우리는 DRS 감사합니다. LCM 도움이 연구에 사용된 비행 주식, 그리고 버지니아 Espina 박사 엠마누엘 Petricoin 박사 랜스 Liotta를 제공 Yuh - Nung 월 및 웨스 Grueber. 저자는이 연구의 지원 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보의 사무소 (EPRI)에 대한 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념 트러스트를 인정합니다.

Drosophila 주변 뉴런의 LCM에 대한 일반적인 의견 최대 조직 유형과 필요한 세포의 숫자에 따라 LCM을 위해 일주일 이상을 6 시간에서 수 있습니다. 모든 절차는 표준 절차에 따라 엄격하게 RNAse없는 조건에서 수행하고 있습니다. 21-7 - GAL4 중 하나를 표현 애벌레, UAS - mCD8 : GFP 또는 PPK - GAL4, UAS - mCD8 : GFP 유전자 변형 기자 라인 이러한 실험에 사용되었다. 1. 애벌레 준비 <ol><li> 30-40 연령 일치 셋째 instar의 애벌레를 수집하고 ddH 2 O에서 그들을 세차 RNAse 어웨이 (시그마 - 알드리치)에 간단한 rinses, 멀리 RNAse를 제거하는 ddH 2 O의 최종 세척 다음. OCT에서 애벌레를 삽입하기 전에 깨끗한 Kimwipe와 완전히 초과 ddH 2 O를 윅. </li><li> 충분히 애벌레의 단일 계층을 커버하기 위해, 10의 얇은 (1.5 - 2mm) 레이어와 깨끗한 조직 포함 금형 및 레이어를 가져가라. </li><li> 전에 애벌레를 포함하기 위해 필요한 경우, ° C 조직 포함 금형에서 0으로 OCT를 냉각. 얼음 블록에 OCT를 포함하는 주형을 배치하여이 작업을 수행합니다. 이것은 포함하는 동안 애벌레 움직임을 줄이는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 미리 냉각 OCT에서 깨끗한 애벌레를 놓고 서로 병렬로 그들을 주선해드립니다. 애벌레가 정리되고 나면 천천히 애벌레 배열을 방해하지 않고 OCT와 금형을 입력합니다. 드라이 아이스 블록에 배치하여 금형을 고정 스냅. [중요 단계 :. 스냅인 동결 움직임을 줄이기 위해 즉시 애벌레]이 방법은 애벌레가 캡처 섹션마다 사용 가능한 세포의 수를 최대화 한 비행기에하실 수 있습니다. </li></ol> 그것은 관심의 세포를 확인하는 조직 형태를 유지하기 위해, 또는 섹션마다 세포의 예상 번호가 다음 11 단계로 바로 진행 만족 것으로 판명될 경우 필요한 경우. 세포가 구체적으로 분류하고 그러한 GFP 또는 RFP와 같은 쉽게 식별 표시와 함께 확인할 수 있지만, 섹션마다 세포의 숫자가 낮은 것으로 판명될 경우 또는 다음 5-10 단계 것은 가능한 세포의 수를 증가를 위해 도움이 될 수 있습니다 섹션마다 캡처하십시오. 이들은 선택 단계이며, 다른 방법은 유리한 결과를 제공하는 데 실패하면 섹션당 LCM 사용할 검찰의 뉴런의 수를 증가하는 방법으로, 필요한 경우에만 고려되어야합니다. [주의 :이 방법은 전체 조직 형태를 중단하고 매우 어려운 특정 공간 위치에 따라 조직 식별을 할 수 있습니다.] <ol start="5"><li> 로 1 단계에서 설명한 50-70 셋째 instar의 애벌레 씻으십시오. RNAse 무료 1X PBS 500 μl를 포함하는 1.5 ML의 microfuge 관에서 애벌레를 놓습니다. </li><li> 6-7 느린 강력한 스트로크와 폴리 프로필렌 유봉 (미국 과학)를 사용하여 애벌레를 다운스. </li><li> 16,000에서 솔루션을 원심 분리기 (X) 50-10초에 대한 G (애벌레 손톱이 microfuge 튜브 하단으로 정착까지]. 뜨는 폐기하십시오. 펠렛은 주로 애벌레 표피로 구성해야하는 검찰의 뉴런을 포함하여 PNS, , 단단히 준수합니다. </li><li> 500 μl 1X PBS의 1X PBS와 resuspend 펠렛의 표피 펠렛 2-3 번 씻으십시오. 소형 펠렛을 형성하기 위해 1 분 16,000 (X) g에서 솔루션을 스핀. 완전히 벌금 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 대기음. </li><li> 조심스럽게 청소 주걱을 사용하여 microfuge 관에서 펠렛을 제거하고 깨끗한 Kimwipe 조직을 사용하여 여분의 PBS를 심지. [주 : 이것은 세포 수율을 높이기 위해 가능한 소형으로 펠렛을 유지하는 것이 중요합니다]. OCT의 얇은 층 (약 1mm)이있는 플라스틱 금형에서 압축 표피 펠렛를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 얇은 원형 영역에 펠릿 밖으로 퍼졌다. OCT와 금형을 입력하고 4 단계에서 설명한대로 조직을 동결. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여, 일반, 라벨, 충전되지 않은, RNAse 무료 유리 현미경 슬라이드에 5-8 μm의 두께로 냉동 부분을 절단. [중요 단계 : 슬라이드의 중앙 근처에 위치 조직 섹션을.] </li><li> 직접 드라이 아이스 또는 -80 ° C에서 microdissection 준비까지 슬라이드 박스 깨끗한 중 슬라이드를 저장합니다. 조직을 sectioning 후 일주일 이내 선호 LCM 수행합니다. </li></ol> PAUSE 포인트 2. 냉동 애벌레 섹션에서 탈수 및 표피 제거 [중요 단계 : 탈수에 대한 모든 솔루션을 각 LCM 세션 전에 신선 준비되어야합니다. 냉동 애벌레 조직 섹션의 완전한 탈수는 최적의 microdissection의 효율성을 달성하기 위해 필수적입니다] <ol><li> -80 ° C의 냉동고에서 냉동 애벌레 조직 섹션을 포함하는 슬라이드를 제거하고 드라이 아이스에 그들을 놓으십시오. </li><li> 드라이 아이스에서 하나의 슬라이드를 제거하고 즉시 직접 장소표 1에서 제시한 권장 시간에 따라 RNAse 무료 ddH 2 O에 씻어 짧은 다음 70 % 에탄올 정착액, 가득 50 ML 원뿔 관에. </li><li> 냉동 섹션 애벌레 표피의 존재가 아닌 특정 캡처가 발생할 수 있습니다 효율적 LCM 캡 세포 접촉을 방지하여 캡처 효율성을 손상 수 있습니다. 필요한 경우, 조직 섹션에서 표피 선택을 취소한 다음 단계 (4-5)를 실시합니다. </li><li> 부드럽게 조직 섹션에 직접 2.5 %의 트립신 50 μl를 피펫하고 실온에서 50~30초 위해 알을 품다. [중요 단계 :이 단계는 최적화가 필요할 수 있습니다. 배양 시간은 microdissected하는 조직과 섹션의 두께에 따라 달라집니다. 짧은 부화가 표피를 제거하는 부족 수 있습니다 반면 더 이상 부화는 관심의 세포를 포함하여 모든 것을 지우 수 있습니다] </li><li> 트립신을 제거하고 느슨하게 붙어 표피 조각을 RNAse 무료 ddH 2 O를 포함한 50 ML 원뿔 관에 간단히 섹션을 씻어. </li><li> 탈수 과정을 완료하려면 나머지 에탄올과 권장 회 (표 1) 크실렌 솔루션의 각 순차적으로 슬라이드를 찍어. </li><li> 탈수 그라데이션 다음, 슬라이드는 간단히 사전 LCM을 수행하기 위해 상온에서 60~120초에 대한 가벼운 공기 흐름에 따라 건조됩니다. [주의 : 사전 LCM을 수행하기 위해 조직 섹션에서 완전히 크실렌을 건조. 크실렌은 microdissection 실패의 결과 LCM 캡 고분자]을 분해하는 것으로 알려져 있습니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 70 % 에탄올 (정착액) </td><td> 30-10 초 </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 50-10 초 </td></tr><tr><td> 2.5 %의 트립신 보육 </td><td> 50-30 초 </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 50-10 초 </td></tr><tr><td> 70 % 에탄올 </td><td> 60 초 </td></tr><tr><td> 95 % 에탄올 </td><td> 60 초 </td></tr><tr><td> 100 % 에탄올 </td><td> 120 초 </td></tr><tr><td> 100 % 에탄올 </td><td> 120 초 </td></tr><tr><td> 100 % 크실렌 </td><td> 120 초 </td></tr><tr><td> 100 % 크실렌 </td><td> 120 초 </td></tr><tr><td> 가벼운 공기 흐름의 공기 건조 </td><td> 60-120 초 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 냉동 애벌레 조직 섹션의 LCM 탈수 추천 절차. 3. 레이저 캡처 Microdissection EGFP에 최적화된 플루어 300 epifluorescence 광학 갖춘 PixCell 거짓말 LCM 악기는 LCM을 수행하는 사용되었다. [중요 단계 : 가능하면 증가로 인해 습도 microdissection 효율에 감소를 방지하기 위해 습도 제어 방안에 microdissection을 수행합니다. 객실 습도 microdissection 효율에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 낮은 방 습도가 발생할 수 있습니다 증가 높은 실내 습도가 낮은 microdissection 효율을 높일 수 있지만, 이외의 특정 캡처의 결과로 정전기 붙다. 우리는 25-50% 상대 습도 조건 사이의 최적의 LCM의 효율성을 달성했습니다.] <ol><li> 현미경 및 레이저 제어 상자에 전원을 켭니다. </li><li> LCM 모자의 두 카트리지를 한 번에 로드할 수 있습니다 HS LCM 모자가 (분자 장치)로 CapSure 캡 홀더 어셈블리를로드합니다. </li><li> 분자 장치 소프트웨어를 열고 슬라이드 번호와 캡 로트 번호를 포함하여 실험 세부 정보를 입력합니다. </li><li> 캡처 영역에 관련하여 뚜껑의 적절한 위치를 확보하기 위해 PixCell 거짓말 LCM 악기와 조이스틱과 관련하여 정확하게 위치를 향해 카트리지에서 새 HS LCM 뚜껑을로드합니다. </li><li> microdissection을위한 현미경의 무대에서 신선한 탈수 애벌레 조직 섹션을 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다. </li><li> oculars이나 컴퓨터 화면을 사용하여 찬란 라벨 세포를 찾습니다. : PPK - GAL4, UAS - mCD8의 높은 특이성으로 인해 : GFP 유전자 변형 기자 라인, 클래스 IV 검찰의 뉴런은 쉽게 GFP 형광에 의해 확인할 수 있습니다. </li><li> 제목 CapSure HS LCM 대문자를 사용 LCM에 조직 [을 LCM을 악기를 설정 레이저를 초점을 수행하기위한 지침에 대한 자세한 집합에 대한 참조에 22 참조]. </li><li> 그의 크기 선택한 레이저 스폿의 크기에 해당하는 정확한 녹아 폴리머 자리를 얻을 수있는 &quot;전원&quot;과 &quot;기간&quot;레이저 펄스 매개 변수를 조정합니다. 녹은 고분자 영역의 크기를 사용자 정의 설정을 조정합니다. 다음 매개 변수는 하나의 클래스 IV 다 신경을 microdissecting 사용되었습니다 스팟 직경 7.5 μm의 레이저 강도 30-50 MW, 레이저 시간과 2-4 MS와 1-2 S셀 당 좋아한다이 사용되었습니다. [중요 단계 : 적절한 장소에 필요한 레이저 매개 변수는 조직의 두께 및 객실 습도 조건 다를 수 있습니다. 하나 또는 여러 개의 세포를 microdissecting에 필요한 용해 폴리머 스폿 크기를 달성하기 위해 &quot;전원&quot;과 &quot;기간&quot;설정을 조정합니다.] </li><li> 특이성을 극대화하기 위해 최소의 중복과 강한 형광과 세포 microdissect. 각각의 모자는 수많은 세포의 시체를 캡처 할 수 있습니다. [중요 단계 : RNA의 저하를 방지하려면, 이하 45 분까지 탈수 및 microdissection을 포함하여 총 분석 시간을 제한] </li><li> 일단 관심의 모든 세포가 붙잡힌, microdissected 세포와 HS LCM 모자를 들고 촬영한 세포의 존재를 확인하고 시각적으로 원치 않는 세포이나 먼지의 존재에 대해 모자를 검사하기 위해 깨끗한 슬라이드에 배치. </li></ol> 4. LCM 파생된 세포에서 RNA 격리 <ol><li> ExtracSure (분자 장치) 장치에 microdissected 세포가 들어있는 뚜껑을 연결합니다. 세포를 포함하는 캡 표면에 RNA 추출 버퍼 (PicoPure, 분자 디바이스)의 12μl를 추가하고 ExtracSure 장치 (GeneAmp, 응용 Biosystems) 거꾸로 얇은 벽의 반응 튜브를 연결합니다. 정렬 트레이 (분자 장치)에 어셈블리를 놓고 부화 블록 (분자 장치) ° C 배양기 안에서 42 미리 가열로 덮개. </li><li> 30 분 부화에 따라, 2 분 (X) g 800 추출물이 들어있는 튜브를 원심 분리기. 튜브를 닫고 -80에서 세포 추출물을 저장 ° C를 RNA 정화 준비까지. </li></ol> PAUSE 포인트 <ol start="3"><li> 추출 및 열 PicoPure (분자 장치) RNA 추출 키트의 지시에 따라 RNA 정화. DNAse 치료는 선택 사항이며, 필요에 따라 RNA 정화 동안 열을 수행할 수 있습니다. 필요한 경우, 여러 LCM 샘플은 최종 RNA 수율을 향상시키는 하나의 열에 정화 동안 함께 풀링 수 있으며, 용출 버퍼의 작은 볼륨 (11-30 μl) (PicoPure, 분자 장치)에 eluted 수 있으며, -80에 저장 사용 ° C까지 준비. 원하는 경우 1 μl 나누어지는는 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 총 RNA의 품질을 평가하기 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 레이저 캡처 microdissection (LCM)은 세번째 instar의 애벌레 (그림 1)에서 하나의 클래스 특정 또는 여러 Drosophila 검찰의 뉴런을 분리하는 데 사용되었다. LCM은 Drosophila DA 신경 세포 기관 (그림 2A - C)의 격리 정밀도와 특이성 높은 학위 수 있습니다. 또한, 이러한 절연 다의 뉴런에서 정화 총 RNA는 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사) (그림에 대한 분석을 할 때 날카로운 5.8S, 18S 및 28S ribosomal RNA의 봉우리의 존재로 표시로서 우수한 품질의 것을 알았습니다 2D). 우리 고립된 세포의 연결을 특정 농축을 평가하기 위해 우리는 유전자의 연결을 특정 마커, elav를 사용하여 실시간으로 양적 역방향 전사 PCR (qRT - PCR)을 수행. qRT - PCR 분석을 위해, 우리는 우리의 내생적인 컨트롤 (rp49)의과 ΔΔCt 방법 23을 사용하여 전체 유충으로부터 격리 총 RNA에 상대적으로 검찰의 뉴런과 표준이 표현 microdissected LCM에 elav 표현의 상대적 수준을 계산. 이러한 분석은 LCM에 elav의 상대적인 수준의 2.5 배 농축을 통해 공개 마이크로 해부 전체 동물 (그림 3)에 비해 다 신경 세포 샘플을. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : Drosophila 주변의 뉴런의 LCM. (A) 연령 일치 셋째 instar의 애벌레는 선택 씻어 및 (B) OCT와 cryomold에 포함된하고 -80에서 냉동 ° C, (C) 8μm 시리얼 조직 섹션은 표준 그라 이오 스탯를 사용하여 만든 있으며, (D)에 균일하게 배치됩니다 깨끗한 유리 슬라이드. 부착된 조직 섹션 유리 슬라이드는 -80에서 저장 ° C 이전 LCM 처리. (E, F) 70 % 에탄올에 즉시 LCM 앞에, 조직 섹션이 해동되고 간단히 고정 간단한 ddH 2 O.에서 헹굼 다음 (G) 슬라이드는 간략하게 크실렌의 트립신과 incubated과 애벌레 섹션. (H, I) 조직 섹션 애벌레 표피없이에서 손톱 (검은색)을 제거하는 ddH 2 O와 씻어서 다음 에탄올 기울기에 더욱 건조하고 마지막으로 지워집니다 thermolabile 중합체와 함께. (J) LCM 모자는 조직 섹션에 배치되며 레이저 선택한 형광 세포 몸에 펄스입니다. 레이저 펄스는 폴리머를 녹아 선택한 셀 본체 먹기. 캡처 세포 본체와 함께 고분자 캡은 해제하고, (K)입니다 </강한&gt; RNA 추출 버퍼는 세포에 추가됩니다. RNA 추출 버퍼와 함께 촬영한 세포는 30 분 동안 42 ° C에서 incubated이며 어느 -80에 저장할 수 있습니다 ° C, 또는 직접 RNA 정화를위한 처리. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : LCM은 검찰의 뉴런의 고정밀 캡처를 용이하게합니다. : GFP 기자 스트레인 : (A) 탈수 및 트립신의 대표 이미지는 PPK - GAL4하여 GFP와 함께 레이블이 클래스 IV DA의 뉴런, UASmCD8를 보여주는, 이전에 수행 LCM 8 마이크론 조직 섹션을 처리. 참고 뉴런 중 하나가 캡쳐 (화살촉) 강조 표시됩니다. (b)는 강조 신경 세포 (화살촉)의 셀 몸이 깔끔하게 조직 섹션에서 높은 특이성과 마이크로 - 해부하는 것입니다. 단일 클래스 (C) 최종에서보기 - IV 다 신경 세포는 LCM 뚜껑에 캡처한. 샤프 5.8S, 18S의 존재로 표시로서 우수한 RNA의 품질을 보여주는 LCM - 파생 DA의 뉴런에서 분리된 총 RNA의 (D) 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사) electropherogram 및 28S rRNA의 봉우리. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 :. qRT - PCR은 전체 동물에 비해 검찰의 뉴런을 잡았 LCM에의 연결 마커 유전자 발현의 실질적인 강화를 보여 LCM에 신경 세포 특정 마커 유전자 발현 (elav)의 qRT - PCR 분석은 다 신경을 (21 - 7 - GAL4, 캡처 UAS - mCD8 : GFP)과 전체 동물이 시대에 일치 셋째 instar의 애벌레는 세중의로 진행되었습니다. LCM 캡쳐 DA 뉴런의 elav 표현의 상대 수준은 내생 컨트롤 (rp49)와 ΔΔCt 방법 23을 사용하여 전체 애벌레에 상대적으로 정상화되었습니다. LCM에 elav의 상대적인 수준의 2.5 배 농축은 DA 신경 세포 샘플이 전체 동물에 상대적으로 관찰되었다 캡처. 문제 해결 문제 : 낮은 품질의 저하, 또는 RNA. 실험을하는 동안 RNAse 무료로 상태를 확인합니다. 30 분 슬라이드 당 LCM에서 보낸 시간 양을 줄여보십시오. LCM을 수행하는 경우를 제외하고 드라이 아이스에있는 슬라이드 및 샘플 보관하십시오. 그들이 절단되면 조직 섹션을 해동하지 마십시오. 문제 : 대부분의 세포는 트립신 처리 (17-18 단계) 동안 슬라이드에서 손실됩니다. 트립신 처리 시간을 줄여보십시오. 트립신 농도를 줄여보십시오. 문제 : 뚜껑 고분자의 표피 및 기타 비 - 특정 조직 파편의 존재. 접착제 노트 22 볼품없는 측면과 폴리머 표면을 모래 바닥으로 조직 파편을 제거하십시오. 문제 : 낮음 LCM 효율성. 100 % 에탄올과 xylenes에서 배양 시간을 늘려보십시오. 제습기를 사용하여 실내 습도를 줄입니다.

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting,+for+use+in+gene+expression+profiling.">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li><li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting.">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li><li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS)+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes.">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li><li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry.">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li><li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS.">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li><li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li><li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging.">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li><li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4++and+CD8++Lineages.">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li><li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR:+An+emerging+technology+hits+the+mainstream.">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li><li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification.">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li><li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons.">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li><li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses.">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li><li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR.">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li><li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity.">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li><li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling:+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning.">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 프로토콜은 LCM을 통해 Drosophila 주변 뉴런의 격리를위한 최적화된 방법을 설명합니다. 이 LCM 프로토콜이 개발의 세 번째 instar 애벌레 단계에서 단일 클래스의 특정 또는 여러 Drosophila 검찰의 뉴런의 구체적인 격리를 위해 설계되었습니다 동안, 프로토콜의 사소한 변경 사항은 즉시 모든 개발에서 다른 Drosophila 셀 유형의 캡처에 맞게 수 서로 다른 GAL4를 사용...

장비 : <ul><li> 그라 이오 스탯 </li><li> 슬라이드 고정, rinsing, 트립신 치료 및 에탄올 / 크실렌 탈수 50 ML 원뿔 관 </li><li> -80 ° C의 냉동고 </li><li> 보육기 </li><li> PixCell 거짓말 LCM 악기는 플루어 300 epifluorescence 광학은 EGFP (분자 장치 - 분자 장치)에 최적화된 </li></ul>

laser capture microdissection of drosophila peripheral neurons

Drosophila 주변 신경계 (PNS)의 돌기 arborization (DA) 뉴런 수업 관련 dendrite의 morphogenesis 1,2를 기본 분자 메커니즘을 조사에 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 클래스 특정 DA 신경 발달의 분자 분석을 촉진하기 위하여, 그것은 순수한 인구에서 이러한 세포를 얻기 위해 매우 중요합니다. 다른 세포와 조직을 특정 RNA 격리 기술의 범위는 자석 구슬을 기반으로 세포 정화 3,4, 형광 활성 세포 정렬 (외과) 5-8, 그리고 전략 9 기반의 RNA 결합 단백질을 포함 Drosophila 세포, 존재하지만 아무것도 없어요 이러한 방법은 쉽게 공간 정밀도의 높은 학위를 하나 또는 여러 개의 클래스 특정 Drosophila 검찰의 뉴런을 분리 활용하실 수 있습니다. 레이저 캡처 Microdissection (LCM)은 공간 해상도와 정밀도의 높은 수준의 조직 섹션에서 특정 세포 유형을 분리하는 데 사용할 수있는 매우 강력한 도구로 떠오르고있다. 고립된 세포에서 얻은 RNA는 다음 qRT - PCR 및 특정 세포 유형 10-16 내의 microarray 표현 프로 파일링 포함하여 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 지금까지, LCM은 널리 개발의 세 번째 instar의 애벌레 단계에서 검찰의 뉴런을 포함 Drosophila 조직 및 세포 17,18의 분석에 적용되지 않았습니다. 여기 LCM의 적외선 (IR) 클래스를 사용 Drosophila 검찰의 뉴런의 격리를위한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 높은 특이성과 공간 해상도를 가진 단일 클래스의 특정 또는 여러 DA 뉴런의 캡쳐하실 수 있습니다. UAS - mCD8을 표현하는 연령 일치 셋째 instar의 유충 :의 통제하에 GFP 19 transgene 중 하나는 클래스 IV 다 신경 세포 특정은 PPK - GAL4 20 드라이버 또는 팬 - DA 뉴런 특정 21-7 - GAL4 21 드라이버는이 사용되었습니다 실험. 절연 검사의 뉴런에서 얻은 RNA는 매우 높은 품질이며 직접 qRT - PCR 또는 microarray 분석을 포함하여 하류 응용 프로그램을 위해 사용될 수 있습니다. 또한,이 LCM 프로토콜은 쉽게 다른 Drosophila 세포 유형에게 세포 유형 GFP의 특정, GAL4 기반의 표현 패턴에 의존 개발의 다양한 단계를 캡처하는 적용할 수 있습니다.

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

이 동영상 기사에서 우리는 격리하는 방법을 제시 하나 또는 여러 개의<em&gt; Drosophila</em적외선 촬영 (IR) 레이저 캡처 Microdissection (LCM)의 클래스를 사용하여 셋째 instar의 애벌레부터&gt; DA의 뉴런. 분리된 뉴런에서 얻은 RNA는 쉽게 qRT - PCR 또는 microarray 분석을 포함하여 다운 스트림 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

laser-capture-microdissection-of-drosophila-peripheral-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

13.4K 조회수.  George Mason University. 이 동영상 기사에서 우리는 격리하는 방법을 제시 하나 또는 여러 개의 Drosophila DA의 뉴런. 분리된 뉴런에서 얻은 RNA는 쉽게 qRT - PCR 또는 microarray 분석을 포함하여 다운 스트림 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다.

비디오: Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

연구

신경과학

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.