저자는 중요한 토론 W. 일 및 K. 젠슨 감사, 싱가포르 국립 대학의 나노 역학 연구소의 지원을 인정합니다. NAK는 마리 퀴리 IIF 원정대에 의해 지원을 인정합니다.

1. 세포 수확 <ol><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 MD-MBA-231 세포를 얻습니다. 0.5 % 트립신 - EDTA 용액을 이용하여 조직 배양 접시에서 세포를 분리합니다. T25 플라스크에서 배양 세포 트립신 EDTA 용액 1 ㎖를 사용합니다. </li><li> 4 분의 200 × g에서 원심 분리하여 15ml의 원뿔형 튜브 펠렛의 세포 상등액을 흡인하고, 세포를 재현 탁 배양액 5ml에. </li><li> 혈구를 사용하여, ρ, 셀 밀도를 계산. 주 : 셀 시드 내측 겔을 제조하기 위해, 세포 현탁액을 이후 10 × 최종 세포 파종 밀도에 도달하기 위해 희석된다. 따라서, 10 × 세포 현탁액 농축이 요구된다. </li><li> 10 × 세포 농도를 달성하는 데 필요한 유체의 체적을 계산한다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> 참고 : 마지막 셀 시드 밀도를 최종 C, 약 2의(15); 10 6 세포 / ㎖의 MD-MBA-231 세포에 권장되며,이 프로토콜에 사용된다. 기타 파종 밀도는 다른 세포 유형에 대해 탐구 할 수있다. </li><li> 펠렛의 세포 하나 더 4 분 동안 200 × g에서 원심 분리하여 15 ML 원뿔 튜브 시간, 뜨는을 대기음. </li><li> 세포 응집을 최소화하기 위해 충분히 세포의 무 혈청 배지 (단계 1.3에서 계산 V 배지)에 필요한 양의 세포를 재현 탁. 주 : 페놀 레드가 자동 형광, 형광 / 반사 영상을 방해 할 수 있습니다. 페놀 레드없는 배지의 사용은 최상의 이미지 품질을 달성하기 위해 고려 될 수있다. </li></ol> 콜라겐 솔루션 2. 준비 <ol><li> 주식 콜라겐 솔루션, 10 × PBS 버퍼, 밀리-Q의 H 2 O, 0.1 M의 NaOH, 여러 마이크로 원심 튜브를 얻습니다. 조기 콜라겐 중합을 방지하기 위해 얼음을 모두 유지하고 무균 상태를 유지한다. </li><li> 멸균 유리 - 평형을37 ° C 배양기에서 사전 온난화로 바닥 접시. 참고 :이 프로토콜의 모든 볼륨이 잘 12mm 유리 바닥 접시에 최적화되었습니다. 다른 접시 형이 사용되는 경우, 대응하여 볼륨을 조절한다. </li><li> 콜라겐 스톡 농도에 기초하여 상기 내측 겔 (용액 I) 2.4 ㎎ / ㎖의 콜라겐 용액 50 μL를 준비하기 위해 필요한 요구되는 부피를 계산한다. 주 : 겔 내측 기타 콜라겐 농도도 사용될 수있다. </li><li> 멸균 환경 (일반적으로 바이오 안전성 후드)에서, 천천히 부드러운 소용돌이와 (단계 2.3에서 계산) 콜라겐 원액 필요한 양의 10 × PBS 버퍼의 5 μl를 추가합니다. 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해주의하십시오. </li><li> 교정의 pH 미터를 사용하여 0.1 M의 NaOH를 이용하여 7.4로 혼합물의 pH를 조정한다. 대략적인 기준으로, (양이 주식 농도와 산도에 따라 달라집니다) 7.4에 가까운 pH를 가지고 약 5 μl를 사용합니다. 참고 : 볼륨이에 관여합니다단계는 표준 pH 미터를 사용하기에는 너무 작다. 다음 트릭 중 하나를 사용하여 <ol><li> 여러 샘플 콜라겐 솔루션을 준비합니다. 표준 pH 측정기를 사용하여 대량으로 pH를 조정하고 샘플에 걸쳐 콜라겐 솔루션을 배포 할 수 있습니다. </li><li> 대안 적으로, 더 많은 양의 콜라겐 용액의 pH를 조정 (Ⅰ. 예., 표준 pH 미터의 사용을 허용 양). 최종 pH로 pH를 가져 필요한 양의 NaOH를 참고. 볼륨을 확장하고 실험에 NaOH를 적절한 양을 사용합니다. 리트머스 종이를 사용하여 pH 값을 확인합니다. </li><li> 그렇지 않으면, 더 정확하게 소량의 pH를 조정하기 위해 마이크로 pH 전극을 사용한다. </li></ol></li><li> O. H 2 μL를 사용하여 45의 부피로 용액을 가져와 조기 콜라겐 중합을 방지하기 위해 얼음의 모든 단계를 수행합니다. </li></ol> 동심 젤 문화 3. 형성 <ol><li> 예열 된 유리 바닥 접시를 타고 일부터 (단계 2.2 참조)전자 인큐베이터. </li><li> I. 용액에 재현 탁하고 (단계 1.5에서 제조) 10 × 농축 된 세포 현탁액의 5 μL를 추가 철저. 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해주의하십시오. 혼합물을 50 μL의 현재 볼륨 및 (최종 = 2 × 106 세포 / ㎖ c) 최종 농도 콜라겐 (2.4 ㎎ / ㎖), 셀 밀도를 포함한다. </li><li> 이 돔 형상의 액적 (도 1a)을 형성하도록 I는 웰의 중심으로 서서히 세포 - 함유 용액 20 μL를 추가한다. 이 단계에서 거품 형성을 방지하기 위해주의하십시오. 거품 형태의 경우, 신중하지만 빨리 시도 중 하나를 파열되거나 피펫 팁을 사용하여 빨아. 조심스럽게 내부 겔을 45 분 동안 중합 수 있도록 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> (외부, 무 세포 콜라겐 젤) 솔루션 O이 배양 단계가 끝나기 전에 약 15 분을 준비합니다. 참고 : 외부 젤 상태는 콜라겐 농도와 중합의 pH 조건에 변경 될 수 있습니다다른 마이크로 (10)과 네트워크를 구하십시오. 7.4의 pH에​​서 중합 4.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐 젤 -이 프로토콜에서 1.5에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> 콜라겐 스톡 농도에 기초하여, 최종 농도 콜라겐 용액 O 200 μL를 준비하는 데 필요한 요구 체적을 계산한다. </li></ol></li><li> 10 × PBS의 20 μL는 부드러운 소용돌이와 (3.4 단계에서 계산) 콜라겐 원액의 필요한 양을 천천히 버퍼에 추가합니다. 교정의 pH 미터를 이용하여, 0.1 M의 NaOH를 사용하여 최종 pH로 혼합물의 pH를 조정한다. pH 조정에 대한 2.5 단계로주의를 참조하십시오. </li><li> O. H 2를 사용하여 200 μL의 최종 부피로 용액을 가져와 조기 콜라겐 중합을 방지하기 위해 얼음의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 내부 겔의 45 분의 중합 후 인큐베이터에서 접시를 타고 (단계 3.3 참조). 이 솔루션은 완전히 내부를 덮도록 조심스럽게, 내부 젤 위에 솔루션 O 180 μl를 추가젤과 잘 (그림 1B)를 채 웁니다. <ol><li> 외부 젤 비 균일 한 섬유 방향으로 이어질 수있는 솔루션을 교반하지 않고 신중하게이 단계를 수행합니다. 피펫 팁과 내부 젤에 손이 닿지 않도록주의하고, 기포 나 공기 주머니의 형성을 방지하기 위해. 거품 형태의 경우, 신중하지만 빨리 시도 중 하나를 파열되거나 피펫 팁을 사용하여 빨아. 부드럽게 외부 겔 중합을 수 있도록 인큐베이터에서 접시를 다시 배치합니다. </li></ol></li><li> 중합 45 분 후 인큐베이터에서 접시를 가져 가라. 거칠게 취급하면 여전히 바닥면으로부터 분리 할 수​​ 있지만, 이미 상당히 겔,​​이 시점에서 고화한다. <ol><li> 부드럽게 접시 (도 1C)로 가온 세포 배양 배지 2 ㎖를 붓는다. 젤이 완전히 매체에 빠져들되어 있는지 확인합니다. 문화의 기간에 걸쳐 3 일 - 매 2 매체를 새로 고칩니다. </li></ol></li></ol> 4. 라이브 셀 이미징 <ol><li> 장기 라이브 세포 이미징 기능을 갖춘 반전 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 수행합니다. 포함 내장 된 온도 (37 ° C) 및 CO 2 (5 %) 제어와 배양 챔버. 현미경에 전환하고 실험을 시작하기 전에 단계를 적어도 1 시간을 따뜻하게. 참고 : 긴 작동 거리와 사용 대물 렌즈는 3D 젤 세포의 관찰 및 현지화를 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 3 차원 시스템에서 세포의 정확한 위치 파악을 할 수 있도록 30 분 동안 형광 세포 추적기 염료 5 μl를 함유하는 배지에서 배양 한 겔. 그 후, 1 × PBS로 세척하여 세 번 결합되지 않은 염료를 제거합니다. 그 후, 접시에 세포 배양 배지를 추가한다. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 타고 현미경 스테이지 (그림 1D)에 놓습니다. 참고 : 라이브 세포 이미징 바로 외부 겔의 중합 후 원칙적으로 시작할 수 있습니다. 그러나이 시점에서, 세포를 전n은 내부 젤은 아직 확산되지 않았다. 외측 겔, 라이브 셀 이미징 배양 개시 후 (셀 타입에 따라) 24 시간을 시작할 수 침범 제 세포의 이주를 조사. 대략적인 기준으로, 약 12​​ - 문화의 14 일이 외부 젤을 입력 내부 겔에 세포의 대부분이 필요하다. </li><li> 내부 젤을 둘러싼 외부 젤 지역에서보기 (VOV의)의 볼륨을 선택. 24 시간의 배양이 세포 집단 확산 것이다 후 내부와 외부 사이의 계면 겔을 교차하고, 외측 겔 침투하기 시작했다. <ol><li> 보브의 경우, 바로 옆에있는 외부 젤 (7)의 외곽에 가까운 겔 인터페이스, 중간 지역, 지역에 젤 영역을 포함한다. 가능한 에지 효과를 피하기 위하여, 겔의 상단에서뿐만 아니라, 가까운 아래쪽 및 측면 표면으로부터 50㎛의 영역보다 제외. 각 보브는 일반적으로 X에서 (647 × 647 × 100 μm의 3을 측정Z의 -stack 5 μm의 간격이 각각, Y, Z 방향). </li></ol></li><li> 확인 촬상 모드, 채널 / 필터, 노출 시간, 이미지 해상도가 올바르게 선택된다. 콜라겐 네트워크의 라벨없는 이미징의 경우, 시간 경과 라이브 셀 이미징 동안 동시에 반사율 공 촛점 현미경을 사용한다. </li><li> 샘플 이미지를 가지고 강도 막대 그래프를 플롯과 충분한 신호를 관찰하고 히스토그램이 제로 최대 강도 사이에 위치하도록함으로써 포화를 방지하기 위해 이득 및 오프셋을 조정합니다. 실험 기간에 걸쳐 더 이상 이러한 설정을 변경하지 마십시오. </li><li> 8 시간 (또는 필요 이상) 10 분, 시간 간격, Δ의 t으로, 선택한 보브 년대의 시간 경과 이미지를 가져 가라. </li></ol> 5. 셀 추적 및 데이터 분석 <ol><li> appropria를 사용하여 Z -stack 이미지에서 정량적 이미지 포스트 - 프로세싱을 수행<html> 테 이미지 처리 소프트웨어. <ol><li> 세그먼트 시간 경과 이미지는 자동으로 값 (x, y, z, t)의 3D 셀 위치를 선택합니다. </li><li> 모든 프레임의 경우, 수동으로 현지화 정확성을 확인하고 세포 착각되었을 수 세포 파편 및 세포 돌기 때문에 오탐 (false positive)를 제거합니다. 다른 오브젝트로 분석 및 분할 겹치거나 연결된 세포의 증식 세포를 제거합니다. </li></ol></li><li> 시계열로 각 셀의 위치를 연결하여 이전 단계에서 얻어진 셀 좌표 (x, y, z, t)로부터 3D 경과 셀 트랙을 생성한다. </li><li> 임계 트랙 길이 (보통 20 분)보다 짧은 트랙을 제거하여 임의의 시스템 노이즈를 제거합니다. </li><li> 필요한 경우, 트랙에 의한 전체적인 순 변위를 감산함으로써 샘플 드리프트 보정. </li><li> 셀의 변위를 계산세틸 / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;폭 =&quot;80 &quot;/&gt;, 및 세포 이동 거리, <img alt="식 (3)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> 관찰 된 셀 궤적으로부터, 여기서시 셀의 3 차원 위치를 나타내는 벡터이고, 시점의 총 수이다. <ol><li> Δ (t)가 프레임 간의 시간 간격, S = D / (n 개 •의 Δ의 t)와 같은 세포 속도를 계산한다. P = Δd 및 / D를 사용하여 세포 이동의 방향성 (또는 지속성)을 계산합니다. 지속성이 간단한 측정은 P = 0 순 변위가 0이고 P = 1 궤적이 직선 방향 라인이 있음을 의미한다. </li></ol></li></ol>

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In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

세포의 이주는 배아 발달, 지혈, 면역 응답으로서뿐만 아니라, 혈관 질환, 염증, 암과 같은 병리학 한 공정에서 다양한 생리 학적 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 이동의 기초 생화학 및 생물 물리학 적 요인을 해부하여 세포 기능의 기본 원리를 이해뿐만 아니라, 조직 공학, 안티 전이 및 항 염증성 약물 개발 등 다양한 생물 의학 응용 프로그램을 전진뿐만 따라서 근본적으로 중요하다. 생체 관측 기술적 도전이기 때문에, 많은 노력은 세포 이동의 시험관 재현부에 집중되어왔다. 세포의 이동을 연구하는 체외 방법에서 크게 특히, 두 개의 차원 (2D) 표면 분석을위한 스크래치를 설계 또는 분석이 상처 치유되었습니다. 이러한 분석은 간단한 실험 장치를 제공, 쉬운 가축세포 이미징 및 세포 이동의 기초가 다양한 생화학 적 메커니즘에 유용한 통찰력을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 생체 마이그레이션에 대한 이해의 중요한 측면이다 세포 외 기질 (ECM) 건축과 리모델링을 고려하지 않습니다. 최근에는 점차 3D 배양 모델은 종종 콜라겐 계 매트릭스 3에서, 더 나은 상황 생체 유사한 플랫폼을 제공하는 것이 이해되었다. 실제로, 세포는 특히 인해 환경 (4)의 다른 차원을 2 차원 표면에 나타나는 것과 구별되는 migrational 동성을 나타낸다. 더욱이, 행렬의 생물 리 학적 및 기계적 특성을 민감하게 종양 세포 침윤 (6)의 컨텍스트에 포함하여, 세포 이동 (5)에 영향을 미친다. 여기서, 우리는 제조 조건에서 쉽게 변할 수 생물 리 학적 특성을 갖는 ECM 차원 셀 마이그레이션 동작을 연구하는 방법을 제시한다. 세포는 아르&quot;내부 젤&quot;의 시드와로 새어 처음에 무 세포 &quot;외부 젤을&quot;침략 수 있습니다. 상기 방법은 세포가 밀접 7 mechanosensing 연결되어 외측 겔에서 무 세포 지역으로 이동하는 세포의 존재를 인식 할 수있는 능력, 및 성향에 의존한다. 이 연구에서 우리는 매우 침습적 유방암 세포, MD-MBA-231에 의해 침략 ECM의 콜라겐 네트워크를 사용합니다. 기계적 특성 모두 내측 및 외측 겔의 미세 조정 8 및 생리 학적으로 관련된 조건을 달성하기 위해 구를 특징으로 할 수있다. 셀 트랙의 재건 및 분석은 인구 수준 및 개별 셀 레벨 모두에서 시공간 마이그레이션 동작의 상세한 정량적 검사를 할 수 있습니다. 중요한 것은, 동심 젤 시스템의 설치, 따라서 중요한 통찰력을 제공하고, 특히 암 세포에 침입, 세포 마이그레이션 직면 한 생체 조직 토폴로지를 모방세포 이동 및 전이의 물리적 메커니즘.

<table><tbody><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>Model: 371, S/No 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1R</td><td></td><td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom dish</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td><td></td></tr><tr><td>Microprocessor pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>Nutragen Collagen</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>#5010-D</td><td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sartorius</td><td>S/No 29153352</td><td>Basic pH Meter PB-11</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

이동하는 세포의 능력은 암 및 암전이에에서 배아 발생 및 상처 치유 수명에 걸쳐 세포 기능의 다양한 중요하다. 강렬한 연구 노력에도 불구하고, 세포 이동의 기본 생화학 및 생물 물리학 적 원리는 아직도 완전히 특히 생리 관련 3 차원 (3D) 미세 환경에서 이해되지 않습니다. 여기서는 3D 세포 이동 동작의 정량적 검사가 가능하도록 설계 시험 관내 분석을 기술한다. 이 방법은 이전에 빈 세포 외 기질 (ECM)로 마이그레이션하는 세포의 mechanosensing 능력과 성향을 이용한다. 우리 모델 시스템으로서 콜라겐 겔에서 고도로 침윤성 유방암 세포의 침윤, MDA-MB-231을 사용한다. 주 동안 배양 세포 집단의 확산 및 개별 세포의 이주 역학 라이브 세포 이미징을 사용하여 모니터링 및 시공간 - 분해 된 데이터를 추출하기 위해 분석 될 수있다. 게다가상기 방법에 따라서 세포 이동에 생물 물리학 적 미세 인자의 역할을 조사하기 간단하지만 강력한 방법을 제공하고, 다양한 세포 외 기질을위한 용이하게 적응할 수있다.

여기에 제시된 동심 겔 분석 고도로 침윤성 유방암 세포를 사용하여 수행하고, MDA-MB-231, 2.4 ㎎ / ml의 내측 콜라겐 젤, 예로서 = 2 × 106 세포 / ml의 세포 시딩 밀도와. 도 2에 도시 된 바와 같이, 통상적으로 배양 몇 일 후, 세포 내외 겔 인터페이스를 위반하고 외측 겔 침투하기 시작했다. 셀 인구는 반경 방향 바깥쪽으로 주로 확산. 외측 겔 중합 조건은 세포...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K 조회수.  FOM Institute AMOLF.  기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다. 

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

연구

생체공학

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

의학

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...