fo:content-width=".65in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq14.jpg" /> , ρ는 질량 당 지질 리포좀의 수이고, N은 아보가드로 수는 M은 P 채널 기능성 복합체의 질량이고, φ는 단백질의 활성 분획된다. 지질 비율에 다양한 단백질에서 0 년대 F 실험적으로 결정 피팅으로는 POS이다P 0을 결정하는 sible, 따라서 M P와 φ. 리포좀은 한정된 분획 혼입 난치성 인 단일 전송 속도의 유도는 높은 P에서 / L의 모든 리포좀은 적어도 하나의 능동 수송 단백질을 포함하는 것으로 가정합니다. 그러나 경우에이는 경우가하지 않은 것으로 판명되었습니다 높은 P에서 / 리포좀의 L의 상당 부분은 약간의 단백질 11-13,17의 재구성에 반응 남아있다. 이 현상의 기원은 명확하지 않다하지만 그것은 더 큰 단백질 따라서 가능한 리포좀의 수를 줄여보다 작은 반경을 가진 소체에서 제외 될 수 있음을 생각할 수있다. 이 경우, 수학 식 10로 수정해야 : <img alt="식 (15)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq15.jpg" /> θ는 PROTEI으로 난치성 리포좀 분율이고n 개의 결합. 다른 절차 리포좀의 재구성과 형성 과정, 지질 및 단백질에 대해 서로 다른 복구를해야하므로 중요한 것은, ρ와 φ는 재구성 방법에 의해 영향을받습니다. 모두 100 %의 수익률을 가정하면 γ의 잘못된 추정으로 이어질 것입니다. 따라서, 실험적으로 재구성 8,11 동안 지질 및 단백질 손실의 비율을 결정하는 것이 중요하다 단위 회전율 / 컨덕턴스의 정확한 정량을 얻었다. 재구성 된 단백질의 방향 분석 중에 가정 중 하나는 모든 재구성 된 단백질이 기능적으로 동일하다는 것이다. 그러나, 많은 채널과 수송은 수송의 방향, 정류로 알려진 현상​​을 선호. 이 기능 비대칭은 이직률의 추정 오차가 발생할 수 있습니다. 더욱이, 재구성 된 단백질의 배향은 선험적 </em&gt; 랜덤, 앞으로 또는 뒤로 작동 할 때 측정 된 단일 이직률이 단백질의 비율의 가중 평균이되도록. 몇 가지 방법은 리포좀 용액으로부터 적으로 절단 태그의 분획을 측정함으로써 또는 수용성 액세스 영역에 도입 된 단일 시스테인 잔기의 반응성의 편향성을 측정함으로써, 예를 들어 재구성 된 단백질의 방향을 결정하는데 사용될 수있다 . 마지막으로, + 기능만을 선택적쪽으로 화합물을 활성화 또는 K를 사용하여 좋은 기회 값 트랜스 전압을 설정함으로써, 첨가를 통해 한 방향으로 만 단백질을 활성화 양면 억제제를 사용하여 두 개의 집단 중 하나를 침묵하거나함으로써이 문제를 회피 할 수있다 리간드 또는 전압 의존하는 채널이나 운송을위한 그라디언트,. 꽉 리포좀의 형성에 고려 사용 O를 가능하게하는 중요한 요소의 하나여기에 설명 된 유출 분석 f를 꽉 리포좀을 형성하는 것이다. 이를 위해 고려해야 할 중요한 세 가지 변수는 단백질, 세제 제거 전략 및 지질 리포좀 조성물의 선택을 용해하는 데 사용되는 세제의 선택이다. 여기에 제시된 프로토콜에서, CLC-EC1은 데실 Maltopyranoside (DM), 따라서 용이하게 제거되어 높은 임계 미셀 농도 (CMC) 값 세제 가용화된다. 그러나, 합성 및 천연 계면 활성제의 다양한 후속 소포 기밀성에 아무런 효과 꽉 리포좀 재구성 된 단백질을 정제하는데 사용되어왔다. 이러한 세제 밀리몰 높게의 CMC의 넓은 범위를 가지며 (예를 들면 도데 실 Maltopyranoside (DDM) 또는 비스 - dioctylpropane maltopyranoside (DMNG) 등)로 낮은 마이크로 몰 (예컨대 DM 또는 토닌 등). 이 지질 리포좀 CHAPS를 이용한 가용화 또는 다른 중성 세제를 형성하는데 이용되고 있다는 점에 유의해야때문에 단백질 및 지질의 혼합물로부터 생성 된 하이브리드 미셀 상위 세제의 것과 상이한 위하여 화학 - 물리적 특성을 가질 수있다. 따라서 가능하다 일부 경우에 더욱 현저 누출 선도 리포좀 불안정 수 잔여 세제를 제거. 이 문제를 회피하기 위해 그와 같은 biobeads 12, 13, 스핀 열 (15) 또는 겔 여과 (18)과 같은 대체 세제 제거 전략을 조사하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 소포 지질 조성물은 특정의 혼합물을 특정 조건에서 다른 이온에 누설 될 우려가 있으므로 중요한 파라미터이다. 예를 들어, E. 형성된 리포좀 콜라이 극성 지질 추출물는 Cl을 꽉 아르 - 산성 pH 년대에 있지만, pH가 3로부터 형성된 19 또는 리포좀 증가로 점차적으로 누설 될 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 포스파티딜 - 에탄올 아민 1 혼합물을 (POPE) 및 1- palmitoyl- 2 올레 포스파티딜 글리세롤 (POPG) E. 형성 것보다 H +에 훨씬 낮은 투과성을 표시 대장균 극성 지질 (20)의 압축을 풉니 다. 이는 소포 지질 조성물은 또한 재구성 13,21,22 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있음에 유의하라하는 것이 중요하다. 따라서, 정확하게 각 조건에서 제조 한 무 단백질 소낭의 물성을 측정하고이 재구성 된 단백질의 성질에 미치는 영향을 평가하는 것이 중요하다. 비 CLC 형 채널 및 전달체 일반화 여기에 기술 된 바와 같이, 유출 분석법, 직접 CL의 단일 분자 특성 결정하는데 이용 될 수있다 - -selective 채널 또는 수송 체를, 예를 들면 칼슘 부활 CL의 성질 특성화하는데 사용되어왔다 - TMEM16A 12 채널 . 우리는 지금 수송 또는 chann의 특성을 조사하기 위해 유출 분석을 적용하는 방법에 대해 설명선택 및 / 또는 CLC-EC1의 ~ 10 세 이온 초 -1 크게 다른 하나의 전송 속도를 가지고 - CL 없습니다 ELS. 가장 간단한 경우는 연구중인 단백질 음이온 - 선택적이라는 것이다. 이 경우에만 필요합니다 조정의 Ag 대체하는 것입니다 : - -selective Flucs 및 CLCs 16,23,24 또는 I - F에 대해 수행되었을 때, 적절한 선택의 시판 하나의 AgCl 전극을 같은 CFTR 15 투과성 채널 . 반면에, 복원 된 단백질이 양이온 선택성 경우 발리 노마 이신 (Valinomycin) 이외의 이온 운반체는 유출을 시작하는 데 사용되어야한다. 검증 CL의 희소성 감안할 - 이오 노 포어 유용한 대체물이다 카르보닐기 시안화 4- (트리 플루오 로메 톡시) 페닐 (FCCP)과 같은 H + 이온 운반체는. 이 경우, 버퍼를 증가시킴으로써 intravesicular pH가, 예를 들면, 일정하게 유지되는 것이 중요내부 용액의 용량을 보내고. 또 다른 전략은 반대로 양성자를 사용하여 pH 측정기 (25) 또는 비례 적 pH 민감성 프로브 (26)를 사용하여 H + 전송을 모니터링하여 재구성 된 채널 또는 수송을 통해 양이온 유출을 따르는 것입니다. 그러나 이러한 측정의 간접적 인 특성은 어려운 재구성 된 단백질의 수송 특성의 정량화를 렌더링합니다. 마지막으로, 전극은 양이온의 존재 번호 선택적 및 시판되고있다. 세 번째 시나리오는 연구중인 단백질, 음이온과 양이온 모두 투과 점이다 예를 들어 잘못 선택 채널 13 또는 양이온 / CL - 송체. 그들의 염 함량을 잃게되도록 이러한 경우에, 재구성 된 리포좀 (5.4-5.5 단계) 용액 교환 과정의 KCl 구배를 유지하지 않는다. 따라서이 경우에는 모든 운동 정보가 손실됩니다. 그러나 리포좀의 분획은, 적어도 하나의 활성을 함유 PROT콘텐츠 (단계 6.8) - EIN, 0 F를 여전히 CL 갇혀 잔류 세제를 첨가하고 측정함으로써 결정될 수있다. 이것은 단백질 적정을 실시하고 수학 식 10를 이용하여 단백질의 분자량의 결정을 허용한다. 고려해야 할 또 다른 양상은 유니 터리 재구성 단백질의 수송 율은 CLC-EC1과 다른 크기 순서로되어 가능성이다. 예를 들어, 대부분의 운송은, 1 ~ 10 초 -1, CLC-EC1보다 낮은 2 ~ 3 배 가량의 매출 비율이 동안 10 6 -10 7 초 -1, 3-4,000에서 가장 채널 행위 이온 배 빠른 CLC보다 -ec1. 느린 운송 (CL)의 비율은 - 무 단백질 리포좀에서 누설 단백질의 전송 속도 감소로 유출 프로세스 증가의 상대적 무게로 제한 될 수 있습니다. 경험상 누설 률은 제조법이 다소 다르며 순서 통상몇 이온 초 -1. 느린 수송 작업시 따라서 정확하게 소체의 각 배치에 대응하는 누출을 측정하기 위해 각각의 재구성에 나란히 무 단백질 측 리포좀을 제조하는 것이 바람직하다. 유출 분석은 성공적으로 27 CLC 시아 노 박테리아와 같은 회전율 느린 이온 수송 약 1-10 초 -1의 단일 레이트를 결정하기 위해 사용되어왔다. 재구성 된 단백질 예컨대, 이온 채널, 높은 전도도를 갖는 경우 반대의 상황이 발생한다. 이때 유출 동력학 혼합 시간 (초 ~ 1-2)과 속도 제한되어 기록 전극의 극한 응답 시간으로 해결하기에 너무 빠르다. 이 경우, 운동 정보가 손실되지만 활성 복합체의 질량은 여전히 24를 결정할 수있다. 이러한 평면 지질 이중층 녹음 또는 패치 클램핑 리포좀과 같은 다른 접근 방식이 테 정제 된 이온 채널을 연구하는 것이 더 적합하다는 것을 그것은 주목할 가치가있다직접 높은 시간 해상도와 단일 분자 정보를 제공 chniques.

마지막 두 과발현과 막 수송 단백질을 정제 할 수있는 능력이 크게 증가하고있다 수십 년 : 이온 채널, 일차 및 이차 전송기들은 보통 이종 발현 시스템뿐만 아니라, 천연 공급원으로부터 정제된다. 이 단백질의 안정성을, 표현을 모니터링 개선하고 추출을 용이하게하고 강화하는 새로운 접근 방식은 끊임없이 1-5 개발되고있다. 이러한 기술 혁신은 차례로, 그 기능의 구조적 기지에 대한 우리의 이해를 강화, 막 단백질에 원자 수준의 구조 정보의 폭발을 유발하는 데 큰 도움이되고있다. 반면에, 우리의 능력은 어떤 경우에는 고해상도 구조적 정보가 따라서 정량적 구조 기반 예측을 테스트 할 수있는 능력을 제한 질적 기능 데이터에 의해 수반되도록, 동일한 비율로 증가하지 않은 정제 된 단백질의 기능적 특성을 프로빙. 따라서, developmen는양적 일반화 기능 분석의 t는 막 단백질의 기능 기계론 토대 해명 향해 중요한 단계이다. 채널 및 전송기 - 준비 정량적 정제하고 재구성 CL의 주요 기능적 특성을 결정하기 위해 사용될 수 유출 분석을 기술한다. 분석을위한 원칙은 교통 시스템뿐만 아니라 다양한 비 이온 수송 단백질로 일반화 될 수있다. 채널 / CL 대형의 존재 수송차 - - 정제 된 리포솜 CL로 녹이고 구배 (도 1A, B). CL이 - 유출가 우리의 경우에는, 반대 이온 플럭스 있도록 이온 운반체의 첨가에 의해 개시되는 K + 이온 운반체 발리 노마 이신 (Valinomycin), CL에 의해 설정된 전압 션트되는 - 구배 및 K의 평형 전위로 초기 막 전위를 설정할 + 6,7. t없이이 횡단 전위의 발생에 의해 방지로 유출이 발생, - 그는 더 중요한 순 (CL)을 이온 운반체가 없습니다. - 유출 및 F 0, 활성 단백질을 함유하지 않은 리포좀 분획 τ, CL의 시상수 : 정량적 데이터는 두 개의 측정 파라미터 (도 1C)에 의해 설명된다. τ와 f 0 CL에서 단일 - 전송 속도, 활성 단백질의 활성 분획물 및 복합체의 분자량은 8 유도 될 수있다. 알려진 구조와 기능의 교환기 -이 기술은 CLC-EC1, 잘 특성화 된 CLC 형 H + / CL로 재구성 테오를 사용하여 여기에 예시되어있다. 상기 분석 용이 전압 활성 및 / 또는 리간드의 존재에 따라 상이한 또는 이온 선택성 채널들 또는 컨베이어로 일반화된다. 또한,이 분석은 소분자 직접 영향을 미치는 단백질 재구성 여부를 결정하는데 사용될 수있다,이들 화합물 및 방법에 막 조성물 또는 지질 - 변경 시약 재구성 채널들 및 수송의 기능에 영향을 미치는 영향을 정량.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:337px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:337px;">&#160;Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>610200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IEC Centra CL2 Benchtop</td>
			<td style="width:337px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>These can be found on Ebay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Non-functional pH probe</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; DI-710 Data Logger</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WinDAQ acquisition software</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml</td>
			<td style="width:337px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td>29922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:337px;">Kimble Chase</td>
			<td>73500-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:337px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proteoliposome-based efflux assay to determine single-molecule properties of cl- channels and transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

교환기, 리포좀에 재구성 - 정제 CLC-EC1, 원핵 CLC 형 H + / CL에 의해 매개 교통 - 우리는 상세하고 강력한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 실험 장치의 개략적 인 대표도도 3에 도시되어 정제 된 CLC-EC1 및 높은 내부 CL 함유 재구성은 테오 -. 낮은 CL 함유 용액 욕에 침지 -. 이러한 조건 그물 CL에서 - 유출은 리포좀 (그림 3A)에 양의 전하의 축적에 의해 방지 할 수있다. 유출 (그림 3B) - 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 추가는 K +가 막 따라서 전위 전철과 CL을 시작 가로 질러 이동할 수 있습니다. 플럭스 시간 코스는 CL을 사용하여 모니터된다 - -selective 전극 및 CL의 총량 - 함유 소포 직접 세제를 사용하여 가용화에 의해 측정된다. 이러한에서벌크 실험 그러한 회전률, 활성 단백질의 활성 분획의 복잡하고 화학량로서 재구성 단일 단백질의 특성을 결정하는 것이 가능하다. 식 7-9 개를 사용하면 1 ~ 유출 시간 경과에 맞게 우리가 τ (0.2 ㎍ / MG) = 41 초와 f 0 (0.2 ㎍ / MG) = 0.31가 나타내는 것을 발견 CLC-EC1의 단일 전송 속도를 추정하기 리포좀의 / 3 0 활성 단백질이 포함되어 있습니다. 초 -1, 출판 값 8, 14와 잘 일치에 -이 값에서 우리는 하나의 전송 속도는 2500 ~ γ CL 것을 계산한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig1.jpg" /> 그림 1 : CL - 유출 분석 (A - B) (CL)의 도식 표현 - 무 단백질 리포좀 (A) 또는 CLC-EC1에 대한 -efflux 분석.재구성 소체 (B). (C) 이온 운반체가 시작 CL의 시뮬레이션 시간 코스 - 테오 (검은 색) 또는 단백질이없는 리포좀 (회색 점선)에서 유출. 유출은 이온 운반체 (*)의 첨가에 의해 개시되고 (^) 리포좀을 용해 세제를 첨가함으로써 종결된다. 레드 라인 지수 (CL)의 시간 상수를 결정하기 적합, τ이다 점선 -. 0 활성 단백질을 포함하는 리포좀의 분율 CLC-EC1와 f 0의 1 이상 활성 복사본을 포함하는 리포좀에서 유출되는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig1large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig2.jpg" /> 그림 2 : 설정 기록 (A) 녹화 설정.. (B) 챔버의 근접. &lt;HREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig3.jpg" /> 그림 3 : 샘플 추적 및 분석 0.2 ㎍ / mg을 P / L에서 WT CLC-EC1과 재구성 테오에서 유출 실험 (A) 일반적인 V (t) 흔적.. 화살표는 KCl을 교정 펄스, 리포좀, 발리 노마 이신 (Valinomycin) 및 β-OG의 첨가 시간을 나타냅니다. 점선은 여러 단계에서 ΔV 값을 나타냅니다. (B) V (t) 트레이스는 식 (5), 정규화하여 식 (6)과 과정 (7) 식에 적합 유출 시간 (빨간 점선)를 사용하여 CL (t)로 변환된다. (C) 0.2 ㎍ / MG P / ℓ (검은 색)에 WT CLC-EC1과 재구성 테오에서 5 ㎍ / mg을 P / L (회색)에서 표준화 유출 시간 코스. 점선의 7 수학 식하는 유출 시간 과정의 가장 맞는 있습니다.

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A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

a-proteoliposome-based-efflux-assay-to-determine-single-molecule

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

9.7K 조회수.  Weill Cornell Medical College. Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

연구

생물학

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

원자력 교통 단일 분자 이미징

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...