Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

우리는 그들의 기술 지원에 대 한 로버트 Graffin, 폴 Duhant에 감사입니다.

실험 프로토콜 (2010/63/EU, 86/609/EEC 및 87-848/EEC) 동물 실험에 대 한 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 실시 하 고는 동물 윤리 위원회의 대학의 Namur (윤리 프로젝트 n ° 17-284에 의해 승인 되었다 ). 그림 1 은 2 개의 각각 접근 묘사: transdiaphragmatic 또는 transthoracic 주사. 남성 C57bl/6J 마우스를 사용 하 여 (n = 18), 연구에서 4 개월에서 3 세.
1입니다. CTB 솔루션의 준비
<ol><li>Transdiaphragmatic 주사:<ol>
<li>메 마른 물 0.2% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.</li>
		<li>각 마우스에 대 한 연결 된 33-게이지 바늘 (무딘 또는 짧은 경사) 살 균 10-µ L-microsyringe에서 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 7.5 µ L를 로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transthoracic 주입:<ol>
<li>메 마른 물 0.1% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.</li>
		<li>각 마우스에 대 한 베벨된 27 게이지 바늘으로 살 균 500 µ l 인슐린 주사기에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L를 로드 합니다. 참고: 소 주 하 고 살 균 수를 사용 하 고 제대로 CTB 분말을 용 해 합니다. 솔루션 4 ° C에서 한 달 동안 보관 하실 수 있습니다 (고정 되지 않습니다). 침전 물은 몇 일 후 양식 수 있습니다. 실내 온도에 해결책을 가져오고 사용 하기 전에 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Intrapleural 주사 전에 준비
<ol><li>고압 또는 유리 비드 소독 기를 사용 하 여 수술 전에 수술 도구를 소독. 깨끗 한 벤치 코트 수술 도구를 처리 하 고 수술을 할 준비. 참고: 수술 중에 사용 하는 어떤 물자 든 지 살 균 해야 합니다. 악기는 microsyringe 살 균 제 (액체) 닦 여야 한다 또는 같은 살 균 될 수 없는 단일 사용만. 외과 수술의 시작 전에 살 균 제 (액체 스크럽)와 그녀의 손을 씻어 해야 합니다. 외과 의사는 메 마른 장갑, 안 면, 그리고 깨끗 한 가운 착용 해야 한다.</li>
	<li>마 취의 적절 한 복용량을 관리 하 고 동물, 무게: 칵테일 마 취의 복 주입 (예: 마 취 제 100 mg/kg 및 xylazine 5 mg/kg).</li>
	<li>발가락을 꼬집어 하거나 마우스 제대로 마 취 여부를 확인 하 십시오 반사의 손실에 대 한 확인 합니다. 각 막을 보호 하기 위해 수 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>(Transdiaphragmatic 프로시저)에 대 한 복 부 피부 또는 오른쪽 면 흉부 피부 (transthoracic 절차), 전기 헤어 클리퍼 스를 사용 하 여 신중 하 게 면도. 잘 충분히 넓은 방지 하 고 수술 필드에 지 고 머리를 면도.</li>
	<li>면도 영역에 10% 요오드 솔루션의 국 소 응용 프로그램에 의해 무 균 상태를 확인 합니다. 주변으로 사이트의 중심에서 스크럽 주의 요오드 솔루션 외과 사이트 스크럽.</li>
	<li>수술 내내 homeothermic 패드를 사용 하 여 동물의 체온을 유지 하기 위해.</li>
</ol>3. Intrapleural 주사 Transdiaphragmatic 접근을 사용 하 여
<ol><li>생리대에 부정사 위치에 마 취 마우스 내려 놓. 동물의 목 아래 압 연된 거 즈 패드를 놓습니다. 성인 마우스 두께에서 0.5 인치 연된 거 즈 패드를 사용 합니다. 움직임이 있는 경우를 피하기 위해 수술 보드에이 패드를 테이프.</li>
	<li>메스 블레이드를 사용 하 여 incise는 중간에 따라 복 부 피부: 피부 긴장 늦추지 수 있도록 다른 한편으로 옆으로 피부를 스트레칭 하는 동안 탯 줄 지역 칼 과정에서 절 개. 내부 장기의 손상을 방지 하려면 블레이드에 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다.</li>
	<li>작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 피부 절 개 주위 복 부 근육에서 분리 합니다. 이 절차는 근육과 피부 수술의 끝에 떨어져 바느질에 도움이 됩니다.</li>
	<li>개복 술 작은 위를 사용 하 여 수행 합니다. 수행은 배꼽의 수준에서 buttonhole 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다. 흰색 라인을 따라 복 부 근육을 incise ("교육 알바") 칼 과정까지.</li>
	<li>횡 경 막의 복 부 표면, 시각화 하기 위해 상업적 또는 수 제 견인 기를 사용 하 여 복 부 근육을 철회. 참고: 이러한 견인 기 L-후크19에 midi 크기 종이 클립에서 만들 수 있습니다.</li>
	<li>개복 술, 그리고 벤치 코트를 브래킷으로 아래로 테이프의 양쪽 모두에 밖으로 스트레칭. 횡 경 막의 복 부 표면은 penumbra에 더 이상 시야의 조명 최적화. 이 목적에 대 한 가장 강력한 조명 장치를 통해 광선으로 LED 램프입니다.</li>
	<li>한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여, xyphoid 부록을 들어올린 풀 간 (그림 2A)의 측면 돌출부 다운. 다른 한편으로는, 작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 잘라 매 다 인 대, 쓸 개 또는 횡 경 막 (그림 2B) 손상 없이.</li>
	<li>Xyphoid 부록을 들어올려 한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여. 반면에 해밀턴 주사기를 파악. 중간 및 crural 지역 (그림 3A, 그림 3B에서 삽입 된) 각각 sternal, 커버를 오른쪽 hemidiaphragm에 주입의 3 개 사이트를 대상.</li>
	<li>다이어 프 램 두께 쥐7약 0.37 m m으로, 호흡 시 폐 방지에 다이어 프 램 시트 넘어 바늘 1 개 이상 또는 2 m m를 삽입 합니다. 각 사이트 (그림 4B)에서 오른쪽 격 막 통해 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 2.5 µ L를 제공 합니다. 횡 경 막의 안정화 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>주사 (그림 1A)의 3 동측 사이트 및 contralaterally PhMN 풀의 양자 라벨에 대 한이 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>개복 술 사이트를 닫으려면 resorbable와 복 부 근육을 4-0 봉합 사 봉합. 사용 중단된 바늘 간격으로 3 m m. 주식 피부 상처 9.0 m m 클립 폐쇄. 스테이플 미루어에서 동물을 방지 하기 위해 스테이플 조입니다. 공간에는 약 5 m m 떨어져 스테이플링을 수행합니다. 할 하지 지나치게 조여 상처 클립으로이 장애 치유 이어질 수 있습니다.</li>
	<li>막힘을 방지 하기 위해 증류수로 깨끗 한 마이크로 주사기. 천천히 그리고 추방 2-3 번. 주사기로 공기를 그릴 하지 않습니다.</li>
</ol>4. Intrapleural 주입 Transthoracic 접근을 사용 하 여
참고:이 방법은 쥐4 에 설명 된 절차에서 영감을 하 고 마우스에 적응 했다.
<ol><li>마 취 마우스 왼쪽 옆 decubitus 위치가 열 패드 (그림 4A)에 누워.</li>
	<li>수동 촉진 (그림 4B)에 의해 팔꿈치 영역 아래 여섯 번째와 일곱 번째 갈비뼈를 식별 합니다.</li>
	<li>조 수 바로 앞-및 뒷 다리-팔 다리 (그림 5A)를 확장 하는 동안 cranially 중심 및 접선 여섯 번째 또는 일곱 번째 갈비뼈, 3 밀리미터 깊은 (그림 1B 및 그림 5B) 경사와 피부에서 주사기를 삽입 합니다.</li>
	<li>부드럽게 흉 강 (그림 5C, 그림 1B에서인세트)에 잘 위치, 갈비뼈를 올려서 확인 하 바늘을 상승 합니다.</li>
	<li>가슴 벽에 두 개의 손가락으로 약간의 압력을 적용 하 여 가슴의 움직임을 호흡 안정.</li>
	<li>다른 손에 주사기를 들고, 하는 동안 단일 주사에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L을 제공 합니다.</li>
</ol>5. 수술 치료
<ol><li>절차 후 즉시 복구에 대 한 homeothermic 패드에서 바로 옆 decubitus 위치에 마우스를 놓는다. 이 흉 막 구멍의 오른쪽에 확산 추적을 보장 하 고 동물의 호흡을 모니터링을 위한 수 있습니다.</li>
	<li>살 균 염 분 솔루션 i.p.의 1 mL를 피하 관리 합니다. 동물 나타나면 탈수 또는 무관심 후속 주사를 제공 합니다.</li>
	<li>Buprenorphine의 0.1 mg/kg 피하 관리 처음 이틀 후 수술, 어떤 잠재적인 통증을 최소화 하는 동안 하루에 두 번. 참고: 많은 기관 여기 그려져 개복 술과 같은 침략 적인 절차에 대 한 복합 진통을 권하고 싶습니다. 이 비 스테로이드 항 염증 제 (NSAID) 약 절 개 사이트에 로컬 마 취 에이전트의 사용을 포함할 수 있습니다. 이 약물은 일반적으로 바람 통증을 최소화 하기 위해 첫 번째 절 개 전에 전달 됩니다.</li>
	<li>동물 안락사까지 매일 모니터링 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

저자는 공개 없다.

성인 쥐의 어떤 긴장 든 지 또는 어떤 실험 패러다임 다이어 프 램 PhMN 회로의 무결성을 평가 해야 되 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 루 경화 증 (ALS) 및 자 궁 경관 척수 상해 (cSCI) PhMN 손실, 인할지 축 삭 및 후속 호흡 타협의 참가자 퇴보와 관련 된 조건들이 있습니다. ALS 또는 cSCI의 동물 모델 histopathological와 기능 호흡 적자 인간의 질병에서 관찰 모방. 이러한 모델에?...

연구의 목표 마우스 척수 섹션에 인할지 모터 신경 (PhMN)를 식별 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시 하는 것입니다. 흉 막 캐비티에 형광 신경 해부학 추적기의 주입은 횡 경 막에 인할지 신경 근육 학 계획에 도달 하 인할지 축 삭을 따라 역행 전송 인할지 셀 시체를 사용 하 여 전달 방법으로 선정 되었다. Intrapleural 전달의 두 가지 기술을 설명: transthoracic 대 transdiaphragmatic.
인할지 모터 뉴런 누구의 axons 궁극적으로 횡 경 막 자극 인할지 신경으로 수렴 하는 척추 릴레이 셀 있습니다. 이들은 더 낮은 모터 신경 inspiratory 드라이브 안구 호흡기 센터에서 수신 하 고 횡 경 막 신경-근육 접합부 (NMJ) 릴레이. PhMN는 각 hemicord, 중반-자 궁 경부 척추를 따라 실행 한 두 개의 모터 열으로 구성 되어 있습니다. 인간을 포함 한 포유류 종의 대부분, 인할지 모터 열 C61,2,3레벨 c 3에서에서 퍼졌다. 우리와 다른 PhMN 쥐와 쥐 척수4,5,6,,78c 3-c 5 수준에 집중 하는 것을 확인 했습니다. 인할지 셀의 지형 분포 되지 않습니다 무작위로. 모터 뉴런 innervating 횡 경 막의 sternal 부분 crural 부분 innervating 모터 신경은 더 꼬리 (C5)9반면 인할지 모터 풀 (C3)의 두개골 부분에 더 조밀 하 게 배포 됩니다. 또한, PhMN 복 부 경적 회색 문제에 각종으로 클러스터링 됩니다. C3 수준 인할지 셀 클러스터 거짓말 측면, 그때 그들은 ventrolateral 방향에서 이동 하 고 ventromedially는 가장 꼬리 레벨10,11에서 찾을 수 있습니다.
영감 중 그들의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것 건강 한 척수에서 PhMN를 정확 하 게 식별 하지만 또한 퇴행 성 질환 또는 척수의 외상 성 상해 등 병 적인 상태에 있는 동안 그들의 운명에 따라 매우 중요입니다. 때문에 PhMN 차이가 없습니다 형태학 상으로 다른 자 궁 경부 모터 신경에서 PhMN의 주 호흡기 센터8또는 격 막 NMJ7 또는 수준에서 신경 해부학 추적기의 대상된 배달에 의존 인할지 신경4. 추적 프로그램 신경 섬유에 의해 촬영 및 자 궁 경부 척추에 인할지 셀 시체까지 수행 어디에 직접 또는 간접 검출 시스템을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 역행 또는 참가자 추적기 어원이 같은 말의 광범위 한 범위와 상업적으로 사용할 수 있습니다. 각 추적 부여 없이, 주목할 만한, trans 시 냅 스 추적에 대 한 낮은 또는 높은 능력.
현재 연구에서 우리가 선택 했다 콜레라 독 소 (CTB) 알 렉 사 Fluor 555 (이제부터 CTB fluorophore 라고도 함)와 공업화의 beta 소 단위 형광 라벨으로 냉동된 척수 섹션에 PhMN의 직접적인 시각화 수 있도록. CTB는 실험 데이터는 transneuronal 통로12를 표시 하는 경향이 있지만 일반적으로 monosynaptic 추적 프로그램 설명. CTB은 ganglioside GM1 신경 결말의 원형질 막에 바인딩할 수가 있습니다. CTB는 역행 패션13,14에서 바인딩과 그물에 clathrin-또는-독립적인 메커니즘 및 trans Golgi 네트워크를 통해 트래픽을 통해 내 면. 국제화와 역행 전송 microtubule 네트워크17에 뿐만 아니라 말라 골격15,16 에 종속 될 것 같다.
퇴행 성 신경 해부학 추적 프로그램 다이어 프 램 PhMN 회로 라벨로 CTB의 유용성을 입증, CTB fluorophore intrapleurally는 전달 했다. CTB 두 가지 기법을 사용 하 여 관리 했다: 첫 번째 포함는 개복 술과 여러 transdiaphragmatic 주사; 번째, 보다 적게 침략 적, 독특한 transthoracic 주사를 사용합니다. 4 일 후, 붙일 레이블 PhMNs에서 건강에서 그리고 spinally 부상 (C4) 동물에서 경부 척수에 정량 했다.

<table><tbody><tr><td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td><td>Keller</td><td>31-101</td><td></td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14058-00</td><td></td></tr><tr><td>Soft tweezers</td><td>F.S.T.</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Swann Morton</td><td>No.11 or 15</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>C22843</td><td>Bring at room temperature before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>701RN</td><td></td></tr><tr><td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td><td>Filter Service</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td><td>Terumo</td><td>BS05M2713</td><td></td></tr><tr><td>Orientable LED lamp</td><td>V.W.R.</td><td>631-0995</td><td></td></tr><tr><td>Resorbable 4/0 sutures</td><td>S.M.I. AG</td><td>15151519</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>F.S.T.</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>9mm autoclips</td><td>Bioseb</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 9mm applier</td><td>Bioseb</td><td>MikRon 9mm</td><td></td></tr></tbody></table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

인할지 모터 신경은 자 궁 경부 모터 신경 c 3에서 발생 하는 대부분 포유류 종에서 C6 수준. Axonal 예측 인할지 신경 innervating 호흡기 횡 경 막에 수렴. 척수 조각에서 인할지 모터 뉴런 형태학 또는 생 화 확 적인 기준에 다른 모터 신경에서 확인 될 수 없습니다. 우리 쥐, 콜레라 독 소 단위 베타 (CTB)는 fluorophore를 활용의 다음 intrapleural 주사 인할지 모터 신경 셀 시체를 시각화에 대 한 절차의 설명을 제공 합니다. 이 형광 신경 해부학 추적 횡 경 막 신경 근육 학 교차로에서 잡, 인할지 축 삭을 따라 retrogradely 실시 인할지 셀 시체에 도달 하는 기능이 있다. Intrapleural CTB 배달의 두 방법 론 적 접근 비교: transthoracic 주사 대 transdiaphragmatic. 두 방법 모두 성공 하며 인할지 모터 뉴런 CTB 표시 된의 유사한 수 있습니다. 결론적으로, 이러한 기술은 시각화 또는 다이어 프 램 인할지 회로에 초점을 맞춘 등 다양 한 실험 연구에서 인할지 모터 뉴런 계량에 적용할 수 있습니다.

남성 C57bl/6J 마우스 (n = 18), 4 개월에서 3 세 연구에 포함 됐다. 실험의 하루 0, 8 마우스 게시 프로토콜7,18에 따라 일방적인 C4 타 박상을, 오른쪽 면을 받았다. 가짜 프로시저로 10 쥐 박상 없이 C4 위에 laminectomy를 받았다. 3 일에 쥐 위에서 설명한 두 가지 절차에 따라 CTB fluorophore의 intrapleural 주사에 대 한 준비가 되어 있었다. 7 일에...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

여기, 우리 intrapleural 배달 fluorophore의 활용 콜레라 독 소 단위 베타 후 쥐에서 인할지 모터 뉴런 식별 프로토콜을 설명 합니다. 흉 막 캐비티 삽입 하 두 기술을 비교: transthoracic 접근 대 transdiaphragmatic.

마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

retrograde-neuroanatomical-tracing-of-phrenic-motor-neurons-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K 조회수.  Université de Namur. 여기, 우리 intrapleural 배달 fluorophore의 활용 콜레라 독 소 단위 베타 후 쥐에서 인할지 모터 뉴런 식별 프로토콜을 설명 합니다. 흉 막 캐비티 삽입 하 두 기술을 비교: transthoracic 접근 대 transdiaphragmatic.

비디오: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

연구

신경과학

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

발생학

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

A Mouse Model of Direct Anastomosis via the Prespinal Route for Crossing Nerve Transfer Surgery

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. Recently, this surgery was creatively applied in the clinical treatment of brain injury and achieved substantial rehabilitation of the paralyzed arm. This functional recovery after the surgery suggests that peripheral sensorimotor intervention induces profound neuroplasticity to compensate for the loss of function after brain damage; however, the underlying neural mechanism is poorly understood. Therefore, an emergent clinical animal model is required. Here, we simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice. Neuroanatomical, electrophysiological, and behavioral experiments helped identify that the transferred nerves of these mice successfully reinnervated the impaired forelimb and contributed to accelerating motor recovery after brain injury. Therefore, the mouse model revealed the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

We simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice, contributing to the study of the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

교차 신경 전달 수술을 위한 척추 전 경로를 통한 직접 문합술의 마우스 모델

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. ...

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. This standard approach can be challenging for targets in the caudal brainstem and upper cervical cord due to specific anatomical challenges as these sites are remote from skull landmarks, leading to imprecision. Here we outline an alternative stereotaxic approach via the cisterna magna that has been used to target discrete regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. The cisterna magna extends from the occipital bone to the atlas (i.e., the second vertebral bone), is filled with cerebrospinal fluid, and is covered by dura mater. This approach provides a reproducible route of access to select central nervous system (CNS) structures that are otherwise hard to reach due to anatomical barriers. Furthermore, it allows for direct visualization of brainstem landmarks in close proximity to the target sites, increasing accuracy when delivering small injection volumes to restricted regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. Finally, this approach provides an opportunity to avoid the cerebellum, which can be important for motor and sensorimotor studies.

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice commonly involves access through the skull bones and is guided by skull landmarks. Here we outline an alternative stereotaxic approach to target the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna that relies on direct visualization of brainstem landmarks.

마우스의 Cisterna Magna를 통해 Caudal Brainstem과 Upper Cervical Spinal Spind를 미세 주입하는 입체 택시 외과 적 접근법

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

마우스 교감신경 신경 세포 표적화: 요추 교감신경 절제술 접근법

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

저자 스포트라이트: 교감신경 뉴런의 가소성 탐구

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

교차 신경 전달 수술을 위한 척추 전 경로를 통한 직접 문합술의 마우스 모델

마우스의 Cisterna Magna를 통해 Caudal Brainstem과 Upper Cervical Spinal Spind를 미세 주입하는 입체 택시 외과 적 접근법

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술