The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

여기에 설명 된 프로토콜은 급성 림프 모구 백혈병 세포주 NALM6를 사용하지만, 다른 유형의 세포에도 적용 할 수있다. 1. 솔루션 및 시약 <ol><li> 전체 RPMI <ol><li> 56 ml의 소 태아 혈청 (FCS) 및 RPMI-1640 배지 500㎖의 병에 200 ml의 5.5 mm의 L - 글루타민 추가. </li></ol></li><li> BrdU의 원액 <ol><li> 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)에서 32.5 mM의 BrdU의 (10 ㎎ / ㎖)을 준비합니다. </li></ol></li><li> BrdU의 전체 RPMI <ol><li> 전체 RPMI 10 ㎖에 BrdU의 주식 솔루션의 6.2 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> DNase의 솔루션 <ol><li> 1 밀리그램의 DNase / DPBS에 mL로 준비합니다. </li></ol></li><li> 염색 버퍼 <ol><li> DPBS에서 3 % 열 - 불 활성화 FCS 및 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 준비한다. </li></ol></li><li> 고정 버퍼, 투과성으로 버퍼 및 세척 버퍼의 정의에 대한 자료 목록을 참조하십시오. </li></ol> 2. 세포 아니테 : 세포 6 개월을 초과하는 배양하지 않았다. 이 방법은 셀 밀도 및 배양 배지에 대한 조정과 비 - 부착 세포 라인에 직접 적용 할 것이다. 실험의 개시에 기하 급수적으로 증가하고 세포를 사용합니다. <ol><li> 전체 RPMI에서 T-75 배양 플라스크에 NALM6 세포를 유지한다. 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛을 사용하여 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 세 번 주간 문화를 분할하여 ml의 당 6 10 × 1-2 사이의 세포를 NALM6 세포를 유지한다. </li><li> 공기에서 이산화탄소 5 %에서 37 ° C에서 품어. </li></ol></li></ol> BrdU의와 세포의 3 펄스 라벨링 주의 : 잠재적 돌연변이와 기형은주의하여 BrdU의를 처리합니다. <ol><li> 5 분 150 XG에 원심 분리기 세포. 참고 : 신선한 매체에 세포를 전송하는 것은 결과의 재현성을 향상시킨다. </li><li> 2 × 106 (C)에서 완전 RPMI에서 세포 수와 세포를 재현 탁 수행ELL 학생 / ㎖. </li><li> BrdU를 완전 RPMI 1 × 106 세포 / ml의 최종 세포 농도를 생산하는 두 셀 1 희석. </li><li> 다음 완전한 RPMI 10 셀 1 희석, 45 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션. 조심스럽게 (150) 5 분 XG와 원심 분리기 세포 상층 액을 모두 폐기합니다. </li><li> 완전한 RPMI의 작은 부피 (~ 100 μL)에 재현 탁 된 세포는 세포 수를 수행하고 1 × 106 세포 / ml로 조정한다. </li><li> 피펫 48 웰 플레이트로 세포를 1 ㎖. 모든 빈 우물에 DPBS의 피펫 1 ml를 더 재현 가능한 결과를 얻을 수있다. </li><li> (17) 여기에서, 원하는 시점들, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 공기 중 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 부화 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24 시간. 참고 : 시간의 길이는 실험 설계 측정하는 것을 목표로 무엇에 따라 달라집니다. </li><li> 피펫을 사용하여 외과 튜브로 모든 세포를 전송합니다. 1ml의 volu로 잘 헹구고 순차적5 ㎖의 최종 총 부피의 PBS MES. </li><li> 5 분 150 XG에 원심 분리기 조심스럽게 모든 뜨는을 제거합니다. 세포를 염색 할 준비가 즉시 (4 절)을 수행합니다. </li></ol> 4. 세포 얼룩 주 : 세포 표면 염색이 필요한 경우 세포에 걸쳐 4 ℃로 유지되는 것을 보장하기 전에 고정을 수행한다. <ol><li> 염색 버퍼 100 ㎕에 재현 탁 세포 (옵션 표면 염색은 항원을 표면 및 4 ℃에서 30 분 동안 배양 항체의 권장 볼륨을 추가). </li><li> 150 XG에서 5 분 동안 염색 버퍼 1 ㎖, 원심 분리기를 추가하고 상층 액을 버린다. 참고 : 등 특정 항체 농도, 배양 시간을 특정 실험 목적에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 고정과 투과성으로 <ol><li> 고정 버퍼 100 ㎕에 세포를 재현 탁하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 1 ml의 O 추가F 세척 버퍼, 150 XG에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 버린다. </li><li> 투과성으로 완충액 100 ㎕에 세포를 재현 탁하고 얼음에 10 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> 150 XG에서 5 분 동안 세척 버퍼 1 ㎖, 원심 분리기를 추가하고, 상층 액을 버린다. </li><li> 튜브 당 고정 버퍼 100 ㎕에 세포를 재현 탁하고 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> 150 XG에서 5 분 동안 세척 버퍼 1 ㎖, 원심 분리기를 추가하고, 상층 액을 버린다. 주 : 필요한 경우, 프로토콜은 여기에서 일시 정지 될 수있다. 염색 완충액 경우 고정 된 세포는 4 ° C에서 며칠 동안 안정하다. 진행하기 전에 원심 분리 다음 염색 버퍼를 제거합니다. </li></ol></li><li> DNase의 치료 <ol><li> DNase의 용액 100 ㎕ (30 DNase의 / 10 6 세포의 μg의), 37 ℃에서 1 시간 동안 세포를 배양에 재현 탁 세포. </li><li> 5 분 150 XG에 세척 버퍼, 원심 분리기 1 ML을 추가하고 상층 액을 버린다. </리&gt; </ol></li><li> 항체 염색 주 : BrdU의 이외의 세포 마커 염색 BrdU의 염색과 동시에 행할 수있다. <ol><li> 중요 : 각 하나의 형광 색소로 표지 흠없는 세포와 세포로 구성된 보상 컨트롤을 준비합니다. 이상적으로, 실험 튜브에 사용되는 것과 같은 보상 컨트롤 같은 항체를 사용합니다. 이것이 가능하지 않을 경우, 고도로 발현 항원 항체 대신 동일한 형광 색소에 접합. </li><li> 세척 완충액 50 μL에 재현 탁하고 세포를 1 μL / BrdU의 항체 10 6 세포를 추가한다. 참고 : 다른 특정 세포 내 항원에 직접 결합하는 항체도 추가 할 수 있습니다. 주 :. cdc2에 Ser10 인산화 히스톤 H3에 항체가 G2 및 M에서 세포를 구별하는 데 사용할 수있는, 히스톤 H3 유사 분열 동안 Ser10에 인산화 10 항체는 근래 세포를 검출하는데 사용될 수 Tyr15 인산화전자 유사 분열에 최선을 다하고 있습니다. (11) </li><li> 실온에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 5 분 동안 150 XG에서 1 세척 버퍼의 ml의 원심 분리기 세포를 추가하고 상층 액을 버린다. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> 세포주기 분석을위한 얼룩의 DNA <ol><li> 펠렛을 풀고 7-AAD 용액 (0.25 μg의) 20 μl를 추가합니다. 주 : 7-AAD / 셀의 일정한 양을 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> 염색 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법 데이터 5. 컬렉션 참고 : 사용되는 형광 색소의 수와 특성에 따라 달라집니다 필요한 기계. <ol><li> 다음과 같은 파라미터를 수집 FSC-A, SSC-A, FSC-H 선형 스케일 7- AAD 형광 (FSC-W는 FSC-H 대신에 사용될 수있다). 로그 스케일 APC 채널 모아서. 로그 스케일을 사용하여 표면 또는 내부 라벨의 평가를 위해 필요한 추가 채널을 수집합니다. </li><li> COM을 수행시료를 분석하기 전에 다른 형광 색소 사이의 발광 스펙트럼 관찰에 신호를 중첩 보정 :. 참고 : 대부분의 유동 세포 계측기가이 작업을 자동으로 수행합니다. </li><li> 각 샘플에 대해 적어도 10,000 이벤트를 수집합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법 데이터의 분석 (6) 주 : 데이터 해석되지만, 다른 소프트웨어 패키지가 또한 사용될 수있다 계측법 FlowJo 흐름이 연구에 사용 하였다. 게이팅 전략은도 1에 도시되어있다. <ol><li> FSC-A와 SSC-매개 변수를 사용하여 실행 가능한 세포 인구를 식별합니다. </li><li> 이 인구 내에서 이중선과 (도 여기에 사용할 수있는 FSC-W) FSC-A 및 FSC-H를 사용하여 집계를 제외합니다. </li><li> 모집단 내의 Y 축의 X 축 및 BrdU의 APC-7-AAD를 사용하여 도트 플롯을 설정한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> 그림 1 : 게이팅 전략 왼쪽 PA.Nel 보낸 : ungated 세포는 SSC-도트 플롯 대 FCS-에 표시됩니다. 가능한 세포 인구가 도시 게이트로 식별됩니다. 센터 패널 : 왼쪽 패널에서 문이 세포는 FSC-H 도트 플롯 (대신 높이를 사용할 수 있습니다 FSC-W) 대 FSC-에 표시됩니다. 이중선과 집계가 확인하고 그림과 게이트에 의해 제외됩니다. 오른쪽 패널 : 중앙 패널에 이중 배제 날로부터 게이트 세포가 APC-도트 플롯 대 7-AAD에 표시됩니다. BrdU의 항체는 APC는 펄스 라벨 동안 BrdU의를 통합 한 세포의 식별을 가능하게 표시되어 있습니다. 7-AAD는 DNA 콘텐츠에 대한 정보를 제공합니다. 상단 게이트는 BrdU의 펄스, 왼쪽 하단 게이트, 세포 G 0/1 및 G에 그 오른쪽 게이트의 시간에 S 단계에 따라서 BrdU의 양성 세포를 정의 / M 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <ol start="4"><li> 세포주기<html> nalysis <ol><li> 이중 제외 게이트의 셀의 첫 번째 데이터 파일과 문을 엽니 다. </li><li> (FloJo 소프트웨어 플랫폼 아래에있는) 세포주기 분포이 인구를 분석하고 딘 - 제트 - 폭스 모델을 사용합니다. </li><li> G 0/1 및 G 게이트를 작성하여 2 / M 피크의 위치를 가져옵니다. </li><li> BrdU의 양성 세포와 주제에 게이트 같은 세포주기 분석이 인구. </li><li> 만들 게이트에서 같은 게이트를 적용하고 G 0/1 및 G 2 / M 피크의 위치에 대한 (생성 된 게이트를 사용하여) 제약 조건을 설정하여 G 0/1 및 G 2 / M 피크의 위치를 제공합니다. 이는도 2의 제 2 패널에 도시되어있다. 주의 : 다른 소프트웨어는 데이터를 분석하는데 사용될 수 있으며, 설명은 따라서 변할 것이다. </li></ol></li></ol>840 / 52840fig2highres.jpg &quot;폭 =&quot;700 &quot;/&gt; 그림 2. 세포주기 진행 첫번째 패널 (모든 셀)을 겹 배제 게이트에 의해 정의 세포군에 게이팅된다. 이 인구는 X 축에 7-AAD와 히스토그램 표시했다. G 0/1 피크의 피크 축 아래 화살표로 표시된다. 도 1에 도시 된 바와 같이 후속하는 패널에서의 BrdU 양성 세포상의 게이팅되었다. 이중선 배제 게이트의 게이팅 때 얻어지는 G 0/1 위치에 대한 값은 FlowJo 세포주기 소프트웨어 내에서의 BrdU 양성 게이팅 셀에인가된다. 도 1과 처음 두 패널에 도시 된 바와 같이 전체 모집단을 분석 할 때 얻어진 값에 기초하여 G 0/1 피크의 위치에서와 같이 이후의 각 패널은 BrdU의 양 인구에 게이팅되었다. 동일한 SAMP에서의 BrdU 양성 세포에 대해 G 0/1 인구의 위치를 식별하는 BrdU의 음 부분을 사용하여제작 샘플의 DNA를 얼룩의 강도에 어떤 약간의 차이를 제어합니다. 각각의 패널 상에 표시된 숫자는 BrdU의 펄스가 종료 된 이후의 시간을 나타낸다. 계산 된 세포주기 단계가 음영 녹색으로 표시되어있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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The authors have nothing to disclose.

세포주기 분석하는 능력은 암 생물학을 이해하고 세포 증식 및 성장에 영향을 미치는 두 약물 및 유전자의 작용 메카니즘에 중요하다. 전하는 세포 증식을 측정하는 검정법 다수 존재하지만, 대부분은 단지 본 셀 번호를 나타내는 측정 값을 제공한다. 이들은 직접 시각화 및 계산, 신진 대사 활동 또는 ATP 농도로 세포 수를 측정 분석을 포함한다. 이러한 방법의 많은의 주요 장점은 조건 또는 화합...

세포주기 진행 동안에 세포주기 및 세포 기능에서 발생하는 변화의 평가는 생물, 특히 암 생물학의 여러 측면의 이해에 기초한다. 악성 종양의 치료를 위해 개발에 많은 제제는 세포주기 진행에 지대한 영향을 미칠 또는 세포주기 - 종속 메카니즘을 통해 세포 사멸을 유도한다. 세포주기의 특정 단계에서 세포주기 역학 또는 세포를 연구하기 위해, 세포를 동기화하는 것이 일반적이다. 그러나 동기화 방법은 잠재적 결과 얻어진 교란, 검토되고 세포에 해로운 영향을 가질 수있다. 1 시간에 걸쳐 하나의 세포에서 세포주기 진행의 최근 세포주기의 특정 단계에서만 존재하는 형광 태그 된 단백질의 사용이 허용 된 분석 (2) 그러나,이 세포는 유전자가 읽을 수있는 시스템의 사용을 제한하는, 이들 태그가 단백질을 발현하도록 조작 할 필요가 공부 될ILY 달성했다. 합성 (S) 상, DNA 복제와 유사 분열 (M) 여기서 세포 분열이 발생되어 세포주기는 두 개의 활성 단계로 구성됩니다. 이 단계는 세 갭 단계, G 0, G 1 및 G 2로 구분됩니다. 셀의 크기가 종래 세포 성장은 DNA 복제의 완료 사이하지만 세포 분열 전에 계속 DNA 복제와 G이 증가 여기서 G는 0 또는 정지, 세포주기를 떠난 쉬고 위상이고, G 1이다. 세포주기를 통해 진행이 체크 포인트의 수에 의해 제어된다. 환경 조건이 DNA 합성을지지하지 않으며 S 단계 진입을 방지 할 때 G 1 체크 포인트가 활성화됩니다. 인트라 S 상 검문소 또는 지연 실속 복제 포크 초래할 수 DN​​A 손상에 의해 유발 될 수있다. 손상 후 G 2 검출되면 G 2 중 DNA의 복제 충실도를 확인되고 </서브&gt; 체크 포인트는 분열을 셀에 DNA 복구 전에 허용 활성화됩니다. 유사 분열 동안 최종 체크 포인트는 세포 분열이 성공적으로 완료 될 수 있도록 염색 분체가 제대로 유사 분열 판에 정렬되어 있는지 확인합니다.이 체크 포인트 3 활성화는 일반적으로 세포 인구를 동기화하는 데 사용됩니다. 세포주기 체크 포인트는 다수의 인자에 의해되지만 가​​장 일반적인 DNA 손상의 검출의 암 생물학에서 활성화 될 수있다. DNA 손상 응답 (ATR) 관련 PI3 키나아제 형 키나제의 실조증 모세 혈관과 Rad3 의해 개시 및 운동 실조의 모세 혈관이 (ATM) 각각 하류 효과기 키나아제 CHK1 및 Chk2를 활성화하는 돌연변이. 3 이벤트 범위가 정지 포함 CHK1를 기동 복제 포크 DNA 가교 결합 및 자외선 손상 Chk2는 주로 이중 가닥 바꿈에 의해 활성화된다. 세포주기의 전 길이에 변경된 조건의 효과를 연구하기위한 통상의 방법S는 세포주기의 특정 단계에서 세포를 동기화한다. 한 이것은 여러 가지 방법을 통해 달성 될 수있다. 세포를 물리적 크기, 밀도, 측면 스 캐터 (입상), 및 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 분리 될 수있다. 더 실제적으로, 세포는 화학적 수단에 의해 동기화 될 수있다. 예컨대 티미 딘, 히드 록시 우레아 및 시토신 아라 비노 여러 에이전트는 에이전트가 제거 된 후 순환을 계속 S 단계에서 세포의 축적으로 인한 세포주기의 S 단계에서 DNA 합성을 억제하는데 사용될 수있다. 또는 M 상 DNA 함량 - 세포는 G 2 방추사 형성 체포 방지 nocodazole으로 처리. G 0 단계에서 세포의 축적 배지 결과에서 혈청의 제거. 배양 혈청 내의 영양소의 재 첨가 세포의 정상적인 순환을 재 - 시작한다. 그러나 이러한 동기화 방법은 모든 세포의 정상적인 순환과 성장을 방해 할 수 resul중요한 세포 사멸에 T. 급성 림프 구성 백혈병 세포의 동기화는 특히 도전이며,이 세포는 유전자 조작 의무가 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 세포주기 역학 평가 전통적인 동기화 또는 유전자 조작없이 세포주기의 특정 단계에서 세포의 연구를 허용한다. 이 방법은 유전자 변형 전통적인 동기화 과정이 용이하게 달성되지 않은 다른 세포 유형에 유용 할 수있다. 방법은 세포의 단기 성장과 증식에 거의 영향을 미치지 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 혼입의 노포 사용에 기초한다. 4 설립 BrdU의 프로토콜은 S 단계에서 새로 합성 된 DNA 내로 BrdU의 혼입을 활용 . 이것은 영구적 BrdU의 노광 중에 S 단계에서 된 것으로 세포를 표시한다. 이는 인구의 BrdU의 incorpor위한 염색하여 나중 시점에서 식별 될 수있다ATION 이에 따라야하고 세포주기 교통 약물 효과의 연구를 허용하는 시간에 걸쳐 평가 될 수 동기 인구로서 작용한다. BrdU의 보통의 DNase 또는 산 처리 다음 달성 전에 항체 염색에 노출 될 필요가있다. -6,7- BrdU의 도입은 부가적인 마커의 포함을 가능하게 검출하기 위해 유세포 사용. 가장 중요한 연구의 개시시에 S 상에 있던 세포의 세포주기 위상 분포의 평가를 가능하게 DNA 함량을 측정하기 위해 염료를 사용하는 것이다. (8) 또한 추가적인 표면 또는 세포 항원은 또한 조사 할 수있다. (9) 이러한 이러한 사료된다 등의 세포주기 이벤트 관련 또는 절단 카스파 제 -3와 같은 세포 사멸 마커 등으로 관련이 없어 보이는 세포의 기능을 할 수 있습니다. 잠재적 인 응용 프로그램은 연구자의 상상력에 의해 제한됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC BrdU Flow Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552598</td>
			<td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm 
			Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561651</td>
			<td>Referred to as Permeabilization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Referred to as Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Stain Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FORTESSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P2, P20, P100, P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>FisherBiotec</td>
			<td>FBS-7100113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon TC 150cm2 vented Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 25mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 200&#181;L</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 1mL</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Spintron</td>
			<td>GT-175R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>C 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9708S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>2197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td><a name="RANGE!C23">2348S</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NALM6&#160;</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

이 방법은 다양한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다. 일부 응용 프로그램은 여기에 설명되어 있습니다. 세포주기의 지속 기간의 평가 세포주기를 통해 세포로 운송하는데 필요한 시간을 결정하기 위해, 세포를 BrdU의 펄스 아래의 다양한 시점에서 수확한다. 평가의 간격은 분석되는 특정 셀에 적용될 수있다. 조혈 세포주는 표준 배양 조건에서 세포주기 ?...

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Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization | Biology | Video

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

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19.0K 조회수.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney.  이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다. 

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

연구

생물학

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

의 동기화<em&gt; Caulobacter Crescentus</em&gt; 세균 세포주기의 조사에 대한

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...