우리는 그들의 기술 지원에 대 한 로버트 Graffin, 폴 Duhant에 감사입니다.

실험 프로토콜 (2010/63/EU, 86/609/EEC 및 87-848/EEC) 동물 실험에 대 한 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 실시 하 고는 동물 윤리 위원회의 대학의 Namur (윤리 프로젝트 n ° 17-284에 의해 승인 되었다 ). 그림 1 은 2 개의 각각 접근 묘사: transdiaphragmatic 또는 transthoracic 주사. 남성 C57bl/6J 마우스를 사용 하 여 (n = 18), 연구에서 4 개월에서 3 세.
1입니다. CTB 솔루션의 준비
<ol><li>Transdiaphragmatic 주사:<ol>
<li>메 마른 물 0.2% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.</li>
		<li>각 마우스에 대 한 연결 된 33-게이지 바늘 (무딘 또는 짧은 경사) 살 균 10-µ L-microsyringe에서 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 7.5 µ L를 로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transthoracic 주입:<ol>
<li>메 마른 물 0.1% (w/v)의 농도에 CTB 전원 해산.</li>
		<li>각 마우스에 대 한 베벨된 27 게이지 바늘으로 살 균 500 µ l 인슐린 주사기에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L를 로드 합니다. 참고: 소 주 하 고 살 균 수를 사용 하 고 제대로 CTB 분말을 용 해 합니다. 솔루션 4 ° C에서 한 달 동안 보관 하실 수 있습니다 (고정 되지 않습니다). 침전 물은 몇 일 후 양식 수 있습니다. 실내 온도에 해결책을 가져오고 사용 하기 전에 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Intrapleural 주사 전에 준비
<ol><li>고압 또는 유리 비드 소독 기를 사용 하 여 수술 전에 수술 도구를 소독. 깨끗 한 벤치 코트 수술 도구를 처리 하 고 수술을 할 준비. 참고: 수술 중에 사용 하는 어떤 물자 든 지 살 균 해야 합니다. 악기는 microsyringe 살 균 제 (액체) 닦 여야 한다 또는 같은 살 균 될 수 없는 단일 사용만. 외과 수술의 시작 전에 살 균 제 (액체 스크럽)와 그녀의 손을 씻어 해야 합니다. 외과 의사는 메 마른 장갑, 안 면, 그리고 깨끗 한 가운 착용 해야 한다.</li>
	<li>마 취의 적절 한 복용량을 관리 하 고 동물, 무게: 칵테일 마 취의 복 주입 (예: 마 취 제 100 mg/kg 및 xylazine 5 mg/kg).</li>
	<li>발가락을 꼬집어 하거나 마우스 제대로 마 취 여부를 확인 하 십시오 반사의 손실에 대 한 확인 합니다. 각 막을 보호 하기 위해 수 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>(Transdiaphragmatic 프로시저)에 대 한 복 부 피부 또는 오른쪽 면 흉부 피부 (transthoracic 절차), 전기 헤어 클리퍼 스를 사용 하 여 신중 하 게 면도. 잘 충분히 넓은 방지 하 고 수술 필드에 지 고 머리를 면도.</li>
	<li>면도 영역에 10% 요오드 솔루션의 국 소 응용 프로그램에 의해 무 균 상태를 확인 합니다. 주변으로 사이트의 중심에서 스크럽 주의 요오드 솔루션 외과 사이트 스크럽.</li>
	<li>수술 내내 homeothermic 패드를 사용 하 여 동물의 체온을 유지 하기 위해.</li>
</ol>3. Intrapleural 주사 Transdiaphragmatic 접근을 사용 하 여
<ol><li>생리대에 부정사 위치에 마 취 마우스 내려 놓. 동물의 목 아래 압 연된 거 즈 패드를 놓습니다. 성인 마우스 두께에서 0.5 인치 연된 거 즈 패드를 사용 합니다. 움직임이 있는 경우를 피하기 위해 수술 보드에이 패드를 테이프.</li>
	<li>메스 블레이드를 사용 하 여 incise는 중간에 따라 복 부 피부: 피부 긴장 늦추지 수 있도록 다른 한편으로 옆으로 피부를 스트레칭 하는 동안 탯 줄 지역 칼 과정에서 절 개. 내부 장기의 손상을 방지 하려면 블레이드에 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다.</li>
	<li>작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 피부 절 개 주위 복 부 근육에서 분리 합니다. 이 절차는 근육과 피부 수술의 끝에 떨어져 바느질에 도움이 됩니다.</li>
	<li>개복 술 작은 위를 사용 하 여 수행 합니다. 수행은 배꼽의 수준에서 buttonhole 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다. 흰색 라인을 따라 복 부 근육을 incise ("교육 알바") 칼 과정까지.</li>
	<li>횡 경 막의 복 부 표면, 시각화 하기 위해 상업적 또는 수 제 견인 기를 사용 하 여 복 부 근육을 철회. 참고: 이러한 견인 기 L-후크19에 midi 크기 종이 클립에서 만들 수 있습니다.</li>
	<li>개복 술, 그리고 벤치 코트를 브래킷으로 아래로 테이프의 양쪽 모두에 밖으로 스트레칭. 횡 경 막의 복 부 표면은 penumbra에 더 이상 시야의 조명 최적화. 이 목적에 대 한 가장 강력한 조명 장치를 통해 광선으로 LED 램프입니다.</li>
	<li>한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여, xyphoid 부록을 들어올린 풀 간 (그림 2A)의 측면 돌출부 다운. 다른 한편으로는, 작은 위를 사용 하 여 신중 하 게 잘라 매 다 인 대, 쓸 개 또는 횡 경 막 (그림 2B) 손상 없이.</li>
	<li>Xyphoid 부록을 들어올려 한 손으로 부드러운 핀셋을 사용 하 여. 반면에 해밀턴 주사기를 파악. 중간 및 crural 지역 (그림 3A, 그림 3B에서 삽입 된) 각각 sternal, 커버를 오른쪽 hemidiaphragm에 주입의 3 개 사이트를 대상.</li>
	<li>다이어 프 램 두께 쥐7약 0.37 m m으로, 호흡 시 폐 방지에 다이어 프 램 시트 넘어 바늘 1 개 이상 또는 2 m m를 삽입 합니다. 각 사이트 (그림 4B)에서 오른쪽 격 막 통해 CTB 솔루션 (0.2 %w / v)의 2.5 µ L를 제공 합니다. 횡 경 막의 안정화 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>주사 (그림 1A)의 3 동측 사이트 및 contralaterally PhMN 풀의 양자 라벨에 대 한이 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>개복 술 사이트를 닫으려면 resorbable와 복 부 근육을 4-0 봉합 사 봉합. 사용 중단된 바늘 간격으로 3 m m. 주식 피부 상처 9.0 m m 클립 폐쇄. 스테이플 미루어에서 동물을 방지 하기 위해 스테이플 조입니다. 공간에는 약 5 m m 떨어져 스테이플링을 수행합니다. 할 하지 지나치게 조여 상처 클립으로이 장애 치유 이어질 수 있습니다.</li>
	<li>막힘을 방지 하기 위해 증류수로 깨끗 한 마이크로 주사기. 천천히 그리고 추방 2-3 번. 주사기로 공기를 그릴 하지 않습니다.</li>
</ol>4. Intrapleural 주입 Transthoracic 접근을 사용 하 여
참고:이 방법은 쥐4 에 설명 된 절차에서 영감을 하 고 마우스에 적응 했다.
<ol><li>마 취 마우스 왼쪽 옆 decubitus 위치가 열 패드 (그림 4A)에 누워.</li>
	<li>수동 촉진 (그림 4B)에 의해 팔꿈치 영역 아래 여섯 번째와 일곱 번째 갈비뼈를 식별 합니다.</li>
	<li>조 수 바로 앞-및 뒷 다리-팔 다리 (그림 5A)를 확장 하는 동안 cranially 중심 및 접선 여섯 번째 또는 일곱 번째 갈비뼈, 3 밀리미터 깊은 (그림 1B 및 그림 5B) 경사와 피부에서 주사기를 삽입 합니다.</li>
	<li>부드럽게 흉 강 (그림 5C, 그림 1B에서인세트)에 잘 위치, 갈비뼈를 올려서 확인 하 바늘을 상승 합니다.</li>
	<li>가슴 벽에 두 개의 손가락으로 약간의 압력을 적용 하 여 가슴의 움직임을 호흡 안정.</li>
	<li>다른 손에 주사기를 들고, 하는 동안 단일 주사에 CTB 솔루션 (0.1 %w / v)의 20 µ L을 제공 합니다.</li>
</ol>5. 수술 치료
<ol><li>절차 후 즉시 복구에 대 한 homeothermic 패드에서 바로 옆 decubitus 위치에 마우스를 놓는다. 이 흉 막 구멍의 오른쪽에 확산 추적을 보장 하 고 동물의 호흡을 모니터링을 위한 수 있습니다.</li>
	<li>살 균 염 분 솔루션 i.p.의 1 mL를 피하 관리 합니다. 동물 나타나면 탈수 또는 무관심 후속 주사를 제공 합니다.</li>
	<li>Buprenorphine의 0.1 mg/kg 피하 관리 처음 이틀 후 수술, 어떤 잠재적인 통증을 최소화 하는 동안 하루에 두 번. 참고: 많은 기관 여기 그려져 개복 술과 같은 침략 적인 절차에 대 한 복합 진통을 권하고 싶습니다. 이 비 스테로이드 항 염증 제 (NSAID) 약 절 개 사이트에 로컬 마 취 에이전트의 사용을 포함할 수 있습니다. 이 약물은 일반적으로 바람 통증을 최소화 하기 위해 첫 번째 절 개 전에 전달 됩니다.</li>
	<li>동물 안락사까지 매일 모니터링 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

저자는 공개 없다.

성인 쥐의 어떤 긴장 든 지 또는 어떤 실험 패러다임 다이어 프 램 PhMN 회로의 무결성을 평가 해야 되 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 루 경화 증 (ALS) 및 자 궁 경관 척수 상해 (cSCI) PhMN 손실, 인할지 축 삭 및 후속 호흡 타협의 참가자 퇴보와 관련 된 조건들이 있습니다. ALS 또는 cSCI의 동물 모델 histopathological와 기능 호흡 적자 인간의 질병에서 관찰 모방. 이러한 모델에?...

연구의 목표 마우스 척수 섹션에 인할지 모터 신경 (PhMN)를 식별 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시 하는 것입니다. 흉 막 캐비티에 형광 신경 해부학 추적기의 주입은 횡 경 막에 인할지 신경 근육 학 계획에 도달 하 인할지 축 삭을 따라 역행 전송 인할지 셀 시체를 사용 하 여 전달 방법으로 선정 되었다. Intrapleural 전달의 두 가지 기술을 설명: transthoracic 대 transdiaphragmatic.
인할지 모터 뉴런 누구의 axons 궁극적으로 횡 경 막 자극 인할지 신경으로 수렴 하는 척추 릴레이 셀 있습니다. 이들은 더 낮은 모터 신경 inspiratory 드라이브 안구 호흡기 센터에서 수신 하 고 횡 경 막 신경-근육 접합부 (NMJ) 릴레이. PhMN는 각 hemicord, 중반-자 궁 경부 척추를 따라 실행 한 두 개의 모터 열으로 구성 되어 있습니다. 인간을 포함 한 포유류 종의 대부분, 인할지 모터 열 C61,2,3레벨 c 3에서에서 퍼졌다. 우리와 다른 PhMN 쥐와 쥐 척수4,5,6,,78c 3-c 5 수준에 집중 하는 것을 확인 했습니다. 인할지 셀의 지형 분포 되지 않습니다 무작위로. 모터 뉴런 innervating 횡 경 막의 sternal 부분 crural 부분 innervating 모터 신경은 더 꼬리 (C5)9반면 인할지 모터 풀 (C3)의 두개골 부분에 더 조밀 하 게 배포 됩니다. 또한, PhMN 복 부 경적 회색 문제에 각종으로 클러스터링 됩니다. C3 수준 인할지 셀 클러스터 거짓말 측면, 그때 그들은 ventrolateral 방향에서 이동 하 고 ventromedially는 가장 꼬리 레벨10,11에서 찾을 수 있습니다.
영감 중 그들의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것 건강 한 척수에서 PhMN를 정확 하 게 식별 하지만 또한 퇴행 성 질환 또는 척수의 외상 성 상해 등 병 적인 상태에 있는 동안 그들의 운명에 따라 매우 중요입니다. 때문에 PhMN 차이가 없습니다 형태학 상으로 다른 자 궁 경부 모터 신경에서 PhMN의 주 호흡기 센터8또는 격 막 NMJ7 또는 수준에서 신경 해부학 추적기의 대상된 배달에 의존 인할지 신경4. 추적 프로그램 신경 섬유에 의해 촬영 및 자 궁 경부 척추에 인할지 셀 시체까지 수행 어디에 직접 또는 간접 검출 시스템을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 역행 또는 참가자 추적기 어원이 같은 말의 광범위 한 범위와 상업적으로 사용할 수 있습니다. 각 추적 부여 없이, 주목할 만한, trans 시 냅 스 추적에 대 한 낮은 또는 높은 능력.
현재 연구에서 우리가 선택 했다 콜레라 독 소 (CTB) 알 렉 사 Fluor 555 (이제부터 CTB fluorophore 라고도 함)와 공업화의 beta 소 단위 형광 라벨으로 냉동된 척수 섹션에 PhMN의 직접적인 시각화 수 있도록. CTB는 실험 데이터는 transneuronal 통로12를 표시 하는 경향이 있지만 일반적으로 monosynaptic 추적 프로그램 설명. CTB은 ganglioside GM1 신경 결말의 원형질 막에 바인딩할 수가 있습니다. CTB는 역행 패션13,14에서 바인딩과 그물에 clathrin-또는-독립적인 메커니즘 및 trans Golgi 네트워크를 통해 트래픽을 통해 내 면. 국제화와 역행 전송 microtubule 네트워크17에 뿐만 아니라 말라 골격15,16 에 종속 될 것 같다.
퇴행 성 신경 해부학 추적 프로그램 다이어 프 램 PhMN 회로 라벨로 CTB의 유용성을 입증, CTB fluorophore intrapleurally는 전달 했다. CTB 두 가지 기법을 사용 하 여 관리 했다: 첫 번째 포함는 개복 술과 여러 transdiaphragmatic 주사; 번째, 보다 적게 침략 적, 독특한 transthoracic 주사를 사용합니다. 4 일 후, 붙일 레이블 PhMNs에서 건강에서 그리고 spinally 부상 (C4) 동물에서 경부 척수에 정량 했다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

인할지 모터 신경은 자 궁 경부 모터 신경 c 3에서 발생 하는 대부분 포유류 종에서 C6 수준. Axonal 예측 인할지 신경 innervating 호흡기 횡 경 막에 수렴. 척수 조각에서 인할지 모터 뉴런 형태학 또는 생 화 확 적인 기준에 다른 모터 신경에서 확인 될 수 없습니다. 우리 쥐, 콜레라 독 소 단위 베타 (CTB)는 fluorophore를 활용의 다음 intrapleural 주사 인할지 모터 신경 셀 시체를 시각화에 대 한 절차의 설명을 제공 합니다. 이 형광 신경 해부학 추적 횡 경 막 신경 근육 학 교차로에서 잡, 인할지 축 삭을 따라 retrogradely 실시 인할지 셀 시체에 도달 하는 기능이 있다. Intrapleural CTB 배달의 두 방법 론 적 접근 비교: transthoracic 주사 대 transdiaphragmatic. 두 방법 모두 성공 하며 인할지 모터 뉴런 CTB 표시 된의 유사한 수 있습니다. 결론적으로, 이러한 기술은 시각화 또는 다이어 프 램 인할지 회로에 초점을 맞춘 등 다양 한 실험 연구에서 인할지 모터 뉴런 계량에 적용할 수 있습니다.

남성 C57bl/6J 마우스 (n = 18), 4 개월에서 3 세 연구에 포함 됐다. 실험의 하루 0, 8 마우스 게시 프로토콜7,18에 따라 일방적인 C4 타 박상을, 오른쪽 면을 받았다. 가짜 프로시저로 10 쥐 박상 없이 C4 위에 laminectomy를 받았다. 3 일에 쥐 위에서 설명한 두 가지 절차에 따라 CTB fluorophore의 intrapleural 주사에 대 한 준비가 되어 있었다. 7 일에...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

여기, 우리 intrapleural 배달 fluorophore의 활용 콜레라 독 소 단위 베타 후 쥐에서 인할지 모터 뉴런 식별 프로토콜을 설명 합니다. 흉 막 캐비티 삽입 하 두 기술을 비교: transthoracic 접근 대 transdiaphragmatic.

마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

retrograde-neuroanatomical-tracing-of-phrenic-motor-neurons-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K 조회수.  Université de Namur. 여기, 우리 intrapleural 배달 fluorophore의 활용 콜레라 독 소 단위 베타 후 쥐에서 인할지 모터 뉴런 식별 프로토콜을 설명 합니다. 흉 막 캐비티 삽입 하 두 기술을 비교: transthoracic 접근 대 transdiaphragmatic.

비디오: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

마우스에 모터 밸런스 조정의 평가는 밸런스 빔을 사용하여

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

연구

신경과학

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such as emotionality or cognition can be assessed, however, it is vital to determine whether the motor capabilities of e.g. a mutant or lesioned mouse allow such an assessment. Performance on a maze task requiring strength and coordination, such as the Morris water maze, might well be impaired in a mouse by motor, rather than cognitive, impairments, so it is essential to selectively dissect the latter from the former. For example, sensorimotor impairments caused by NMDA antagonists have been shown to impair water maze performance2. 
Motor coordination has traditionally been assessed in mice and rats by the rotarod test, in which the animal is placed on a horizontal rod that rotates about its long axis; the animal must walk forwards to remain upright and not fall off. Both set speed and accelerating versions of the rotarod are available.
The other three tests described in this article (horizontal bar, static rods and parallel bars) all measure coordination on static apparatus. The horizontal bar also requires strength for adequate performance, particularly of the forelimbs as the mouse initially grips the bar just with the front paws. 
Adult rats do not perform well on tests such as the static rods and parallel bars (personal observations); they appear less well coordinated than mice. I have only tested male rats, however, and male mice seem generally less well coordinated than females. Mice appear to have a higher strength:weight ratio than rats; the Latin name, Mus musculus, seems entirely appropriate. The rotarod, the variations of the foot fault test12 or the Catwalk (Noldus)15 apparatus are generally used to assess motor coordination in rats.

Protocols are presented for two established motor coordination tasks, the accelerating rotarod and horizontal bar, also two tests developed in Oxford recently, the static rods and parallel bars. These tests can detect motor impairments potentially of interest in their own right, as well as being possible variables in tests of other areas of behavior.

마우스에 모터 조정을 측정

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...