이 방법은 1 세포 수준에서 microglia 유전자 발현의 편견없는 상각을 허용하며, 이는 건강하고 병은 뇌에서 마이크로글리아의 분자 이질성을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 뇌 영역에서 미세 glia의 신속한 격리를위한 상세한 절차를 제공하고 깊은 시퀀싱을위한 단일 셀 RA6 라이브러리를 효율적으로 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 버퍼와 솔루션을 준비하고 얼음 위에 냉각합니다.
마우스를 안락사시키고 참수한 후, 작은 가위를 사용하여 머리의 피부를 잘라 두개골 아래를 노출시합니다. 그런 다음, 처탈 봉합사, 람도이달 봉합사 및 관상 봉합사를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 조직을 손상시키지 않고 정수리 뼈와 늑간 뼈의 양쪽을 분리하고 조심스럽게 중간 A.를 포함하는 해부 페트리 접시로 뇌를 이동, 두 반구로 중간라인을 통해 뇌를 잘라.
피질 엽과 뇌줄기로부터 소뇌를 분리하기 위해 숫자 55 집게를 사용합니다. 그런 다음 55번 포셉을 사용하여 피질에서 해마와 줄무늬를 조심스럽게 해부하고 각 조직을 별도의 컬렉션 페트리 접시로 옮겨 넣습니다. 첫째, 면도날을 사용하여 각 뇌 영역을 1입방 밀리미터 미만의 미세한 조각으로 자릅니다.
팁이 잘린 1밀리리터 파이펫을 사용하여 조직 조각을 미리 차가운 Dounce 균질화로 옮춥니다. 눈에 보이는 덩어리가 없을 때까지 6~10개의 전체 스트로크를 위해 Dounce 균질화의 피스톤안팎을 천천히 비틀어 조직을 균질화합니다. 그런 다음 70 마이크로미터 스트레이너를 통해 해리된 조직을 50 밀리리터 튜브로 이송합니다.
각 Dounce 균질화및 피스톤을 총 6밀리리터의 차가운 매체 A로 헹구고 헹구는 다음 헹구는 15 밀리리터 튜브로 원심분리를 합니다. 원심분리기 단일 셀 서스펜션은 400배, 섭씨 4도에서 5분간 5분간 휴식을 취합니다. MCS의 3밀리리터가 있는 자성 분리기에서 큰 고갈 컬럼 1개와 큰 선택 기둥 3개를 헹구는 다.
조직 샘플에 대한 원심분리가 완료되면 펠릿을 방해하지 않고 피펫을 꺼내 서퍼나탄을 폐기하십시오. RNase 억제제가 포함된 MCS 버퍼에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 피질과 소뇌에서 다시 매달린 세포를 포함하는 각 튜브에 미엘린 제거 구슬 100 마이크로리터를 추가하고 해마와 줄무늬에서 다시 중단 된 세포를 포함하는 각 튜브에 myelin 제거 구슬 50 마이크로 리터를 추가합니다.
10 분 동안 얼음에 튜브를 배양. 그 후, 피질 세포를 포함하는 튜브에 MCS를 추가하여 최대 2 밀리리터의 볼륨을 가져오고 나머지 튜브에 MCS를 추가하여 각 볼륨을 최대 1 밀리리터까지 가져옵니다. 컬럼이 헹구는 버퍼가 비어 있으면 피질 셀 2밀리리터를 큰 고갈 기둥에 로드하고 서로 셀 서스펜션 1밀리리터를 별도의 큰 선택 열에 로드합니다.
다음으로, MCS 버퍼 1밀리리터로 큰 고갈 컬럼을 세척하고 각 세척에 대해 MCS 버퍼 1밀리리터를 사용하여 각 대형 선택 컬럼을 두 번 세척합니다. 35 마이크로리터 스트레이너 캡을 통해 세포를 라운드 하단 FACS 튜브로 필터링합니다. 원심 분리는 400 배 g에서 4섭씨에서 5 분 동안 세포에 펠릿.
그런 다음, 천천히 상체를 부어 티슈 페이퍼에 튜브의 가장자리를 두드려. FACS 버퍼의 300 마이크로 리터로 각 튜브의 세포를 다시 중단합니다. 먼저, 마우스 FC 수용체의 5마이크로리터를 각 튜브에 시약을 차단합니다.
얼음에 5분간 배양하세요. 그런 다음 각 튜브에 CD45 PE 크기 7과 1 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 셰이커에 튜브를 10분 동안 배양합니다.
그 후 FACS 버퍼 2밀리리터를 추가하여 세척합니다. 원심분리기는 400배, 섭씨 4도에서 5분간 세포를 펠릿합니다. RNase 억제제의 1개의 마이크로리터 및 propidium 요오드의 0.5 마이크로리터를 포함하는 FACS 버퍼의 400 마이크로리터로 각 관내 세포를 재중단합니다.
표준 FACS 절차에 따라 100 마이크로미터 노즐로 단일 라이브 마이크로글리아를 각 우물에 4개의 소리터가 포함된 96웰 PCR 플레이트로 정렬합니다. 잠시 접시를 소용돌이쳐 벤치 상단 원심분리기를 사용하여 아래로 회전합니다. 도서관 준비 전까지 접시를 영하 80도까지 보관하십시오.
진행 할 준비가되면, 얼음에 접시를 해동. 열 사이클러를 사용하여 첫 번째 전사를 수행하여 cDNA를 생성하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 추가 엑소뉴클레아제 소화 단계로 cDNA를 증폭시한다. 그 후, 각 우물에 자기 구슬 18 마이크로리터를 추가하여 cDNA를 정화합니다.
5 분 동안 자기 스탠드에 접시를 배양. 그런 다음, 상체를 제거하고 각 세척에 대해 우물 당 80 마이크로 리터를 사용하여 갓 만든 80 %에탄올로 샘플을 두 번 세척하십시오. 태그를 수행하려면 나노리터 파이펫팅 기계를 사용하여 각 cDNA 샘플의 0.4 마이크로리터와 도서관 준비 키트의 1.2 마이크로리터를 10분 동안 섭씨 55도의 384웰 플레이트에 혼합합니다.
태그 링 반응을 중지하려면 실온에서 0.4 마이크로리터의 중화 버퍼를 5분 동안 추가합니다. 다음으로, 384개의 인덱스와 1.2 마이크로리터의 PCR에서 샘플에 혼합하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이브러리를 증폭시합니다. 동일한 384웰 플레이트에서 개별 라이브러리를 모두 풀로 묶고 마그네틱 구슬을 사용하여 최종 풀로 된 라이브러리를 정화합니다.
이 연구에서, microglia는 피질에서 격리, 소뇌, 해 마, 그리고 성인 마우스의 뇌 반구의 줄무늬. 준비된 세포 현탁액은 항체 염색을 수행하기 전에 미엘린 제거의 수율, 세포 생존력 및 효능을 추정하기 위해 트라이판 블루 및 혈혈계를 사용하여 현미경으로 검사된다. 이 시점에서 총 세포 수는 피질에 대해 30, 000 이상이어야하며 다른 조직에 대해 5, 000 이상이어야합니다.
세포의 90% 이상이 작은 미엘린 파편으로 실행 가능해야 합니다. FACS 기계는 일반적으로 CD45 낮음 및 CD11B 양수인 마이크로글리아를 정렬하는 데 사용됩니다. 성공적인 격리는 적어도 피질 조직을 위해 모든 살아있는 단세포에서 80% microglia 이상 생성되어야 합니다.
개별 microglia가 용해 완충제로 포착되면 RNA가 방출되고 그 후 cDNA로 전사되어 23 사이클동안 증폭됩니다. 모세관 전기 포근 플랫폼으로서, 단편 분석기 및 고민감 NGS 단편 키트는 크기 분포에 대한 신속하고 정확한 정보뿐만 아니라 96웰 플레이트의 각 웰에 존재하는 cDNA 분자의 양을 제공합니다. 500에서 5, 000 베이스 쌍 사이의 얼룩을 나타내는 샘플은 특정 농도 임계값 이상이며 라이브러리를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
샘플은 세포당 100만 개 이상의 원시 판독 깊이로 시퀀싱되어 단일 세포 RNA 시퀀싱 방법론의 검출 력을 포화시합니다. 2보다 약 60%의 매핑 비율로, 000개의 유전자는 microglial 세포 당 검출될 수 있습니다. 이 격리 방법에서 생성된 이전에 발표된 데이터는 독립적인 실험에서 재현되어 서열 된 인구에 걸쳐 microglia 특정 유전자를 검출하는 민감도를 입증합니다.
단일 microglia 전사의 정보로, 연구원은 그들의 관심사의 맥락에서 유일한 세포 인구를 발견하고, 추가이 새로 확인된 인구의 기능관련성을 연구할 수 있습니다.
