This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

참고 :이 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 캐나다의 가이드에 따라 수행하고, 대학 학자 라발 동물 보호위원회에 의해 승인되었다. 1. 샘플 준비 참고 :이 예제에서, 우리는 출생 후 1 일에서 마우스의 뇌를 사용했다. <ol><li> 3 새끼 분간 4에 대한 분쇄 된 얼음에 저체온 마취를 사용하여, 다음 얼음처럼 차가운 L15 매체에 가능한 한 빨리 뇌를 해부하다. 2 분 내에이 단계를 수행합니다. </li><li> 전송 해부 금형 (물자의 CF. 목록)를 포함 두뇌하고 원하는 위치에 시편의 방향을 돌보는 냉동 조직 내장 미디어를 입력합니다. -80 ° C에서 액체 질소 저장 즉시 시료를 동결. 30 초 이내에이 단계를 수행합니다. 주 : 시험편 RNA의 품질을 손상시키지 않고 몇 달 보관 될 수있다. </li></ol> 2. 단면 <ol><li> 치료 막 COA테드 유리 슬라이드 (CF. 재료의 목록) 표면의 RNAse 오염 제거 솔루션은 RNAses의 흔적을 제거합니다. DEPC 물에 슬라이드를 세척하고 건조 할 수 있습니다. 또한, 하룻밤 200 ° C에서 빵을 슬라이드. </li><li> 이전에 표면의 RNAse 오염 제거 용액으로 세척 저온 유지 장치에 냉동 샘플을 전송합니다. 10 μm의 두께에서 -20 ° C 슬라이스 표본에서 설정 저온 유지 챔버 온도. 막 코팅 된 슬라이드에 조직 섹션을 수집하고 염색하기 전에 그들에게 건조 10 분을 할 수 있습니다. 또한, 상점은 염색 할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드. </li></ol> 염색 솔루션 3. 준비 <ol><li> 바로 실험 개시 전에 모든 솔루션을 준비하고 RNA의 분해를 방지하기 위해 (세정액을 제외한) 모든 염색 용액에서의 RNAse 억제제를 사용한다. </li><li> 완충 용액을 준비합니다. 1 % BSA로 보충 된 RNAse가없는 인산 완충 식염수 (PBS 이루어지는 모든 솔루션의 동일한 완충액 ()를 사용0.2 % 트리톤 (Triton) 및 2 %의 RNAse 억제제). 각 슬라이드를 들어, 완충 용액 400 μL (기본 200 μL와 2 차 항체 200 μL)를 준비합니다. </li><li> 정착액 솔루션을 준비 : 70 % 에탄올을 사용은 -20 ° C로 유지. RNA 추출 수율이 대폭 감소를 피하기 위해 최소 조직 정착 과정을 유지. 주 : 대안 적으로, -20 ° C에 보관 5 % 아세트산 95 % 첨가 에탄올 용액을 사용한다. </li><li> 완충액에 일차 항체를 희석하여 차 항체 용액을 준비한다. 도파민 뉴런 라벨링, 티로신 히드 록 실라 제 (TH, 레이트 도파민 생산 제한 효소)을 표적으로하는 항체를 사용한다. 짧은 배양 시간을 보상하기 위해 항체의 높은 농도를 사용한다. 1:25 희석 TH 항체를 사용합니다. 참고 : 1000 : 정상적인 면역 프로토콜,이 항체는 하나의 희석에서 하룻밤 배양 강한 신호를 제공합니다. 이 프로토콜에서, 40X 더 정광을 사용짧은 배양 시간으로 인해 에드. 때문에이 방법에 사용되는 항체의 농도에 따라 비특이적 라벨링의 증가를 확인하기 위해서 병렬 표준 면역 염색을 수행한다. </li><li> 완충액에 이차 항체를 희석하여 차 항체 용액을 준비한다. 100 : 1의 농도로 바이오틴 차 항체를 사용합니다. 주 :이 예에서, 우리는 바이오틴 화 항 - 토끼 항체를 사용 하였다. </li><li> 비 오티 닐화 된 이차 항체의 검출을 위해 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC) 용액을 준비한다. 1의 농도에서 화합물 A와 화합물 B를 첨가하여 ABC​​ 용액 만들기 : DEPC PBS에 희석 (100)는 2 %의 RNAse 억제제가 보충. 슬라이드에 추가하기 전에 아비딘 - 비오틴 복잡한 30 분을 준비합니다. </li></ol> 4. 염색 <ol><li> 빨리 공기 그들을 가볍게 치면 -80 ° C 한번에 하나 또는 두 개의 슬라이드를 해동 (또는 송풍기를 사용하여). 소수성와 서라운드 섹션장벽 펜 및 몇 초 동안 건조 할 수 있습니다. <ol><li> -20 ° C에서 더 이상 5 분 이상 저온 정착 용액에 슬라이드를 넣습니다. 세탁 DEPC PBS 6-8 시간에 슬라이드를 빠르게, 다음 정착액 솔루션의 과잉을 제거 찍어 공중에서 한 번 흔들어. </li><li> DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어 넘기십시오. 단계를 해동 슬라이드가 5 분을 초과하지 않도록하십시오. </li></ol></li><li> 깨끗한 선반에 슬라이드 (표면의 RNAse 염액으로 전처리는 RNAses의 흔적을 제거)하고, 실온에서 10 분 동안 각각의 슬라이드 (토끼 항 TH)에 차 항체 용액 200㎕를 넣어. 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 한 번 슬라이드를 쓸어. </li><li> 실온에서 6 분 동안 각각의 슬라이드에 이차 항체 용액 200㎕를 넣어. 딥 신속하게 세척 DEPC PBS에서 3 번 슬라이드 및 DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어. </li><li> ABC의 솔루 200 μl를 넣어실온에서 4 분 동안 각 슬라이드에 기. 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 초과 DEPC PBS를 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어. </li><li> DAB (3,3 &#39;디아 미노) ABC 용액에서 배양의 4 분 동안 솔루션을 준비합니다. 키트 (DAB 퍼 옥시 다제 기판 키트)에서 제공하는 시약을 사용합니다. 제공된 완충액 1 방울, DAB 용액 1 방울 및 DEPC 물 2.5ml의 30 % H 2 O 2 1 방울을 섞는다. 반전시켜 용액을 혼합한다. </li><li> DAB 솔루션의 196 μl를 타고 그냥 슬라이드에 확산하기 전에의 RNAse 억제제 솔루션의 4 μL (2 %)를 추가합니다. 장소 (표면의 RNAse 오염 제거 용액으로 전처리) 깨끗한 트레이에 슬라이드 및 슬라이드에 DAB 솔루션의 200 μl를 넣어. 참고 : DAB 솔루션 within1 또는 2 분 반응한다. </li><li> 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 무수 에탄올에 몇 초 동안 슬라이드를 넣어. 공기를 쓸어 넘겨 슬라이드를 건조 (또는 송풍기를 사용). &lt;BR /&gt; 참고 : 슬라이드가 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 보관 또는 LCM 처리 할 수​​ 있습니다. </li></ol> 5. 레이저 캡처 이외에 Microdissection <ol><li> 공기를 쓸어 넘겨 빠르게 슬라이드를 제상 (또는 송풍기를 사용). 단계를 해동 슬라이드가 5 분을 초과하지 않도록하십시오. </li><li> LCM 진행합니다. 수집 관 뚜껑에 직면 샘플면 현미경 슬라이드를 놓습니다. 샘플에 가장 적합한 배율을 선택합니다. 관심의 세포를 확인하기 위해 초점을 조정합니다. <ol><li> 절단 영역을 정의하고 레이저로 절단 시작합니다. 해부 세포 (RNA 추출 키트) 용해 버퍼의 50 μL 가득 수집 관 뚜껑에 조직의 조각을 수집합니다. LCM하는 단계는 30 분을 초과하지 않도록하십시오. </li></ol></li><li> RNA 추출 키트 (CF. 물질의 목록)를 사용하여 고립 된 세포로부터 전체 RNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 42 ° C에서 30 분 동안에 수집 된 세포를 품어용균. 예비 상태 조절 완충액 250 μL를 첨가하여 RNA를 정제 용 컬럼. 로드 용균 세포의 에탄올 50 μL. 프리 컨디셔닝 정제 컬럼에 용해 세포의 100 μl를로드합니다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 16,000 XG에서 컬럼을 원심 분리기. 세척 버퍼로 두 번 열을 씻으십시오. RNAse가없는 물을 최소 권장 볼륨 (11 μL)으로 용출 (그것은 bioanalyser 방해 할 수 DEPC로 처리하지 않음). 테스트 품질에 2 μl를 유지합니다. 참고 : 모든 솔루션 및 시약 키트에 제공됩니다. </li></ol></li></ol> 6. cDNA를 합성하고 정량적 RT-PCR <ol><li> 리버스 전사 역전사 효소 및 올리고 (DT)을 이용하여 상보 적 DNA 내로 레이저 캡처 도파민 세포로부터 RNA 샘플. 제조 업체의 프로토콜 (CF. 재료의 목록)을 따릅니다. </li><li> 유전자 특이 프라이머와 QRT-PCR의 증폭 된 cDNA 1 μl를 사용합니다. 설정 PCR 정말이에요정량 PCR을위한 하나의 구성 요소 핫 스타트 반응 믹스 20 μL 부피 ctions는 제조업체에서 권장. 세중 각 반응을 수행하십시오. <ol><li> 여기 기재된 실험을 위해, 다음의 프라이머 쌍을 사용 GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R을 (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG 개그 AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG C​​CT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); TH-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / 목-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / AADC-R (5&#39;-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;). </li></ol></li><li> 다음과 같은 빠른 순환 매개 변수를 사용하여 정량적 RT-PCR 증폭을 수행 : 95 ° C를 10 초 45주기 95 ° C, 60 ° C에서 10 초, 72 ° C에서 10 초 뒤에 5 분. determi하는 악기의 기본 설정을 사용하여 융해 곡선 분석을 수행네브라스카 균일 한 제품을 형성합니다. </li><li> 내장 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. <ol><li> 앞서 설명한 바와 같이 14 상대적인 발현 수준을 얻기 위해 두 개의 표준 발현 유전자는 GAPDH 및 Rpl13a의 식 DA 마커 유전자 및 토륨 AADC의 발현 값을 정규화한다. </li></ol></li></ol>

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이 방법의 가장 중요한 점은 RNA 저하를 방지하면서 관심의 세포를 라벨로 구성되어 있습니다. RNAses는 수용액에서 활약하는 바와 같이, 배양 시간을 감소하는 RNA 절약 11, 15을 향상시킨다. 사용되는 모든 솔루션은 RNAses을 비활성화 할 DEPC로 처리해야합니다. 모든 재료 및 표면 RNAses 오염을 방지하기 위해 표면의 RNAse 염액으로 처리 될 필요가있다. 마지막으로, 이러한 조건에서 모든 솔루션?...

뇌는 복잡한 네트워크를 형성하는 다른 신경 세포 유형의 많은 종류로 구성되어있다. 이 신경 세포는 형태, 연결 및 유전자 발현 패턴 (1)에 따라 별개의 그룹과 하위 그룹으로 구성됩니다. 마이크로 어레이를 개발, 차세대 시퀀싱 및 QRT-PCR은 상이한 생물학적 상황에서 1,2- 뉴런 집단의 유전자 발현 프로필을 비교할 수있는 가능성을 제공 하였다. 이러한 민감한 분석 RNA 무결성 2-4을 유지하면서 관심의 세포 유형의 정확한 식별 및 격리가 필요합니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기술이 널리 세포 표면 마커 및 / 또는 형태에 따라 특정 유형의 세포를 분리하는데 사용되어왔다. FACS는 공간 해상도 (5)의 전체 손실이 발생하기 전에 정렬에 세포 해리 단계가 필요합니다. 대부분의 신경 세포 개체군은 번째의 해부학 적 분포에 따라 서로 구별된다전자 두뇌입니다. 얇은 뇌 부분에 적용되는 레이저 캡처 미세 절제는 높은 공간 해상도 6-8와 세포의 특정 격리를위한 적절한 옵션을 제공합니다. LCM의 주요 제한은 형태 학적 기준에 유전자 또는 동물 모델에서 설계 형광성 단백질 리포터에 기초하여 관심있는 세포를 식별 할 필요가있다. LCM과 조합하여, RNA의 무결성을 보존 immunolabeling 빠른 방법을 수행하기위한 새로운 기술들의 개발은 현재 유전자 프로파일 실험을 진행하는 세포의 아 집단을 분리한다. 이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 1,9-13 공보에 기재되어있다. 여기서, 우리는 빠른 immunolabeling LCM과 조합함으로써 복합 조직 구조체에서 세포의 특정 서브 세트로부터 고품질의 RNA를 얻기 상세한 절차를 보여준다. 우리는 최대 RNA 회복을 얻기 위해 키 중요한 단계를 수행하고 있으므로 시그마 RNA의 분해를 방지하는 방법을 보여심하게 저 충격 유전자 발현 프로파일 링. 이 프로토콜의 데모를 들어, 하나의 일 된 마우스 중뇌의 도파민 신경 세포의 타겟이되었다. 도파민 뉴런은 티로신 수산화 효소 (TH)에 대해 유도 된 항체, 도파민 합성에 대한 속도 제한 효소를 사용 immunolabeled 수있다. TH 면역 염색 후, 개별 또는 도파민 신경 세포 집단은 LCM을 사용하여 단리 할 수​​있다. Microdissected 세포 용해 완충액에 수집되고, RNA는 RNA 분리 키트를 사용하여 추출한다. 품질과 추출 된 RNA의 양이 bioanalyzer (5)를 사용하여 측정한다. 사용하여 유전자 발현의 추가의 분석 : RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR이어서 2,4,6을 행할 수있다. 예로서, 두 단계 QRT-PCR은 레이저 캡처 절연 도파민 도메인에서 설명된다. 두 도파민 성 신경 세포 마커 유전자의 발현 량의 상대적 정량이 프로토콜의 선택도를 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>Membrane coated slides&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>11505158</td><td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &amp;micro;m; 50 pcs</td></tr><tr><td>Surface RNAse decontamination solution</td><td>Life technologies</td><td>AM9780</td><td>RNaseZap</td></tr><tr><td>Fixative</td><td></td><td></td><td>70% Ethanol kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Anti-TH&amp;nbsp;</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td>&amp;nbsp;1:25</td></tr><tr><td>RNAse free buffer</td><td></td><td></td><td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td></tr><tr><td>Anti-rabbit biotinylated</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC kit Standard</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>8&amp;micro;l/ml</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase Substrate Kit&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>RNA isolation kit</td><td>Life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 30%</td><td>Sigma</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissection system</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Model AS-LMD</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22753-14</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>6x8mm</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Frozen tissue embedding media</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer chip</td><td>Aligent Technologies</td><td>5067-1513</td><td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Hot start reaction mix for quantitative PCR</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>Fast Start Essential DNA Green Master</td></tr><tr><td>Reverse transcriptase</td><td>Life technologies</td><td>11752-050</td><td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

레이저 캡처 미세 절제 (LCM)는 높은 공간 해상도를 가진 얇은 조직 섹션에서 특정 세포의 분리를 할 수 있습니다. 효과적인 LCM은 이종 조직에서 세포 개체군의 정확한 식별이 필요합니다. LCM에 대한 관심의 세포의 식별은 일반적으로 형태 학적 기준에 형광 단백질 기자 기반으로합니다. LCM 신속한 immunolabeling의 조합은 대안적이고 효율적인 수단은 특정 유형의 세포를 시각화 및 주변 조직에서 그들을 분리를 제공한다. 고품질 RNA는 순수한 세포 집단에서 압축하고 상기 RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR를 포함한 다운 스트림 애플리케이션을 위해 처리 할 수​​있다. 이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 공보에 기재되어있다. 이 글의 목표는 LCM을 사용하여이 특정 세포를 분리하는 RNA의 무결성을 유지하면서 세포 인구의 급속한 immunolabeling을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 여기서, 우리는 설명D immunolabeling 하나 일된 마우스로부터 뇌 조직에서 도파민 성 세포를 포착함으로써 이러한 다단계 절차. 우리는 특별한 배려를받을 자격이 키 중요한 단계를 강조 표시합니다. 이 프로토콜은 관심 조직 및 세포의 종류에 적용될 수있다. 다양한 분야의 연구자 가능성이 방법의 데모에서 도움이 될 것입니다.

이 급속 immunolabeling 절차 RNA 무결성을 유지하면서 원하는 세포를 시각화 할 수있다. 하나는 RNA 추출 전에 티슈 제조하는 단계를 도시한다. 냉동 절편 후, 도파민 뉴런 티로신 수산화에 대항하는 항체를 (표지 된 신경 세포가 갈색에 표시)를 사용하여 표시되어 있습니다. 실험 질문을 따라, 단일 세포 또는 관심의 큰 영역은 LCM을 이용하여 분리 할 수 있습니다 (그림 1D...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K 조회수.  Université Laval.  특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 

비디오: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

연구

유전학

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

신경과학

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

생물학

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Spatial-Omics 분석을 위한 구강 점막하 섬유증 조직 샘플 캡처

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

저자 스포트라이트: 구강 잠재적 악성 종양의 미스터리 풀기 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Laser Capture Microdissection에 의한 구강 점막하 섬유증 샘플에서 형태학적 및 공간적 정보가 있는 세포 분리

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

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문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리

Laser Capture Microdissection에 의한 구강 점막하 섬유증 샘플에서 형태학적 및 공간적 정보가 있는 세포 분리

Laser Capture Microdissection에 의한 구강 점막하 섬유증 샘플에서 형태학적 및 공간적 정보가 있는 세포 분리