Name: isolation, culture and long-term maintenance of primary mesencephalic dopaminergic neurons from embryonic rodent brains
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains at JoVE.com

This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.

참고 : 동물이 유지되고 승인 된 기관의 가이드 라인과 모든 동물의 절차를 준수하여 처리 제국 대학의 동물 복지로 하였다 윤리적 검토 기관 (AWERB) 및 홈 오피스와 하버드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 연방 및 주 정부 규정에. 1. 시약 및 장비 설치 <ol><li> 해동, 나누어지는 -80 ºC에서 저장 한 ㎎ / ㎖ 라미닌 솔루션입니다. 1-2 ㎍ / ㎠의 코팅 농도 결과 1ml를 DMEM / F12에서 2 μl를 녹인다. 참고 : 천천히 얼음과 판 / 커버 슬립에 추가 즉시 차가운 DMEM / F12에 용해 및 해동 라미닌. </li><li> 4 ºC에서 75 ml의 0.01 % 425 ml의 PBS에서 폴리 오르니 틴 L-및 저장의 희석. 참고 : 작업 솔루션의 유효 기간은 1 개월까지이다. </li><li> 너희 최대 4 ºC에서 25 % (중량 / 부피) PBS에서 BSA, pH가 7.4, 저장을 녹여아칸소. </li><li> (HBSS)에 50 % FBS 비활성화 미디어를 준비합니다. </li><li> (+) - - 포도당 (중량 / 부피), 0.25 %의 BSA (중량 / 부피) 50 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신, 1 배 N2 보충, 5 % (부피 / 부피) FBS, 0.36 %의 D를 추가하여 완전한 매체 준비 DMEM / F12 및 저장 4 ºC에서. 참고 : 유효 기간 10 일입니다. </li><li> 적어도 30 분 동안 70 % (부피 / 부피) 에탄올을 끓는 배치 된 커버는 그리스와 오토 클레이브의 모든 흔적을 제거합니다. </li><li> 장소 24 웰 플레이트에 된 커버와 각 웰에 500 ㎕의 폴리 -L- 오르니 틴 솔루션을 추가합니다. RT의 조직 문화 후드에서 1 시간을 품어하고, 500 μL 물로 3 회 세척한다. 각 플레이트에 500 μL의 라미닌 솔루션을 추가하고 37 ºC에서 가습 된 조직 문화 인큐베이터에서 O / N을 품어. 참고 : 더 세척이 24 시간 배양 한 후 세포의 죽음에 폴리 -L- 오르니 틴 세 번보다 적지 결과를 세척, 라미닌 처리 후 필요 없지만. </li><li> 천연 가스 토치 f를 통해 유리 피펫의 팁을 폴란드어절름발이. 참고 :이 단계 후에 팁의 직경이 정상 크기의 절반해야한다. </li><li> 멸균 된 가위와 오토 클레이브를 사용하여, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 캡을 잘라. </li></ol> 배아 복부 중뇌 2. 해부 <ol><li> 마취시키다가 시간이 초과 임신 (E12.5) CO 2 흡입 댐 후 자궁 전위에 의해 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 스프레이 자궁 주머니가 모두 노출 될 때까지 복부 절개를합니다. 사용 집게 질 첨부 파일을 절단하고 자궁을 제거합니다. 100mm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 HBSS의 자궁을 놓습니다. </li><li> 집게 (그림 1C)를 사용하여 자궁과 양막에서 배아를 제거합니다. 신선한 얼음처럼 차가운 HBSS에있는 장소 배아. 주 : 그림 1D의 사각형은 배아 복부 중뇌의 위치를 나타냅니다. </li><li> 해부 현미경 (10 배 확대)에서 배아를 놓고 중간 뇌를 해부, 지협과 중뇌 - diencephalic 경계 영역에서 뇌를 절단 bioscissor와 집게 사용하여 아치 (그림 1E를 절개 라인도 1a를 참조하십시오). </li><li> 전체 중뇌을 복용 한 후, mediodorsal 중뇌 (그림 1 층)에 상처를합니다. </li><li> 두 포셉 (그림 1H)를 사용하여, 수막을 제거합니다. 참고 : 중요한 단계 :이 단계는 최적의 신경 세포 수율과 생존을 위해 필수적이다. 배양 조건은 뇌 세포의 최적이기 때문에, 주위 조직에서 세포의 대부분은 도금 후 다이이 조직으로부터 세포 사멸 신호 문화 무결성이 손상된다. </li><li> 멸균 면도날 (도 1H, I)을 사용하여 나비 형상을 관찰하고, 각 날개의 약 절반을 절단하는 페트리 접시에 중뇌 조직을 병합. 주 : 그림 1J는 격리 된 복부 중뇌를 보여줍니다. </li><li> 이동15 ML 원뿔 관에 얼음처럼 차가운 HBSS로 복부 중뇌의 조각 다음 배아를 진행합니다. 참고 : 2.1-2.8 이상 1 시간을 안 단계. 얼음이 기간을 넘어 배아를 유지하는 것은 상당히 세포 생존 능력을 감소시킨다. </li></ol> 복부 중간 뇌 세포의 3 해리 <ol><li> 층류 후드 하에서 복부 중뇌 조각을 전송. HBSS를 제거하고 (복부 중뇌의 최대 12 조각에 충분한 볼륨을) 원뿔 튜브로 예열 한 ㎖ (37 ° C) 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 5 ~ 10 분 동안 37 ºC에서 조직을 품어. </li><li> 후드 트립신 EDTA를 제거하고 조직을 1 ml의 탈 활성화 매체 (혈청 트립신을 비활성화합니다)를 추가합니다. </li><li> 비활성화 매체를 제거하고 두 번 완전 배지 1 ㎖의의 조직을 씻는다. 주 : 해리 된 세포를 폐기하는 것을 방지하기 위해, 튜브의 모든 매체를 제거하고 조직을 피펫 피한다. </li><li> 1ml의 완전한 매체와 trit 추가화재 연마 유리 피펫으로 조직을 요산. 거품의 형성을 방지하고 단일 세포 현탁액이 달성 될 때까지 분쇄하여 계속합니다. 참고 : 일반적으로 8-10 완전한 분리에 필요한 제한된 팁을 통과한다. </li><li> RT에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기와 매체를 제거합니다. </li><li> 다시 일시 중지 천천히 피펫 팅에 의해 완전 배지 1 ㎖의의 펠렛을 위 아래로 4 배합니다. </li></ol> 4. 도금 복부 중간 뇌 세포 <ol><li> 90 ㎕의 트리 판 블루 용액으로 세포 현탁액 10 μL와 혼합하여 혈구 세포의 수를 계산. 참고 : 세포의 생존도이 단계에서 확인할 수 있습니다. </li><li> 캡의 상단에 한 번에 집게, 하나를 사용하여, 100mm 페트리 접시에 멸균 microcentrifuge 관 뚜껑을 놓고 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 커버를 전송할 수 있습니다. 참고 : 된 커버를 세척하지 말고이 uneve의 원인이되므로, 라미닌 건조 방지n 개의 문화와 세포의 생존 감소. </li><li> (볼륨 유출없이 커버 슬립의 표면을 덮도록 최적) 완전 배지를 첨가하여 1 μL 당 1500 세포로 볼륨을 조절하고, 각 커버 슬립 위에 세포 현탁액 100 ㎕ (150,000 세포의 합계)를 추가한다. 가습 조직 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 닫고 1 시간 동안 그들을 품어 (37 ° C, 5 % CO 2). 주 : CRITICAL 단계 :이 단계는 세포의 부착과 생존을 증강 용 커버 슬립 당 ​​배아의 개수를 증가시키기 위해 필요하다. 대안 적으로, 세포를 직접 웰 (함유 된 커버)하지만 세포의 수 (대신 150,000) 웰 당 350,000 증가되어야로 전달 될 수있다. 직접 전송 때문에 (옆 또는 커버 슬립 아래) 판에 부착 세포의 약 3-4 된 커버를 산출하는 동안 즉,이 방법을 사용하여, 8-10, 커버 슬립, 취득 할 수있다. 평균 viabili이 방법을 사용하여 배양 TY는 약 90 %였다. </li></ol> 5. 문화 성장 및 유지 관리 <ol><li> 배양 1 시간 후에, 조심스럽게 400 ㎕의 예열 (37 ºC까지) 완전 배지 함유하는 24 웰 플레이트에 배지를 포함하여 전송 된 커버 (총 부피 : 500 μl를). 37 ºC에서 세포 O / N을 품어. </li><li> 우물의 배양 후 24 시간 이내에, 부드럽게 각 웰에 500 ㎕의 완전 배지를 추가합니다. 주 : 처음 몇 시간은 도파민 뉴런의 생존과이 지점을 넘어 크게 변하지 않는다 생존 세포의 수에 대한 가장 중요한 단계이다. </li><li> 처음 2 주 동안이나 매체가 노란색이 될 때까지 문화에 추가 용지를 추가하지 마십시오. 2 주 이상 또는 신선한 완전한 예열 미디어 (일반적으로 매 2 주) 노란색, 미디어의 교환 절반 (500 μL) 중간 색상 변경을 배양합니다. 참고 : 내 도파민 뉴런문화는 이러한 조건에서 6 개 이상의 주 동안 살아남을 것입니다. </li></ol>

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중뇌 도파민 성 신경 세포는 중추 신경계에서 도파민의 주요 원인이다. 그들은 세 그룹으로 나누어, 흑질의 유리체 compacta (SNpc), 복부 피개 영역 (VTA)과 retrorubral 필드 (RRF) 10, 11. SNpc과 VTA의 뉴런은 감정, 동기 부여 및 모터 동작의 제어 등의 기능에 관여, mesocortical 변연계 및 nigro - 선조체 주요 도파민 경로, 상승을 제공합니다. SNpc 흑질 선조 및 시스템의 기능적 파괴에서 뉴런의 죽음은 제 ?...

흑질에서 도파민 신경 세포의 손실 compacta는 파킨슨 병 (PD), 두 번째 가장 흔한 신경 퇴행성 질환의 추기경 모터 증상에 이르게 갈 거예요. 이 중뇌 신경 인구의 서거의 근본적인 원인은 알려져 있지 않다. 사용 된 개발 및 신경 생리 학적 특성과 mesDA 신경 세포, 여러 세포 배양 및 동물 모델 시스템의 생존을 변조에 대한 책임을 생화학 적 경로를 연구합니다. 쥐의 도파민 세포주 1RB 3 27 (N27), 인간 도파민 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y, MN9D 인간 중뇌 세포를 LUHMES 마우스 도파민 하이브리드 세포주 포함 불멸화 세포주는, 생화학 및 제한된 역학적 연구 한 사용되어왔다 -5. mesDA 뉴런 특이 손실 연구를 위해 몇몇 신경 독소 계 유전 모델 6-8 개발되었다. 차 복부 중뇌 문화, 도파민 성 신경 세포의 신경 세포와 시냅스 특성이 일반적인 장애의 발병 기전에 관여하는 경로를 연구하기위한 필수 불가결 한 도구를 제공합니다. 여기에서 우리는 더 높은 생존 성 및 배아 당 된 커버의 수율 증가의 결과로 수정을 포함 중뇌 도파민 신경 세포의 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 사전 성숙한 E12.5 마우스 중뇌 (쥐에 E14.5)의 사용은 생존을 향상시킵니다. 이 나이에 신경 해부 동안 그대로 세포 잎, 이는 아직 축삭을 개발하여 현저하게 수명을 연장해 스트레스를 최소화하지 않았습니다. 또한,이 프로토콜의 2 절에 설명 된대로 복부 중뇌의주의 해부, 더 생존 성을 향상시킨다. 커버 슬립 당 ​​배아의 개수를 증가시키기 위해 대안적인 도금법이 프로토콜 부 (4)에 제시되어있다. 이 아래 4 된 커버에 비해 배아 당 최대 10 된 커버의 수율로 연결표준 도금 조건 따라서 당 실험 동물의 양을 감소시킨다. 축삭과 dentrites의 문화 전시 가지 뉴런은 시냅스 연결을 형성 라이브 세포 이미징, 면역 세포 화학 및 전기 생리학 연구에 대한 이러한 문화가 적합 신경 세포와 시냅스 마커의 존재를 알 수있다. 또한, 신경 세포 배양의 사용은 유전 적 및 약리학 적 조작을 용이하게한다. 체외에서 2 일에서 신경 돌기의 가지 발달 연구 수 있습니다. 또한, 문화의 장기 생존율 (최대 6 주) 뉴런의 느린, 진보적 인 변성의 연구에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle medium nutrient mixture F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100X), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0.05% (wt/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine, 0.01% solution</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Synapsin-1 antibody</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Inverted phase contrast microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip Forceps &amp;ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Two Dumont #45 Forceps &amp;ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic halogen illuminator</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m sterile filter units</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm Petri dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-10012&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture and long-term maintenance of primary mesencephalic dopaminergic neurons from embryonic rodent brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

티로신 수산화 효소 (목)에 대한 면역 조직 문화에 세포의 0.5 % 사이가 도파민 것을 보여준다. 티로신 하이드 록 (TH)와 미세 소관 관련 단백질 2 (Map2에) 항체 (그림 3)를 사용하여, 신경 돌기 도금 후 2 시간 이내에 나타나며 첫 날에 의해, 축삭과 수상 돌기는 구별 (그림 2)입니다. 뉴런은 6 주 이상 생존과 광범위한 가지를 보여줍니다. 이전에 나타낸 바와 같이 문화 뉴런 신?...

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Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K 조회수.  Imperial College London. The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

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Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

신경과학

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

 CNS 상호작용 연구를 위한 1차 미세아교세포 및 뉴런 공동 배양 프로토콜

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

저자 스포트라이트: 질병 상태에서 미세아교세포-신경 세포 상호 작용을 연구하기 위한 체외 공동 배양 모델

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

요약

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이 비디오의 챕터

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

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마우스 도파민 뉴런의 차 문화

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons