이 작품에서 현미경에서 연구소의 Transformative 바이오-분자 (WPI-ITbM) 나고야 대학의 실시 되었고 일본 고급 식물 과학 네트워크에 의해 지원. 이 작품 과학의 승진을 위한 일본 사회와 일본 과학 및 기술 기관 (ERATO 프로젝트 남 M.U.)에서 교부 금에 의해 지원 되었다: 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP24113514, JP26113710, JP15H05962, 및 M.U., 및 개에 대 한 JP15H05955. JP16H06465, JP16H06464 및 JP16K21727 T.H에 대 한), (B, Nos 젊은 과학자에 대 한 특정. JP24770045 및 M.U.에 대 한 JP26840093), 그리고 도전적인 탐구 연구 (제에 대 한 특정 M.U.에 대 한 JP16K14753)입니다.

1. 준비 체 외에 난 배양의 <ol><li>확인 생체 외에서 난 문화에 대 한 액체 매체 (&#34; N5T 매체 &#34;) 1 x Nitsch 기초 소금 혼합물, 5% (w/v) 트 레 할 로스가 수화물, 0.05 포함 하 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산 (MES)-코 (pH 5.8), 및 1 x Gamborg &#39; s 비타민 솔루션.</li>
	<li>코와 5.8에 pH를 조정.</li>
	<li>압력가 마로 소독 하 여 매체 소독 (121 ° C, 20 분) 또는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링. 
	참고: 소독된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 2-3 개월.</li>
</ol> 2. PDMS Micropillar 배열 장치 준비 <ol><li>PDMS micropillar 장치 칼, 면도날 또는 35 m m 유리 하단 접시의 유리 부분 (14 m m φ)에 맞게가 위로 잘라. 
	참고: 이전 논문 8 , 9, PDMS 장치 건설의 전체 절차를 설명 하 고 여기에 세부 사항을 생략 됩니다 따라서. 4 잘 또는 96 잘 접시와 같은 더 작은 양으로 유리 하단 요리 단기 이미징 장치 없이 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Sterilize 15 분의 자외선 아래 PDMS 장치 상단의</li>
	<li>평방 팁 핀셋을 사용 하 여 의해 PDMS 장치 그리고 15 분 하단 소독 빛 자외선 아래 계속.</li>
	<li>35mm 문화 접시에 멸 균된 PDMS 장치를 전송 하 고 장치는 완전히 매체 (대략 5-7 mL)에 젖 었 때까지 N5T 매체를 추가.</li>
	<li>진공 챔버에 접시를 넣어 고 드에 압력을 감소 시키기. 유지 장치에 공중 매체에 의해 대체 될 때까지 하룻밤에 3 h에 대 한 진공 청소기. 
	참고: 장치는 강한 진공에서 공기 방울에 의해 분리 될 수 있다.</li>
	<li>장치 요리에서 평방 팁 핀셋으로 잡고 고 측면과 하단에 추가 매체를 제거 하는 종이 타월에 넣어. 
	참고:이 난 재배에 사용 될 것입니다 micropillar 배열 (상부 표면)에 매체를 제거 하지 합니다.</li>
	<li>76 x 26 mm 슬라이드 유리, micropillar 부분 위쪽으로 계속 보장에 장치 전송 하 고 다음 난 추출 하는 동안 밖으로 건조에서 매체를 방지 하기 위해 35mm 문화 접시 뚜껑 장치 커버.</li>
</ol> 3. Silique 절 개 및 난 추출 <ol><li>70% 에탄올으로 닦아 하 여 바늘 (0.40 m m G) 및 정밀한 족집게를 소독. 바늘 주사기 또는 나무 막대기에 부착 하 여 쉽게 처리 됩니다.</li>
	<li>식물의 꽃이 핌을 확인 하 고 실험에 대 한 적절 한 siliques를 선택 합니다. 약 5 m m siliques 포함 zygotes, 그리고 젊은 구형 배아를 포함 하는 8-10 m m siliques.</li>
	<li>핀셋를 사용 하 여는 siliques를 소비 세와 76 x 26 mm 슬라이드 유리에 양면 테이프에 그들을 배치. 에 대 한 포함 한 silique 40-60 ovules, 그리고 3-4 siliques (즉, 120-240 ovules)는 한 장치에 대 한 충분 한.</li>
	<li>멸 균된 바늘과는 stereomicroscope에서 핀셋을 사용 하 여 내부 ovules를 볼 수 silique (난소 벽)를 엽니다. ovules 손상 되지만 난소 벽 컷.</li>
	<li>(2.7 단계에서 준비), PDMS 장치에 열린된 silique N5T 매체에 전송 눌렀다가 ovules 매체에 바늘 또는 핀셋.</li>
	<li>Micropillar 배열에 공간에는 ovules을 PDMS 장치에 작은 덮개 유리 (18 x 18 mm)을 넣어.</li>
	<li>가로 추가 매체를 제거 하려면 사용 하 여 핀셋 또는 손가락을 당겨 덮개 유리를 벗고.</li>
	<li>PDMS 장치를 뒤집어서, 35 m m 유리 하단 접시에 배치 하 고 약간 유리에 붙어 스퀘어 팁 핀셋을 사용 하 여 추진 하 여 장치를 누릅니다.</li>
	<li>유리 바닥으로 부드럽게 부 어 N5T 매체 PDMS 장치는 완전히 매체에 배어 때까지 중간 병 decanting 여 접시와 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인. 
	참고: PDMS 장치 재활용 될 수 있지만 너무 오래 된 장치는 쉽게 유리 바닥에서 분리. 또한, 장치 단계 2.5에서에서 완전히 degassed 하지은 또는 매체는 너무 빨리 부 어 떠 있습니다.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> 그림 2: 샘플 준비에 대 한 도식 절차. 
이 도식 흐름 단계 3.5 4.1에 해당합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 4. 시간 경과 영상 <ol><li>는 거꾸로 한 현미경에 3.9 단계에서 준비 된 유리 하단 접시를 놓고 고에 초점에 적합 한 ovules를 선택 합니다. 
	참고: 단계, 위치 및 방향에는 ovules 다르므로 적당 한 ovules 발견 한다 그들의 표식 형광을 확인 하 여.</li>
	<li>제조 업체에 따라 라이브 이미징 시작 &#39; 현미경 시스템의 s 지시. 
	참고: 현미경 장비와 매개 변수는, 다양 하 고 따라서 사용자 실험 목적에 맞는 적절 한 설정을 선택 해야 합니다. 예를 들어,이 원고에 사용 되는 설정을 표 1에 나열 됩니다.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>장비/설정</td> <td>그림 3 (A) 및 추가 비디오 1과 4</td> <td> 그림 3 (B) 및 추가 비디오 2</td> <td>보충 비디오 3</td></tr> <tr><td>현미경</td> <td>레이저 스캔 현미경 (A1R MP) 거꾸로</td> <td>회전 디스크 confocal 거꾸로 현미경 (CSU-W1)</td> <td> 상자 형 반전 confocal 현미경 시스템 안정 인큐베이션 챔버 (CV1000)</td></tr> <tr><td>레이저</td> <td>Ti:sapphire 펨 펄스 레이저</td> <td>488-561-nm 및 LD 레이저</td> <td>488-561-nm 및 LD 레이저</td></tr> <tr><td>O bjective 렌즈</td> <td>물 침수 렌즈 X 40 (나 = 1.15) 침수 매체와</td> <td>실리콘 기름 침수 렌즈 X 60 (나 = 1.30), 압 전 초점 드라이브에 탑재 된</td> <td>40 X 렌즈 (나 = 0.95)</td></tr> <tr><td>검색 또는</td> <td>외부 descanned 비 GaAsP PMT 검출기</td> <td>EMCCD 카메라</td> <td>EMCCD 카메라</td></tr> <tr><td>Dichroic 거울</td> <td>DM495 및 DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>필터</td> < td > 대역 통과 필터; 534/30 nm 및 578/105 nm</td> <td>대역 통과 필터, 520/35, 및 593/46 nm</td> <td>대역 통과 필터, 520/50 nm와 617/73 nm</td></tr> <tr><td>z 축 따라 슬라이스</td> <td>1 µ m 간격으로 31 z-스택</td> <td>17 z-스택 3 µ m와 인터 벌 스</td> <td>7 z-5 µ m 간격으로 스택</td></tr> <tr><td>시간 간격</td> <td>20 분</td> <td>5 분</td> <td>10 분</td></tr></tbody></table> 표 1:는 현미경 시스템 및이 원고에 사용 된 설정을. 
현미경 및 매개 변수는 다양 한, 그리고 따라서 각 사용자는 실험에 적합 한 시스템을 선택 해야 합니다.
<ol start="3"> <li>획득된 한 이미지 시퀀스를 확인 하 고.avi 또는.mov 프레 젠 테이 션에 대 한 같은 일반적인 동영상 포맷 변환. 
	참고: 현미경 소프트웨어는 동영상 포맷으로 이미지 출력 수 없습니다, 경우.tif로 이미지를 저장 하 여 다음 ImageJ, 오픈 소스 프로그램 NIH 이미지 파일 형식을 변경 하 여 영감된에서 그들을 엽니다. ImageJ에서 제공 됩니다: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ Z-s를 만들기 위해 사용할 수 있습니다.에 설명 된 대로 최대 강도 프로젝션, 같은 영화를 감싸 다: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 원고는 간단한 체 외에 난 재배 하는 프로토콜 zygotes와 배아 개발의 라이브 셀 이미징에 사용 하기 위해 효율적인 소개 합니다.
PDMS 장치 디자인은 배아 단계에 따라 최적화를 할 수 있습니다. 첫 번째 개발된 장치 microcage 배열 방향을 조정 하 고 수정 ovules9의 위치를 그리고 다음 micropillar 장치 ovules를 보다 효율적으로 함정을 건설 되었다<sup class="xre...

체의 기본적인 몸 계획 단 세포 접합 자에서 개발 한다. 대부분 꽃 식물, zygotic 사업부는 꼭대기와 촬영 및 루트, 각각1로 발전 하는 기저 세포를 생성 합니다. 따라서, embryogenesis, 동안 식물 몸은 형성 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 하다 하지만 그들은 꽃에서 깊은 곳에서 개발 하기 때문에 직접 생활 zygotes 및 배아의 역학을 관찰 하는 효과적인 도구가 되지 않았습니다. 옥수수, 쌀, 등 여러 monocot 종, 체 외에서 수정 방법 설립된2,3되었습니다. 이 방법에서는, 고립 된 정자 및 난 자 세포 융합 하는 전기적 또는 화학적으로, 그리고 생성 된 셀 비옥한 식물으로 개발할 수 있습니다. 그러나, dicot 식물, 체 외에서 수정 방법 남성과 여성 gametes4,5의 세포 주기 비 동기화 상태 때문에 아마도 적절 한 배아를 생산할 수 있다. 또한, 태아를 둘러싼 조직 (endosperm) 배아 개발6에 중요 한 역할을 담당합니다.
모델 dicot 종, A. thaliana, 생체 외에서 재배 방법 배아와 endosperm7포함 전체 난에 초점을 맞춤 으로써 개발 되었다. 이 시스템은 성공적으로 embryogenesis에 다양 한 화학 시 약의 효과 분석 하는 데 사용 됩니다 하지만 낮은 생존 율을가지고 있기 때문에 시간 경과 영상에 적합 하지 않습니다. 따라서, 소설 체 외에 난 재배 시스템 접합 자 단계도 일찍 시작 하 고 높은 비율8에 비옥한 식물 생산 개발 되었다. 다양 한 실험 후 그 니 매체 발견 이었고, 트 레 할 로스는 크게 ovules8의 생존 율을 개선. 또한, 때문에 난 그것은 성장 하 고 따라서 현미경의 관측 분야에서 자주 이동 확장, PDMS 장치 매체9에 난을 해결 하기 위해 개발 되었다. PDMS 장치는 심장-단계 배아에는 접합 자에서 개발을 추적 하기에 충분 한 3-4 일에 대 한 장기적인 이미지를 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 그것은 된다 zygote 양극 화와 패턴, 뿐만 아니라 정상적인 조건 하에서 하지만 또한 화학 억제제 존재 또는 다양 한 돌연변이 배경8,10에서에서 배아의 역학을 시각화 수 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
그림 1: 특정 형광 마커 난 통해 배아 Zygotes 시각화 하는 데 사용의 회로도. 애기 zygote 꽃 깊숙한 생성 되는 난에 배아로 발전 한다. 이 체 외에서 배양 시스템, zygote 및 태아는 난을 통해 관찰 하 고 따라서 다른 난 조직에 표시 되지 않는 특정 형광 마커를 사용 하는 것이 중요 하다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Nitsch basal salt mixture</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>trehalose dihydrate</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s vitamin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>35-mm glass-bottom dish</td><td>Matsunami Glass</td><td>D111300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &amp;times; 26 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &amp;times; 18 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>needle (gauge 0.40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Immersion medium Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>Yokogawa Electric</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

대부분의 현 화 식물에 어머니 조직에 깊이 숨겨진 zygote과 태아 하 고 따라서 그것은 오래. 개발 방법의 신비 예를 들어는 zygote 몸 축 설정 하에서 어떻게 하 고 어떻게 태아 장기 형성 동안 다양 한 세포 운명을 지정 합니다. 이 원고는 체 외에 난 문화 메서드를를 라이브 셀 이미징 zygotes과 애기 thaliana의 배아 개발에 대해 설명 합니다. 최적화 된 재배 매체 zygotes 또는 초기 배아 비옥한 식물에 성장 수 있습니다. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar 배열 장치와 함께 그것을 결합 하 여는 난 같은 위치에 액체 매체에서 개최 됩니다. 이 기정은 늦은 배아 단계에 zygotic 부문에서 몇 일 동안 관찰 하는 현미경 같은 난 중요 합니다. 결과 라이브 셀 이미징 핵 이동 및 골격 재배열, 및 또한 세포 분열 타이밍 및 배아 패턴화 하는 동안 세포 운명 명세와 같은 접합 자 분극의 실시간 역학을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 배아 개발, 다양 한 요인의 영향을 분석할 억제제 치료와 레이저-셀 통신의 역할을 검토 중단 등 광학 조작이 난 재배 시스템에 결합할 수 있습니다.

이 난 재배 시스템을 사용 하 여이 메서드는 zygote 분극 및 모방 하는 태아의 생활 역학을 추적할 수 있습니다. 이 때문에 이전 zygote와 배아, 어머니 조직에 깊이 숨겨져 있는 실시간 동작을 시각화 하 아무 기술 성과 이다. 그림 3A 와 보조 비디오 1 젊은 zygote에서 microtubules (MTs) subapical 지역10가로 링 축적 보여준다. 이 산 ...

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K 조회수.  Nagoya University. 이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

비디오: In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

연구

발생학

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses with an egg cell or a central cell. Thus, two independent fertilization events take place almost simultaneously. The fertilized egg cell and central cell develop into zygote and endosperm, respectively. Therefore, precise control of double fertilization is essential for the ensuing seed development. Double fertilization occurs in the female gametophyte (embryo sac), which is deeply hidden and covered with thick ovule and ovary tissues. This pistil tissue construction makes observation and analysis of double fertilization quite difficult and has created the present situation in which many questions regarding the mechanism of double fertilization remain unanswered. For the functional evaluation of a potential candidate for fertilization regulator, phenotypic analysis of fertilization is important. To judge the completion of fertilization in Arabidopsis thaliana, the shapes of fluorescence signals labeling sperm nuclei are used as indicators. A sperm cell that fails to fertilize is indicated by a condensed fluorescence signal outside of the female gametes, whereas a sperm cell that successfully fertilizes is indicated by a decondensed signal due to karyogamy with the female gametes&#8217; nucleus. The method described here provides a tool to determine successful or failed fertilization under in vivo conditions.

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

We demonstrate a method to determine successful or failed fertilization on the basis of sperm nuclear morphology in Arabidopsis double fertilization using an epifluorescence microscope.

애기장의 정자 핵 형태를 추적하여 수정 상태의 평가 이중 수정

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

생물학

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

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