This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

실험 절차는 토마스 제퍼슨 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 (609분의 86 / EEC 및 87-848 / EEC 63분의 2,010 / EU) 유럽 공동체위원회 지침, 대한 NIH 가이드를 준수하여 실시 하였다 신경과 실험 동물의 사용 및 신경 과학 연구에서 동물의 사용에 대한 신경 과학의 정책에 대한 사회. 1. 복합 근육 활동 전위 (CMAPs) <ol><li> 동물 준비 : <ol><li> 주사 (케타민, 자일 라진, 아세 프로 마진) 효과 나에 의해 전달 1 ~ 2 %에 흡입 (이소 플루 란)를 사용하여 쥐를 마취. 케타민의 95.0 ㎎ / ㎏, 10.0 밀리그램 / 자일 라진의 kg, 0.075 밀리그램 / 아세 프로 마진 kg을 다음과 같이 주사 마취의 복용량이다. 참고 : 우리는 성공적으로 모두 흡입을 사용하고이 CMAP 기록 프로토콜을 수행 할 때 주 사용 마취제가없는 환경으로 접근한다. </li><li> 동물은 적절한 유지해야수술 전 nesthetic 깊이는 수술의 결론을 통해 시작되고, 수술 후 부 프레 노르 핀까지 영향을 촬영하고있다. 금단 반응이 유도되지 않는다는 것을 확인하는 간단한 발가락 핀치에 의한 적절한 마취를 확인합니다. 또한, 면봉으로 각막 반사를 테스트합니다. 수술 전반에 걸쳐, 심장 박동과 호흡 속도는 마취 깊이가 너무 빛이 될 것을 제안하는 증가하지 않았 음을 확인합니다. </li><li> 마취 동안 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 적용합니다. </li><li> 의사는 수술을 시작하기 전에 소독제 (클로르헥시딘 스크럽)와 함께 / 그의 손을 그녀를 세척해야합니다. 의사는 멸균 장갑, 안면 마스크, 가운 또는 깨끗한 실험실 코트를 착용해야합니다. 모든 장비는 세척 및 수술 전에 멸균해야합니다. 그 멸균가 완료되었는지 확인 악기의 수준에서 고온 가압 멸균 전에 악기 키트 내부 살균 표시기 스트립을 추가합니다. 외과 의사해야스트립에 전체 라인이 수술을 시작하기 전에 검은 색인지 확인합니다. 뿐만 아니라 테이프를 오토 클레이브로 나타내는 박스의 외측을 테이프입니다. 수술 당일에 여러 동물들에 대해 수행되어야하는 경우, 수술기구를 사이에 정리하고, 유리 비드 살균기에서 살균. 필요한 경우, 멸균 지혈제와 기기를 제거하는 적절한 시간 멸균기에서 악기의 핸들을 배치 무균 영역에서 냉각 한 다음의 기능적 단부를 배치하여 유리 비드 살균기에서 악기의 양단 살균 적절한 시간의 기간 동안 유리 비드 살균기로 악기. </li><li> 동물 마취되면, 다운 등의 표면에 수술 보드 등 그 테이프를 직면 복부 장소는 수술 보드에 동물의 앞다리를 보호하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 두개골의 기부에서 시작 복부 표면 미부 면도 및 중심선의 양쪽에 복부 주변이 SH가 있음을 확인aved 헤미 다이어프램가 기록되고있는 따라. 피부의 면도 표면에 포비돈 - 요오드 적용합니다. </li></ol></li><li> CMAP 녹음 준비 : <ol><li> 꼬리에 동물 준비, 장소 접지 전극의 피하에 따라 (그림 1). </li><li> 반대측 하복부에 기준 전극 피하 놓습니다. </li><li> 자체 접착 표면 스트립이나 디스크 기록 전극 (표면 스트립 전극의 크기 : 0.5 × 3cm)에 전도성 젤을 놓은 다음 일방적 늑골 가장자리를 따라 가로 표면 전극을 배치합니다. </li><li> transcutaneously 0.5 cm 간격 기관에 측면과 쇄골 우수 자극 전극을 배치합니다. 피부를 통해 약 1.0 cm 깊이 전극을 삽입합니다. 자신의 위치 후속 자극으로 이동하지 않도록 손으로 전극을 고정합니다. 참고 : insertio의 사이트에있는 피부에 90 ° 상대 각도 자극 전극N. </li></ol></li><li> 복합 근육 활동 전위 (CMAP) 녹음 : <ol><li> 컴퓨터를 이용한 데이터 분석 다음에 자극 / 앰프를 사용하여 전기 생리 녹음을 얻습니다. </li><li> 하나의 풀 자극의 자극 매개 변수를 0.5 밀리 초, 1.0 Hz에서 supramaximal 펄스를해야한다. 자극의 진폭은 V 6.0 내지 8.0 (그림 2A)이어야한다. 참고 : 실험 내에서 동물에서 동일한 진폭 자극 강도를 사용합니다. 목적은 자극의 최소 진폭을 사용하여 응답의 진폭을 최대화하는 것이다. 이는 자극시 발생 초기 응답은 자극 인공물임을 주목하는 것이 중요하다. 또한, 치료는 빠른 응답 CMAP 뒤에 자극 인공물, 이후 안정 / 평평한 기준선 앞에는 CMAP 응답을 획득하기 위해 취해 져야한다. 이러한 응답을 얻기 위해서는, 자극의 위치를​​ 변경하는 것이 필요할 수있다 및 / 또는기록 전극. </li><li> 자극 사이에 30 초를 기다린 평균 응답 (그림 2B - C)를 얻기 위해 행에 10 자극을 반복합니다. 피크 (그림 2A)에베이스 라인에서 진폭을 측정합니다. 횡격막 신경 / 다이어프램이 활성화되지 않은 경우에 동물의 호흡주기의 단계에서 횡격막 신경 자극을 실시한다. 절차는 반대측 헤미 다이어프램 동일한 동물에 반복 될 수있다. </li><li> NMJ 염색을 실시 할 경우 최종 CMAP 기록 세션 후, 동물을 관류. 약 한 번 같은 동물에 반복 매주 CMAP 녹음을 실시 (또는 선택의 간격). </li><li> 생존 CMAP 녹음 후, 동물이 깨어 sternally 기댄까지 복구하는 동안 순환 온수 가열 패드에 복구하고, 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 일단 sternally 휴식하고, 동물 최초의 48 시간 (회 이후)마다 12 시간을 모니터링 할 수 있습니다. (사이트가 회전하여, 주입 당 1-2 ml의; 피하 락 테이트 벨소리 솔루션이 하루 시간) 동물이 탈수 (이완 된 피부, 마음이 내키지 않음)로 표시되면, 유체를 관리 수술 후 체중 및 유체 손실이 안정 될 때까지합니다. 그들은 와이어 바 뚜껑 공급 장치에 도달 할 수없는 경우 식사를 장려하기 위해 필요한 경우 급성 수술 후 기간 동안 작은 접시에 연화 음식과 동물을 제공합니다. </li><li> 수술 종료 전에 0.05 ㎎ / ㎏의 용량으로 부 프레 노르 핀을 투여 한 후 12 시간 간격으로 첫 번째 24 시간 동안 (후 통증 / 스트레스 증상에 의존) 피하 주사를 통해 (위치는 회전). 통증이나 고통의 흔적은 그 후 발견하는 경우, 부 프레 노르 핀과 동물을 취급합니다. 나타내는 통증 / 고통의 징후는 활동의 부족, 발성, 식사의 부족 또는 마시는 (탈수), 과도한 체중 감소, 지키고, EXC 포함대던 또는 절개의 사이트에 긁힘 (메모리). 통증과 고통을 결정하는 데 사용되는 추가 기준은 외부 자극에 응답하지 않는, 일시적 또는 정당한 이유 발성, 고심한 흔적 또는 비정상 호흡, 지속적인 적갈색 NaSO4로 - 고 안압 방전 표시 경직을 포함한다. 또한 아픈 동물을 제안 가난한 위생의 증거를 모니터링 할 수 있습니다. 동물은 여전히​​ 치료 72 시간 후 조난 것으로 관찰되는 경우, 동물을 안락사 (상기 윤곽 통증 / 응력 기준에 따라, 수신 한 후 진통제 프로토콜은 전술). </li></ol></li></ol> 2. 다이어프램 신경 근육 접합 (NMJ) 분석 <ol><li> 동물 해부 : <ol><li> 동물에게 주사 마취의 과다 복용을 관리 (:; 복강 투여 0.225 ㎎ / ㎏에서 30.0 ㎎ / ㎏, 아세 프로 마진에서 285.0 ㎎ / ㎏, 자일 라진에서 케타민 3 회 이상 사용 복용량). 과량 후, 모든 동물은 안락사 t (개흉술)의 두 번째 방법이 있어야O 죽음을 보장합니다. 죽음은 심장과 호흡 정지를 관찰하고 동물의 고정 동공 확장을 지적으로 확인해야합니다. </li><li> 메스 또는 해부 가위 꼬리 쪽 중간 선을 따라 zyphoid 과정에서 절제를 연장 개복술을 실시한다. 조심스럽게 메스와 집게를 사용하여 기본 근육에서 피부와 결합 조직을 분리. </li><li> zyphoid 과정 위로 당기면서, 다이어프램이 뼈 주변에 부착 될 수 있도록 보장, 전체 다이어프램을 제거하는 해부 가위를 사용합니다. 그것은 전체 진동판의 성공적인 해부 허용되며, 격막의 근육의 손상을 방지하며 후속 염색법 근육을 세정하는데 도움이되므로 중요하다. 참고 : 필요한 경우이 시점에서, 동물 관류 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 청소 및 다이어프램의 염색 : <ol><li> 전체 해부 다이어프램을 핀, 우수한 표면은 유리 100mm 페트리 접시에 실리콘 고무로,이 위를 향하도록실체 현미경을 이용하여 20 분 - 4 % 파라 포름 알데히드 (PBS, 1 % 인산으로 이루어지는 완충 염수). 이 팽팽하게 다이어프램 신축성 및 곤충 핀을 이용하여, 다이어프램 근육 자체 (도 3)를 피닝 피하기 위해 주위 조직 아래에 핀. </li><li> 조심스럽게 # 5 포셉 작은 가위로 근육의 우수한 표면에서 결합 조직을 청소합니다. 참고 : 달리 명시하지 않는 한이 염색 프로토콜이 서서히 빛 덮여 실온에서 락의 모든 후속 단계를 수행합니다. 다이어프램 근육은 항상 완전히 건조를 방지하기 위해 액체에 빠져들되어 있는지 확인합니다. </li><li> (0.2 1X PBS, 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) / PBS, BSA / PBS, 4 % 파라 포름 알데히드 1X PBS에서 (PFA), 및 0.2 % TBP 2 % 이루어진 0.1 M 글리신 : 이전 염색에 필요한 모든 시약을 준비 2 % BSA / PBS)에서 % 트리톤 X100. -20 ° C에서 메탄올 - 멋진을 미리해야합니다. </li><li> 1X PBS에서 10 분 동안 세척 배. </li><li> 2에서 만든 0.1 M 글리신 (에 품어%의 BSA 30 분 / PBS). </li><li> 15 분 동안 RBTX (로다 민 - 복합 α-bungarotoxin) 솔루션에 품어. 다음과 같이 RBTX에 대한 해결 방법은 다음과 같습니다 로다 민 - 복합 알파 bungarotoxin 1 : 1X PBS 400 희석. 주 :이 프로토콜에서, 로다가 사용되지만, 임의의 선택은 형광 염색에 사용될 수있다. </li><li> 1X PBS에서 10 분 동안 세척 배. </li><li> -20 ° C의 냉동고에, 5 분 동안 메탄올과 함께 배양한다. 참고 : 냉동실에 근육을 배치하기 전에 메탄올을 추가하고 즉시 잠복기 다음과 같은 솔루션을 제거하지 마십시오. </li><li> 1X PBS에서 10 분 동안 세척 배. </li><li> 1 시간 동안 0.2 % TBP의 블록 (0.2 % 트리톤은 2 % BSA / PBS에 만든). </li><li> 락 동안 4 ° C에서 하룻밤 일차 항체 용액 (0.2 %에서 TBP)와 함께 품어. 항체의 희석 다음과 같이 SV2 (1시 10분) 및 SMI-312 (1 : 1,000). </li><li> 0.2 % TBP 10 분 동안 배를 씻으십시오. </li><li> FGM1 (FITC 접합 된 염소 항 - 마우스 IgG 100 희석 한 이차 항체를 이용하여 부화1; 1 시간 동안 락을하는 동안 0.2 % TBP)에서했다. 참고 : 염색을위한 프로토콜의 나머지 부분에 대한 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 1X PBS로 10 분간 세척 배. </li><li> 다시 깨끗한 이전 설치 및 coverslipping에 근육의 우수한 (위 참조) 표면에 결합 조직을 둘러싼. 주 : 청소 후 염색 후 즉시 샘플을 장착하는 것이 좋습니다. 그러나 필요한 샘플을 1X​​ PBS에 적용 할 수있는 경우, 증발을 방지하기 위해 파라 필름에 싸여 매일 PBS의 변화와 함께, 1 주까지 4 ℃에서 저장. </li><li> 유리 슬라이드, 비 hardset Vectashield와 커버 슬립에 장착시. 건조를 방지하기 위해 투명 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 장기적으로 -20 ° C에서 판지 슬라이드 폴더의 평면 거짓말을 저장 슬라이드. </li></ol></li><li> 분석 및 공 촛점 이미징 : <ol><li> 정량적 물들의 형태를 분석하여 직립 표면 형광을 사용 20X 및 40X 배율 하에서 헤미 다이어프램을 장착현미경. 주 : 다이어프램 염색 전체 마운트 방식으로 해석되기 때문에, 근육이 상당히 두껍다. 정지 화상이 비 - 공 초점 형광 현미경을 이용하여 촬영 한 경우 결과적으로, 형광 염색 대부분 완전히 초점이 맞지 않는다. 이 때문에, 이렇게하면 항상 제대로 개별 NMJs의 각각의 형태를 식별하기 위해 &quot;업&quot;및 &quot;다운&quot;근육 통해 집중할 수로서 현미경 실시간 NMJ 분석을 수행하는 것이 최상이다. 그들은 시냅스 후 수용체 클러스터 공간적 관계 조직을 통해 이동할 때이 방법을 사용하면, 하나는 쉽게 개별 모터 축삭 궤적을 따를 수있다. </li><li> 근육의 복부 대 지느러미 길이를 측정하여, 특정 척수 수준 (도 4H)로부터 지형 신경 분포 패턴에 따라 분석을위한 별도의 3 개의 섹션으로 분할 근육. </li><li> 근육과 MOV의 복부 지역에서 시작등쪽으로 보내고, 표면 근육 섬유에있는 얼굴 NMJs 욕실을 모두 분석 할 수 있습니다. RBTX 인해 라벨을 사용 큰 항체에 비해 독소의 작은 크기로 근육 내로 훨씬 더 깊이 침투 (인해 열악한 항체 침투 해석이 어려울 수 있으므로 깊은 표면으로부터 제 3-4 섬유보다 근육 섬유를 분석하지 않는다 뉴런). </li><li> 신경 세포의 사전 터미널 축삭 직경 두께와 신경 터미널의 모든 지역이 완전히 기본 근육의 아세틸 콜린 수용체 (AChRs)과 겹치는 경우 그대로 각 NMJ을 확인합니다. </li><li> 기본 근육 AChRs의 영역은 신경 단자 대응 비어있는 경우 부분적으로 denervated 각 NMJ을 확인합니다. </li><li> 완벽 denervated 각 NMJ를 확인하면 근육 AChRs이 해당하는 신경 말단 없습니다 (하나 신경 단말기의 부족으로 인해 간단하지 않습니다 확신 할 수 있도록이 초점이 같은 분야에 표시된 신경 세포와 다른 NMJs을하는 것도 중요하다 똥R 근육의 지역에서 항체 침투). </li><li> 하나 이상의 사전 터미널 축삭에 분포하는 개인 NMJ (이이 교차로에서 탈 신경과 reinnervation의 가능성이 시도 어느 정도가되었음을 나타냅니다)가있는 경우 각각의 NMJ이 같은 곱셈의 지배를 확인합니다. </li><li> 씬 NMJ 신경 단자와 기본 AChRs 사이의 완전한 중복을 가지고 있지만 얇은 사전 터미널 축삭이있는 경우 신경 지배를 각 NMJ (이 또한 reinnervation에서 탈 신경과 시도의 어떤 수준을 나타낸다) 확인합니다. </li><li> 각 동물에 대한 위의 NMJ 모든 범주에 대한 3 확인 된 지역의 각각에 대해 분석을 실시한다. 같은 실험 그룹에서 다른 동물의 결과와 각 동물의 데이터를 평균. 마우스 헤미 다이어프램에 쥐 헤미 다이어프램 근육과 150 ~ 200에서 약 200 ~ 300 접합 실험 그룹 당 최소 3 (바람직하게는 5 ~ 6 이상) 동물에서 정량화되어야​​한다. </li><li> 고해상도 공 촛점 이미지를 확보, 사용공 초점 현미경으로 게시 D,. </li><li> 20 ~ 40 μm의 깊이 0.3 μm의 스텝 크기에서 Z - 스택을 확보, 전체 시냅스 프로파일이 포함되어 있는지 확인하기 위해 위의 각 접합 아래 추가 광학 섹션을 수집합니다. </li><li> 최대 강도 예측에 Z 시리즈 이미지를 재구성하기 위해 수집 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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우리는 공개 할게 없다.

호흡 기능은 호흡 특히 다이어프램 신경 분포를 대상으로 치료법을 개발, 외상 SCI 및 루게릭 병에 모두 손상으로 임상 5,6 적합하다. 종합적 호흡 기능을 연구하기 위하여, 조합 된 접근 방법이 사용되어야한다. CMAPs 외부 횡격막 신경 자극의 방법에 의해 진동판의 기능적 신경 분포의 정도를 측정 할 수 있지만, 내인성 bulbospinal 호흡기 드라이브 8. 또한,이 녹음은, 특히 각각의 모터...

근 위축성 측삭 경화증 (ALS)은 상하 운동 뉴런 및 그에 근육 마비 양​​자의 손실과 관련된 쇠약 운동 신경 질환이다. 진단시 환자의 생존 기간은 평균 만 2~5년 1에 있습니다. 횡격막 운동 신경 (PhMN) 손실은 루게릭 병의 발병 기전의 중요한 구성 요소입니다. 환자는 궁극적으로 인해 다이어프램의 PhMN의 신경 분포, 영감 2,3의 주요 근육의 손실을 죽는다. 외상성 척수 손상 (SCI)는 또한 관련된 호흡 곤란으로 심각한 문제이다. SCI 약 12,000 새로운 사례 인한 외상성 척수 손상으로 매년 4를 발생한다. 위치, 유형 및 정도에 대한 질병 이질성에도 불구하고, SCI의 대부분의 경우는 종종 쇠약과 지속적인 호흡 타협 결과 자궁 경부 척수에 외상을 포함한다. ALS 및 SCI 이외에, 다른 중추 신경계 (CNS) 질환 w 연관 될 수있다i 번째 횡격막 호흡 부전 (5, 6). 횡격막 신경은 동측 헤미 다이어프램을 innervates 원심성 운동 신경과 그 동측 경부 척수의 C3-C5 수준에있는 PhMN의 세포 기관에서 유래. PhMN 출력 입쪽 복부 호흡 기 (rVRG) 7로 알려진 지역에서 뇌간 bulbospinal 입력 내림차순에 의해 제어된다. rVRG-PhMN 다이어프램 회로 흡기 호흡뿐만 아니라, 다른 비 - 환기 다이어프램 동작의 제어 핵심이다. 이 회로에 영향을 미치는 다양한 외상과 퇴행성 신경 질환은 호흡 기능과 환자의 삶의 질에 심각한 감소로 이어질 수 있습니다. 다이어프램 신경 근육 접합 (NMJ)에서 rVRG, PhMN 생존, 횡격막 신경 무결성 및 적절한 신경 분포에서 PhMNs에 입력을 내림차순 정상 다이어프램 기능에 대한 모든 필요하다. 이 기술을 사용하는 것이 중요하다정량적으로 루게릭 병, SCI 및 기타 중추 신경계 질환의 설치류 모델에서 생체 내에서이 회로를 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜에 의해, 목표 및 전기 생리 학적 수준 모두에서 다이어프램 PhMN의 신경 분포를 평가하는 실험 도구를 설명하기위한 것이다. 복합 근 활동 전위 (CMAPs) 지정된 운동 신경의 모든 원심성 운동 신경 축삭을 자극하고 표적 근섬유의 탈분극 유발 된 응답을 분석하여 기록된다. 이 기술은 8 PhMNs 의해 헤미 다이어프램의 기능적 신경 분포를 정량화하는 마취 된 쥐 생체 내에서 사용될 수있다. 인해 CMAPs는이 헤미 진동판 전체, 또한 질병을 추적하기 위해 다이어프램 NMJ에서 개별 모터 축삭 근섬유의 표현형을 확인하는 유용한 모든 (또는 적어도 대부분 / 대부분) 근섬유의 동시 기록을 나타낸다는 사실 - 이러한 부분 및 공단 등 치료 관련 형태 학적 변화테 탈 신경, 재생 돋 reinnervation. 이것은 근육 (9)에 걸쳐 개별적인 NMJs 형태의 상세한 평가를 한 후, 진동판의 전체 실장 면역 조직 화학 (IHC)를 통해 달성 될 수있다. CMAPs를 결합하고 NMJ 분석은 정량적으로 중추 신경계와 말초 신경계 질환의 쥐 모델에서 횡격막 신경 분포를 연구하기위한 강력한 방법을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

성인 흰쥐는 C4 척수 수준에서 10 ~ 12 중 하나 후궁 절제술 만 (손상되지 않은 제어) 또는 일방적 인 헤미 타박상 SCI를 받았다. 오주 수술 후에서, 피크 CMAP 진폭은 기록 된 헤미 - 다이어프램 크게 후궁 절제술 전용 제어 (그림 2B)에 비해 SCI 쥐 (그림 2C)에서 감소 후궁 절제술 / 상해 사이트로 동측. 헤미 다이어프램 모든 NMJs 제어 비 환부 야생형 래트 (도 4a, C)에...

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Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K 조회수.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

연구

신경과학

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in hindlimb muscles (such as the medial gastrocnemius, soleus, or plantaris muscle) in experimental rats. A crucial element of the method is the application of electrical stimuli delivered to a motor axon isolated from the ventral root. The stimuli may be delivered at constant or variable inter-pulse intervals. This method is suitable for experiments on animals at varying stages of maturity (young, adult or old). Moreover, this protocol can be used in experiments studying variability and plasticity of motor units evoked by a large spectrum of interventions. The results of these experiments may both augment basic knowledge in muscle physiology and be translated into practical applications. This procedure focuses on the surgical preparation for the recording and stimulation of MUs, with an emphasis on the necessary steps to achieve preparation stability and reproducibility of results.

This method allows the recording of the force of twitch and tetanic contractions and action potentials in three types of motor units in the rat medial gastrocnemius muscle. The functional isolation of a single motor unit is induced by electrical stimulation of the axon.

쥐 내측 위트로테미즘 근육의 단일 모터 단위의 기능적 격리

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...