This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. 접합체 배아 개발 <ol><li> 식물 재료 <ol><li> 성장 Medicago는 14 시간의 광주와 유리 공장과 23 ° C / 19 ° C 일 / 밤 온도에서 야생형 Jemalong 또는 매우 다시 생성 가능한 그 근처 동종 (2HA라고도 함) 유전자형 Jemalong 2HA 13 truncatula. <ol><li> 물이 씨앗을 입력하고 물에 하룻밤 담가 허용되도록 씨앗을 파종하기 전에 피어스 (23 G 바늘) 씨 코트의 표면. 완전히 씨앗을 충당하기 위해 충분한 물을 추가합니다. </li><li> 포팅 혼합물의 각 15cm 직경 냄비에 3의 씨앗을 뿌리고 (10 냄비의 총) (굵은 모래, 펄라이트, 야자 껍질의 섬유 - 이탄 (1 : 1 : 1)을 더한 Osmocote 정확한 표준의 5g : 느린 방출 비료) 및 전송 유리 공장. 식물이 올라 줄기를 위해 냄비와 서라운드 당 1 공장은 격자에 의해이 때문에 발아 후 건강한 묘목을 유지. </li></ol></li></ol></li><li> 수확 포드 <ol><li> W에서 포드를 수집Jemalong 또는 2HA 적절한 초기 배아 단계를 얻기 ILD 유형은 제 9 기재. 주의 : 다른 포드 스테이지가도 1에 도시되고 대응하는 배아 단계는도 2에 도시되어있다. </li><li> 분리 스테이지 (6 및 7) (표 2)을 돕는 단계 (6)로부터의 경과 시간. 표 1에서와 같은 기준을 사용하여 수확에서 다른 포드 스테이지를 점검 측정한다. </li></ol></li><li> 포드에서 난자를 해부 및 배아 단계를 확인 <ol><li> 필요에 따라 단독으로 미세 집게를 사용하여 포드 또는 스테레오 해부 현미경과 집게에서 난자를 분리합니다. 필요한 경우 배아 단계 신속 표준 화합물 현미경 (도 3b)을 이용하여 확인할 수있다. </li><li> 아랍어 7.5 g 검, 100g의 클로 랄 하이드레이트, 5 mL의 글리세롤, 증류수 60 mL의 탈 이온수를 함유하는 용액을 호이어의 변성 준비한다. 3-5 시간 또는 하룻​​밤 교반 용해. </li><li> 더 조정을 위해D 현미경 수정 호이어의 솔루션 (15, 16)의 해부 난자을 취소합니다. 조심스럽게 명확 때까지 실온에서 (난자를 커버하기에 충분) 호이어의 솔루션의 작은 볼륨에서 그대로 난자와 장소를 선택하십시오. </li><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 광학 샘플을 볼 수 있습니다. 디지털 카메라 (9) (그림 2) iwth 이미지를 캡처합니다. </li><li> 포드의 중심 지역에서 가장 균일 한 난자를​​ 확보하고 필요한 수를 축적. 일례가도 3a에 도시되어있다. 추가 분석을 위해 요구되는 온도에서 얼음 저장에 난자 (-80 ° C에 대한 핵산)를 수집합니다. 참고 : 조직 학적 섹션의 분석, 투과 전자 현미경에 대한 자세한 내용 및 현장 하이브리드에 논문 8, 9를 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 체외 2. 체세포 배아 개발 <ol><li> 엠을 사용하여 truncatula 품종의 T모자는 쉽게 문화의 배아를 형성 할 수있다. 잎 외식이 프로토콜 2-4 개월이다 2HA 공장 13, 17을 사용합니다. </li><li> 신장 줄기의 최신 거의 완전히 확장 세 잎의 잎에서 전단지를 가져 가라. </li><li> 탈수를 방지하기 위해 문화 냄비에 축축한 종이 타월에 세 잎의 잎을 유지합니다. 주 : 세 잎의 잎이 수확되면 그들이 최소한의 지연으로 활용 될 필요가있다. </li><li> 배양 배지의 제조 <ol><li> 4 : 4 : 1 : 한천에 5 배지 (W 0.8 % : V)에 9cm 페트리 접시 (P4) (10)를 사용합니다. 참고 : P4 10 : 4 : 1 : 5 매체는 P4의 기저 매체 18 플러스 10 μm의 1 naphthaleneacetic 산 (NAA), 4 μm의 6 benzylaminopurine (BAP), 1 μm의 아브 산 (ABA)와 5 μm의 지베렐린으로 구성 산 (GA). GA + ABA의 사용은 배아 형성을 가속화하고 배아 번호 14의 실질적인 증가를 야기한다. </li><li> 1 리터의 P4의 기저 매체 메이크업; (calciu을 주요 염으로 구성된) 별도로 미터 사소한 염과 비타민 (표 3), 킬레이트 철 (별도 구성), 카사 미노산 (카제인 가수 분해물), 30g의 자당, 8g 한천. </li><li> 적당한 분량 씩 -20 ° C에서 주요 염, 칼슘, 카사 미노산, 약간의 소금과 비타민의 상점 재고 솔루션을 제공합니다. 4 ℃에서 킬레이트 철을 저장합니다. </li><li> • 7H 다음날에 FeSO4의 1.853 g을 추가하는 동안 교반하면서 탈 증류수 약 900 ml의 나 2 EDTA •의 7.44 g의 2H 2 O를 용해하여 킬레이트 철 (200X)를 확인 후 98 ~ 99 ° C의 솔루션을 가지고 2 O 성분이 용해 될 때 마지막으로 1 리터까지합니다. 호박에 보관은 4 ℃에서 병 색깔. </li><li> 표 4에서와 같이 주식 솔루션 (P4)의 기초 배지를 확인합니다. 매체의 호르몬은 10 μm의 NAA, 4 μM의 BAP, 1 μM의 ABA, 5 μm의 GA (표 4 및 특정 재료 표 참조). NAA 추가BAP 전에 가압 멸균 주사기에 부착 0.22 μm의 필터로 여과 멸균하여, 오토 클레이브 약 55 ° C로 냉각 후 ABA 및 GA를 추가한다. 부드러운 소용돌이에 의해 잘 섞는다. </li><li> 고압 증기 멸균에 앞서 1 M KOH으로 pH 5.8로 미디어를 조정합니다. 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브. </li><li> 필터 살균 ABA와 GA를 추가하고 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 멸균 9cm 페트리 접시에 미디어의 약 25 ml에 부어 고온 가압 멸균 한 후. 쿨과 한천은 뚜껑으로 설정할 수 있습니다. 그런 다음 뚜껑에 넣고 뚜껑에는 응축수가없는 있는지 확인하십시오. (뚜껑 응축을 방지하기 위해 판지 상자) 4 ° C에서 요구 및 저장소로 레이블. </li></ol></li><li> 잎 조직의 살균 <ol><li> 자외선 살균 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 작업 할 수 있습니다. </li><li> 장소는 이전에 멸균 봄 차 주입기의 메쉬 볼에 나뭇잎. </li><li> 막 다른 에탄올 70 %에 (V V)를 잎을 포함하는 차 주입기를 담가30 초 동안 진짜야 냄비. 참고 :이 절차의 모든 단계를 사용할 250 ml의 멸균되는 캡 폴리 카보네이트 문화 냄비 나사. </li><li> 배수 후 전송하고 1 잎 조직 몰입 : 8 (V : V)로 희석 표백제 (0.5 % 염소)을 10 분 동안. 때때로 부드럽게 소용돌이. </li><li> 표백제를 배출하고 멸균 탈 증류수를 포함하는 문화 냄비에 차 주입기를 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 여분의 물을 배수. 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 한 번 더 반복한다. </li><li> 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 멸균 집게와 차 주입기에서 잎을 제거합니다. 멸균 캡 나사와 반전과 소용돌이로 헹군다. 외식을 준비 할 준비가 될 때까지 멸균 물에 떠있는 나뭇잎을 남겨주세요. </li></ol></li><li> 의 Explants 준비 및 도금 <ol><li> 멸균 기법을 사용하여, 메스 에지로부터 개별 멸균 전단을 트림 및 2 개 THR로 나머지 직사각형을 잘라직사각형 이식편 각 이식편 (도 5a)의 중앙에 중간 정맥과 (80-10 X 3-5mm)를 EE. 주 : 이식편의 크기는 제 캘러스를 개시에 매우 중요하다. 테이크 아웃 식품 용기에서 멸균 뚜껑에 절단을 수행하십시오. </li><li> 플레이트 9cm 직경 페트리 접시 (그림 5B)에서 한천 화 배지에 6 외식. 보통 잎의 방향을 유지하기 위해 아래로 외식 배축 측 플레이트. </li><li> 접시 주위에 뻗어 파라 필름 (그림 5C)와 페트리 접시를 밀봉합니다. 조직은 지금 배양을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 조직 배양 <ol><li> 문화 기간 동안 온도 조절 실 또는 성장 캐비닛에 28 ° C에서 어둠 속에서 번호판을 품어. 참고 : 외식이 탈분화를 시작 세포 분열, 증식 (캘러스 형성)과 배아 (차별화)을 받게 될 것이다. </li><li> 차별화 expla을 배양신선한 매체에 3 주 후에 NTS. 이 계대 배양에서 층류 후드 또는 생물 캐비닛, 멸균 스테인리스 주걱과 집게를 사용하여 전체 이식편 옮긴다. 캘러스가 발생 캘러스는도 5C에서 가장 큰 하나의 크기를 초과하는 신선한 배지로 계대 배양 될 때, 개별 캘러스의 50 %를 전달. </li><li> 약 4 주 만에 처음으로 배아를 관찰한다. 동시성의 정도가되지만, 4-8 주간의 배양 기간 동안 상이한 배아 수집 단계 (도 6a를, B). 실험 목적에 따라 해부 현미경 및 프로세스에 따라 수집합니다. </li><li> 외식 3 개월 동안 배아를 생산하기 위해 계속 수 있도록 매 3 주 배양과 정기적으로 배아를 제거합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. 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Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. 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E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

설명 프로토콜은 상대적으로 정직하고 모든 현대의 세포 및 분자 기술과 콩과 식물 배아의 조사를 할 수 있습니다. 우리는 장점과 생체 내 및 생체 외 접근 모두 단점이 있다는 것을 인정한다. 모두 미숙 씨 (19)의 문화에 비해 초기 배 발생에 더 초점을 수 있습니다. 생체 내 연구의 경우에 무엇을 설명하는 것은 주로 많은 배아 연구에 적합한 포드...

수확 면적과 총 생산량 1 곡물에 두 번째 콩은 약 20,000 종과 콩과 (또는 콩과 (Fabaceae)) 가족과 함께 고등 식물의 세 번째로 큰 가족입니다. 콩은 세 번째로 큰 재배 작물이다. 곡물 콩류는식이 단백질의 3 분의 1과 인간의 소비를 2 식물성 기름의 3 분의 1에 대해 제공합니다. 자신의 N (2) 고정 용량 콩은 그 씨앗의 자엽 콩, 저장 단백질과 기름처럼. 지속 가능한 농업 시스템에 Medicago의 truncatula 기여 상당한 유전자와 게놈 자원 3,4와 유전자 및 게놈 콩과 식물 모델이다. M. 동안 truncatula는 점점 콩과 식물 씨앗 생물학 5-7 및 배아 8,9을 연구하기 위해 사용 된 콩과 식물 - 근류균 공생 (4) 이해의 발전을 가능하게했다. 애기 배아 광범위 10,11 공부하지만 난되었습니다SA 비 콩과 식물과 배아의 세부 사항은 Medicago 8,10 동일하지 않다. 엠의 접합체 배아 truncatula는 특유의 다세포 뇌하수체, endoployploid suspensor 및 기저 전송 세포 8, 흥미로운 기능을 가지고 있습니다. 체세포 배 (SE)는 일반적으로 식물 (12)를 재생하는 데 사용됩니다. 콩과 식물의 모델 (M)에서 truncatula는, 부모 Jemalong에서 개발 된 종자 라인 Jemalong 2HA (2HA)는 체세포 배 (13)의 높은 비율을 가지고있다. 생성 된 배아의 개수는 최근 실질적 노포 매체 (14)에 모두 산 지베렐린 (GA)과 아브 산 (ABA)을 추가하여 증가하고있다. GA와 ABA는 일반적으로 길항 (14)의 역할을 주어진 특이한 시너지이 경우 GA 및 ABA의 행동합니다. 캘러스로부터 생성 된 배아는 배아의 단계를 용이 visuall 결정될 수 있도록 표면에 개발Y 쉽게 수확. 체세포 배의 조사 (Jemalong) (2HA) 배 발생 및 비 배아있는 동종 라인 근처에 용이 갖는 생체 내에서 서로 다른 실험 가능성을 제공 체외 시스템을 모두 가지고. 배아 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 이해 종자 및 식물 개발을위한 필수적이다. 콩에서 다른 쌍떡잎 식물에서와 같이, 이는 인간의 영양 섭취에 사용되는 제품을 저장 배아 자엽이다. 초기 배 발생이 빠른 세포 분열, 그리고 올바른 배아 패턴을 포함한다. 약 팔일 수정 후, M.에서 truncatula 배아 초기 자엽 단계에 도달한다. 형태 학적 특성은 정확하게 온실 조건의 수정 후 일에 의해 표시되지 않습니다. 따라서, 개발 배아의 무대를 표시 할 수있는 효율적인 표준화 된 접근 방식은 유전 regul 연구에 가치가있다초기 접합체 배아의 ATION. 본 논문에서는 콩과 식물 모델 엠에서 배아의 생물학적 연구 개발 배아를 수집하기 위해 두 개의 표준화 된 프로토콜을 제공 truncatula. 첫 번째를 손쉽게 대형 배아 번호를 제공하기 위해 배양 잎 외식 통해 체세포 배는 배 발생 동안 포드 형태를 연결하여 접합체 배아를 수집하는 것이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >P4 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Major salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minor salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitamins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Bacto agar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plant hormones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Abscisic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Benzylaminopurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3274</td>
			<td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibberellic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7645</td>
			<td>Dissolve in small amount of ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZFLIII</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiophot</td>
			<td>Or similar, with suitable optics</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam HRc</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilising leaves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>75.9922.519</td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

단일 세포 접합자부터 초기 배 발생이 빠른 세포 분열 및 형태 형성을 통해 진행하고, 형태 학적으로 전 구형, 구형, 심장, 어뢰 및 자엽 단계를 특징으로한다. 이 진보적 개발 복잡한 분자 네트워크의 타이트한 규제 받고있다. 개발의 유사한 단계에서 충분한 초기 배아를 수확하는 것은 초기 배아의 세포 및 분자 규제 조사를 위해 필수적이다. Medicago 예 : 팔일이 초기 자엽 단계에 도달 truncatula 동안 초기 배 발생이 짧은 빠른 형태 형성을 거쳐 때문에 이것은 간단하지 않다. 여기서 우리는 두 가지 방법으로 문제를 해결. 첫 번째는 접합체 배아의 단계를 나타내는 데 배아 개발 및 포드 형태 사이의 연결을 설정합니다. 이것은 특히 포드 나선과 등뼈의 개발의 수에 기초한다. 생체의를 보완하는 다른 방법tudies는 체세포 배아를 생산하는 배양 잎 외식를 통해입니다. 매체는 비정상적인 호르몬의 조합을 포함 - 옥신 (1 naphthaleneacetic 산), 사이 토키 닌 (6 benzylaminopu​​rine), 아브 산, 지베렐린 산을. 다른 단계는 절개없이 캘러스의 성장 식별 할 수 있습니다.

F - 다른 배아 단계는도 2a에 도시 동안 F - 다른 배아 단계에 해당하는 접합체 배아 다른 포드 구조에 대해서는 그림 1A에 표시됩니다. 동일한 단계에서 포드를 선택함으로써, 난자의 샘플 상당히 균일 (도 3a)를 얻을 수 있음. RT-qPCR의 배아를 이용하여 특정 유전자는 쉽게 검출 및 시간 과정 연구 9를 평가할 수있다. 일부 추가 ?...

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Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.8K 조회수.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

비디오: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...