저자는 보건 연구 (CIHR)와 자신의 실험실에서 세포주기의 연구 자금에 대한 캐나다 암 협회의 캐나다 연구소 감사하고 싶습니다. MJC은 CIHR에서 MD / 박사 교제를받는 것입니다. MJC와 석사는 CaRTT 훈련 프로그램의 회원입니다.

1. 라벨링 및 세포의 고정 <ol><li> 세포 증식의 라벨링 시약 (BrdU) 당 ML 세포 배양 매체 (1-1000 희석) 일시간 수확하기 전에 1 μL를 추가합니다. 라벨 기간은 느리게 성장하는 세포를 위해 길어해야 할 수 있습니다. </li><li> 수확 세포하려면, 기음 문화 매체와 인산염과 함께 철저하게 세척은 식염수 (PBS)를 버퍼. 철저히 매체의 흔적을 제거하는 반복합니다. </li><li> 신속 PBS가 3mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함과 함께 세 번째로 문화를 씻고 완전히 기음. </li><li> 각각의 접시에 3mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 PBS의 작은 볼륨을 추가 6cm 요리에 대한 0.5 ML이 이상적입니다. ° C 세포를 분리하기 위해 약 5 분 동안 22 알을 품다. 15 ML 원뿔 튜브로 전송합니다. </li><li> 펠렛 5 분 500 XG에 원심 분리기 세포는 표면에 뜨는 제거하고 PBS 100 μL에 철저 resuspend. </li><li> vortexing 동안 95 % EtOH, dropwise 5 ML을 추가하여 세포를 수정. 이 단계에서 전지 최소한 4 ° C에 저장할 수 있습니다달. </li></ol> 2. Denaturing과 BrdU와 DNA의 염색법 <ol><li> 펠렛 전지 5 분 500 XG에 세포를 원심 분리기와 95 % EtOH를 제거합니다. vortexing하는 동안 드롭 현명한 방식으로 추가하여 2N HCL 1 ML 및 0.5 % TX - 100에 Resuspend. 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> 섹션 2.1로 이전 원심 분리기와 세포가이 단계에서 매우 느슨한 펠렛을 형성 때문에 신중하게 뜨는 기음. 부드럽게 0.1M 잡을 4 O 7 (산도 8.5) 1 ML에 resuspend하고 실온에서 적어도 30 분 동안 incubated. </li><li> 위의 섹션 2.1 마우스 방지 BrdU 항체와 항체 솔루션의 0.5 ML (PBS가 1% BSA 및 0.2 % 십대 초반 - 2​​0을 포함)에 resuspend로 펠렛 전지 50에 1을 희석. 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> 펠렛 세포가 다시와 FITC에 복합 토끼 안티 - 마우스 차 항체를 포함하는 항체 솔루션의 50 ML에 resuspend 25-1을 희석. 30 분 동안 품어benchtop 가벼운으로부터 보호합니다. </li><li> 원심 분리기 세포는 최종 시간과 resuspend propidium의 요오드화물 및 RNase 용액 (1 % BSA와 PI - RNAse 솔루션, PBS, 10 MG / ML propidium의 요오드화물, 0.25 MG / ML RNase A) 0.5 ML에서 37 어둠 속에 품어 ° 30 분 C. 또는 RNA는 4에서 잠을 자면 소화 수 있습니다 ° C는 어둠 속이라서. </li><li> 집계를 제거하고 흐름 cytometer에 샘플 이해에 대한 적절한 튜브 단일 세포를 수집하는 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 전달합니다. 다시, 샘플은 빛에 직접 노출로부터 보호되어야합니다. </li></ol> 3. 유동세포계측법에 의해 분석 <ol><li> 세포는 propidium 요오드화물의 및 FITC에 맞는 검색 기능이있는 doublets (하나의 흐름 셀을 통과 두 개는)에 대한 차별이 가능합니다 표준 흐름 cytometer로 분석해야합니다. 단일 세포는 앞으로 뿌리와 사이드 분산형 팝업을 기반으로 이벤트를 게이팅하여이 유동세포계측법 응용 프로그램에서 감지할 수 있습니다ulations 및 propidium 요오드화물에 의한 DNA의 얼룩의 속성을 사용하여. 이중어 차별 도트 음모의 모양은 흐름 cytometers 및 propidium 요오드화물 얼룩 속성에 의존 사이의 차이, 분석의 이중어의 discriminator 설정에 대한 조언 해당 지역 유동세포계측법 시설을 참조하십시오. 일반적으로 세포의 비동기 proliferating 인구에서 하나의 세포는 일반적으로 이중어 차별 음모 두 가장 풍부한 봉우리 (2N와 4N DNA)이며 게이트는 주위 그려져 있어야합니다. 이것은 아래와 이후의 모든 분석에 사용되는 단일 셀 이벤트를 선택합니다. </li><li> 분석하는 첫 번째 예제는 얼룩과 흐름 cytometer 설정에 대한 긍정적인 제어 역할을 비동기적으로 proliferating 문화하여야한다. 일중 세포에서 2N와 4N 봉우리가 X 축 200 400 (임의 단위)에 중심되는 등 propidium 요오드화물의 얼룩에 대한 photomultiplier 튜브의 감도를 조정합니다. 우리는 종종 풍부한 s를 얼룩흐름 cytometer의 모든 매개 변수가이 샘플을 사용하지 않고 적절하게 조정되었는지 확인하려면 다음과 세포 upply. 새로운 사용자가 흐름 cytometer의 운영보다 친숙해질 수 있도록이 긍정적인 제어도 도움이됩니다. </li><li> G1 및 G2 / M 인구가 배경 이상의 것을 같은 FITC 검출을위한 photomultiplier 관의 감도를 조정합니다. BrdU 양성 세포는 약 10 배 더 밝아 및 Y 축이 로그 스케일로 표시되어야한다. 그것은 분명 긍정적으로 스테인드 세포를 구분하는 BrdU의 얼룩에 대한 부정적인 컨트롤 (단계 위의 2.3가 아닌 특정 IgG와 안티 BrdU 항체를 대체하여)를 포함 때로는 도움이됩니다. </li><li> 아래에서 G1의 흐름 cytometer 양식 마제형 아크에 의해 캡처된 단일 이벤트가 S - 단계까지 왼쪽 아래 G2 / M. 위해 오른쪽 하단에 그러한 propidium 요오드화물의와 FITC 사이의 보상을 조정 깊이 그 안에 더에 대해 다음 참조를 참조하십시오특정 응용 프로그램 2에 도착 유동세포계측법 및 참조의 원리 및 사용 cussion. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> DNA 내용의 원하는 범위 10 000 단세포 이벤트 5 000은 문화에 세포의 인구가 완전히 샘플링되었다는 확신을 가지고하기 위해서는 각 샘플에 대해 수집해야합니다. </li><li> 일단 세포들은 G1, S, 또는 G2 / M 단계에 할당해야합니다 propidium 요오드화물 및 BrdU의 콘텐츠에 대한 측정되었습니다. 200 400 (각각 G1 및 G2 / M)에서 중심 두 BrdU 부정적인 인구 주위에 빌 게이츠를 그림으로써이 작업을 수행합니다. 이 상자는 위의 모든 S - 단계 (그림 1A)를 측정 단일 게이트에 포함되어야합니다. 각 게이트에있는 세포의 비율은 G1, S, 및 G2 / M (그림의 1B)에 세포의 상대적인 수를 나타냅니다. </li></ol> 5. 세포의 혼합 인구에서 세포주기의 분석을위한 대체 프로토콜 <ol><li> 이것은 다른 프로토콜입니다가장 도움이되면 세포의 순수한 인구를 선택하는 약물 치료가 허무는 표현 벡터의 transfection은 정기적으로 관심의 유전자 산물을 표현하는 세포의 낮은 비율 결과, 또는. 많은 인구와 오염되고 관심 세포의 비교적 작은 비율이 결과는 세포를 untransduced. 이 경우, 이러한 CD19 4 등 GFP 3 정박 막으로 유동세포계측법, 또는 외국 세포 표면 마커로 transfected 세포를 검출 마커를 표현하는 플라스미드와 함께 유전자 또는 관심 shRNA을 표현하는 공동 transfect의 plasmids CD20 5. </li><li> 이 프로토콜의 목적을 위해 우리가 예제로 CD20 얼룩를 사용하지만, CD19에 대한 얼룩 것은 근본적으로 동일합니다. CD20과 transfection의 경우, BrdU 레이블 필요가 없습니다, 난에있는 세포를 20 μL FITC 복합 백신 CD20 항체를 추가하여 위의 1.5 단계 1.2에서 설명한 및 얼룩과 같은 단순히 수확 세포어둠에 20 분 CE. 와 같은 단계 1.6에서 설명한 세포를 수정. 전지는 다시 4 적어도 한 달 저장할 수 ° 어둠 속에 C. GFP의 검출을 위해,이 단계 및 수정의 항체 얼룩을 생략하고 설명한대로 세포를 저장합니다. </li><li> 5 분 500 XG에서 원심의 pelleting와 PBS가 1 % BSA를 포함하는 5 ML에 resuspending로 다시 수화물 전지. </li><li> 절 2.5에서 위에서 설명한 propidium 요오드화물 및 RNase 솔루션의 0.5 ML 5 분 resuspend 세포 500 XG에 다시 펠렛은 세포. </li><li> 3.1 및 3.2에서 2.6 및 분석 지침 세포 준비 지침을 따라 계속합니다. </li><li> 흠없는 세포 배경 위의 것을 그러한 FITC 검출을위한 photomultiplier 관의 감도를 조정합니다. 이상적으로, CD20 - FITC 긍정적인 세포가 배경보다 100X 더 강렬한 스테인드에 10X되며이 음모를 Y 축은 로그 스케일 (그림 2A)로 표시되어야합니다. backg보다 10X 밝은 아르 CD20 양성 세포그림과 같이 원형은 (200 400 사이의 propidium 요오드화물 얼룩 포함) 히스토그램 propidium 요오드화물 비해 셀 계산에 표시를 선택합니다. 2C. 쉽게 CD20 양성 컷 - 오프가 10X 배경으로 설정해야합니다 (100X 배경 위에 ie. 10X) 밝게 스테인드되는 표식을 표현하는 세포 라인에. 관심의 유전자도 약하게 이러한 세포로 표현되기 때문에 약한 얼룩 세포의 포함은 아마도이 실험의 다양성을 증가시킵니다. 단 약하게 스테인드 CD20 반응을 (10X 배경 미만 ie.), 항복 세포 라인을위한 컷 오프의 결정은 CD20 스테인드, untransfected 세포로 구성된 부정적인 컨트롤을 사용하여야한다. </li><li> 적어도 1,000 CD20 양성 행사는 각 샘플에 대해 수집해야합니다. 1000 이벤트 적은 그게 실험은 높은 다양성을 생산합니다. 이러한 ModFit LT (진실성 소프트웨어), 멀티 사이클 AV (피닉스 흐름 시스템) 및 흐름 조 (트리 스타)와 같은 소프트웨어 패키지는 수학 견적 사용이러한 그림에 표시된 것과 histograms에서 곡선의 모양에 기여 G1, S, 및 G2 / M 인구. 2B와 C. </li></ol> 6. 대표 결과 : 우리는 우리의 접근 방식을 사용하여 실험 세포주기 분석의 세 가지 예제를 제공합니다. 첫 번째는 마우스 배아 섬유아 세포에서 cyclin 의존 키나제 억제제의 p27KIP1의 retroviral 표현을 사용합니다. 바이러스 감염에 대한 약물 선택이 완료되었습니다 24 시간 후 세포 맥박은 한 시간 BrdU으로 표시되었습니다. 본 실험에서는 억제제 이소성 표현은 세포 (그림 3A와 B)의 확산을 체포하는 데 사용됩니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3B 작은 BrdU 긍정적인 이벤트가 p27에 대한 응답으로 S - 상 게이트에 분명 있습니다. 그림 diagramed로 마찬가지로, p27 표현 세포에 대한 S - 단계에 세포의 비율은 아주 낮습니다. 3C. 분석의이 유형은 g의 다양한 변종에서 파생된 세포의 세포주기 제어 결함을 특성화에 매우 효과적되었습니다마우스 6, 7, 8, 9, 에너지 타겟. 두 번째 실험에서, untransformed mammary 상피 세포 (MCF10A)는 24 시간 동안 성장 인자 베타 하나를 (TGF - β1) 변화, 성장 억제 시토킨로 치료했다. 전지는 즉시 수확하기 전에 네 시간 동안 BrdU으로 표시되었습니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. S - 상 세포 4 BrdU 라벨이 크게 TGF - β1 신호가 감소되어 우리의 얼룩의 특이성은 또한 IgG 대조군 (그림 4C)으로 검증됩니다. 세포주기의 다른 단계의 부량는 TGF - β1은 주로이 단계에서 축적에 이르는, 세포주기의 G1 단계에서 확산을 억제되었음을 알려 드리기위한 것입니다. 마지막 예제에서는 PRB 결함 미친 - 2 세포는 CMV - CD20 발현 벡터 및 CMV - RB ​​또는 컨트롤과 같은 CMV - β - 걸 중과 transfected 있습니다. transfection 전지 다음 사흘은 수확 스테인드 및 수정되었습니다. 이러한 세포의 유동세포계측법 분석들 그림에 표시됩니다. 5. 이것은 PRB 표현 72 시간 다음과 같은 분포 (그림의 5B)과 비교 대조군 transfected 세포 (그림의 5A)의 세포주기 분포를 보여줍니다. 멀티 사이클 소프트웨어에 의해 커브 피팅 다음, 세포주기 단계의 비율의 직접적인 비교는 그림에 표시됩니다. 5C. 이것은 G1 다음 PRB 표현에서 세포의 축적과 S와 G2 / M 단계에서 세포의 상대적 고갈을 보여줍니다. 우리는 G1의 체포 메커니즘을 광범위하게 9, 10, 11, 12, 13을 알아내기 위해이 분석에 유사 콘텐츠를 사용했습니다. 이 예제는 세포주기 제어가 자극이나 세포 조작의 다양한 대응 측정할 수 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 따라서 문화 형식 실험에서 세포주기의 위치 측정을 필요로 많은 응용 프로그램에 적용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> 그림 1. Quantit결합 propidium 요오드화물의 및 BrdU의 얼룩 (PI - BrdU)에 의해 세포주기 단계의 ation. (A)이 패널은 propidium 요오드화물과 BrdU의 스테인드 세포의 입체 유동세포계측법를 표시합니다. 2N와 4N DNA 내용과 함께 세포의 propidium 요오드화물 얼룩 강도에 대한 X - 축 규모에 200 400마르크 이상을 중심으로됩니다. BrdU의 얼룩 강도는 Y 축에서 로그 스케일에서 측정됩니다. 세포주기의 G1, S, 및 G2 / M 단계에서 세포를 quantitate하는 데 사용되는 게이트의 위치를​​ 적어 둡니다. (B)에서 G1, S, 및 G2 / M 게이츠의 각 세포의 상대적인 비율이 그래프에 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> 그림 2. propidium 요오드화물과 세포 표면 마커의 CD20을 사용하여 선택한 셀에 셀주기 단계의 Quantitation. (A)이 패널은 propidium 요오드화물과 세포의 혼합물에 대한 CD20 얼룩을 보여줍니다, 어떤 것들의 대부분은 ectopically CD20과 PRB을 표현. 참고로 세포2N와 4N의 DNA (가장 풍부한 인구)은 X 축에있는 200 400마르크 이상의 중심입니다. CD20 + 게이트의 위치는 배경보다 적어도 10X 더 밝게 묻은 게있다 셀을 선택합니다. (B)의 propidium 요오드화물 얼룩 대 셀 카운트의 그래프는 비동기 proliferating 아르 패널에서 CD20 음성 세포에 대해 표시됩니다. (C)와 유사한 그래프 패널에서 CD20 양성 세포에 대한 표시됩니다 PRB 표현과 함께 체포 주로 2N DNA 컨텐츠와 세포를 포함하는 유도되었는지. 이것은 체포 하위 인구이 얼룩 기술을 사용하여이 문화의 다른 세포에서 구분할 수 있습니다 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> p27KIP1에 의한 세포 증식의 그림 3. 억제. (A) PI - BrdU 분석은 빈 pBABE retroviral vecto와 transduced되었습니다 세포의 비동기 proliferating 인구의 세포주기의 단계를 측정하는 데 사용됩니다R. (B) 세포의 유사한 분석 pBABE - p27와 transduced. S - 위상 및 G1 및 G2 / M 게이트 사건보다 강도 세포의 부재를 적어 둡니다. 비동기 제어 및 p27 표현 세포 proliferating에서 세포주기의 각 단계에서 세포의 (C) Quantitation. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> 그림 4. TGF - β1에 의한 세포 증식의 억제 비동기 MCF10A 세포를 proliferating의 (A) PI - BrdU 분석. 24 시간 동안 TGF - β1의 100 PM 취급 세포 (B) 분석. 주로 세포주기의 G1 단계에서 세포의 축적을 확인합니다. 비동기 proliferating 세포가 아닌 특정 IgG 컨트롤과 함께 안티 BrdU 기본 항체를 교체하여 BrdU의 얼룩의 (C) 확인. (D) 그래픽에서 각각의 세포주기의 단계의 quantitation와 B. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; 그림 5. PRB에 의한 세포 증식의 억제. (A) CD20의 propidium 요오드화물 얼룩 및 SS - 여자 transfected 세포 대 세포 카운트가 표시됩니다. 하위 인구 transfected에 대한 부적 절한 관리로 - transfection 부분적으로 untransfected 인구 (CD20 세포)를 렌더링, 세포를 동기화할 수있는이 중요한 컨트롤입니다. Transfected 세포는 다른 analogously transfected 세포와 비교해야합니다. (B) 셀 카운트 대 CD20 및 PRB의 propidium 요오드화물 그래프 세포를 transfected. 2N 피크의 거의 독점적인 존재를합니다. (C) 세포주기의 위상 비율의 그래픽 표현은 멀티 사이클 소프트웨어에서 곡선 피팅 방법을 이용하여 A와 B에서 결정됩니다.

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	<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+introduction.">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li><li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker,+Us9-GFP,+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li><li>Qin, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action.">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li><li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control.">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li><li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions.">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li><li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development.">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li><li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin.">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li><li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation.">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li><li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein.">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities.">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li><li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins.">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins.">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리의 경험에서이 기술을 성공 몇 가지 주요 컨트롤과 실험 조건에 따라 달라집니다. 하나는이 실험에 사용하기 위해 비동기 proliferating 컨트롤을 구축합니다. 이 컨트롤은 세 중요한 목적을 수행합니다. 첫째, 모든 실험 샘플에 사용되는 문화 조건이 치료의 부재로 지속적인 확산을 지원하기 위해 충분한 것을 보장합니다. 이 예제에서는 또한 존재하는 경우 BrdU 또는 CD20 양성 세포가 발견 될 수 있도록하기 위해 얼룩 방법론에 대한 긍정적인 컨트롤의 용도를 제공합니다. 마지막으로,이 예제는 흐름 cytometer를 보정하는 데 사용됩니다. 이 컨트롤 예제는 각각 200 400 2N와 4N 세포를 감지하는 propidium 요오드화물 얼룩 강도를 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 부정과 긍정적인 신호로 그림 1A와 2A에 표시된 중심되도록 또한, BrdU 또는 CD20의 검출 감도를 조정할 수 있습니다. 모든 샘플은 PI - R의 세포와 비슷한 농도있을 때이후 샘플이 실행되면서 Nase 솔루션은 다음 cytometer에 몇 가지 조정이 필요합니다. 이것은 그림에 표시된 이유로 중요합니다. 강력한 G1 축적은 본질적으로 G2 / M. 것으로 잘못 이해할 수있는 하나의 G1 피크를 생성 4B와 5B 대표 실험은 또한 다른 중요한 포인트를 확인하십시오. 첫째, 그들은 BrdU의 이해와 라벨이 세포 유형 간의 다를 수있다는 것을 보여준다. 이런 이유로 그것은 경험적으로 맥박과 적절하게 S - 단계에서 세포를 감지하는 데 필요한 얼룩 조건의 길​​이를 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 적은 24 시간의 문화에서 더블 휴대 타입은 시간에 BrdU로 표시하실 수 있습니다. 느린 성장 세포 유형 항체 얼룩 조건과 기간에 더 이상 펄스 및 변경을 요구할 수 있습니다. 그들이 네 번 한에 대한 항체의 두 표준 농도로 4 시간 스테인드 위해 BrdU와 라벨이 붙지만 같은 MCF10A 전지는이 점에서 훌륭한 예제입니다. 수사이것이 잘못 S - 상 인구 G2 / M 세포의 포함으로 이어질 수도 매우 느리게 성장하는 세포와 라벨링 BrdU 6 시간을 초과하지 않도록주의하여야한다. 둘째, TGF - β1의 기능과 p27KIP1 표현의 효과를 비교에서, 그것은 TGF - β1 신호는 G1의 체포를 유도하면서 p27은 G1 또는 G2 / M 단계 중 하나의 축적을 일으킬 수 분명하다. 이러한 3 H - Thymidine의 설립 및 섬광 계수로 확산을 감지 전통 수단이 가능성을 구별할 수 없습니다. 우리가 다른 프로토콜에서 우리는 큰 untransfected 인구 세포의 하위 인구의 감지를 보여줍니다. 경험적으로 transfected 세포를 검출을위한 가장 적합한 기자를 결정하는 것이 중요합니다. 우리의 경험의 일부 세포 유형의 표현 세포 표면 중 하나는 제대로 마커, 또는 플라즈마 막 제대로 트래픽을, transfected 세포를 감지하지 못할 그 결과 수 없습니다. Likewise, 모든 세포가 GFP의 멤브레인 바운드 양식을 용납하지 않습니다. 가장 적합한 기자의 선택은 transfection의 기자의 효율성뿐만 아니라 untransfected 컨트롤에 비해 표현의 상대적 강도를 평가하여하여야한다. 이상적으로, 이러한 분자의 heterologous 표현이 잘 용납이이 마커는 세포주기 분포에 영향 거의있다는 암시이다 것입니다. 유동세포계측법 접근 방식의 이러한 유형 중 하나는 제한 그들은 서로 비교하여 세포주기의 단계의 상대 abundances을 설정할 수있는 것입니다. 그냥 S - 단계에 상대적으로 이러한 단계를 통해 진행을 느리게하는 경우 그림 3에서 p27의 표현이 진정으로 G1 및 G2 / M에 체포를 유도하거나 경우에 이런 이유로 그것은 모호한 것입니다. 이러한 가능성은 mitotic와 같은 nocodazole 같은 억제제 또는 aphidicolin 같은 G1 / S 억제제와 세포의 병렬 샘플을 처리하여 더 이상 조사 수 있습니다. 이러한 약물은 마님을 만들므로NT의 M - 단계에서 체포 또는 각각 S - 단계 초기는 천천히 proliferating 세포는 약물 유도 체포 지점에 축적됩니다. 제어 세포가 M - 단계 13 축적 반면 때문에 PRB 표현의 G1에 체포 예를 들어 세포는 nocodazole 치료에도 불구하고 G1에 남아있는 것이다. 합쳐 놓으면,이 실험 방법은 포유 동물 세포주기 연구 질문의 다양한 적용할 수있는 유연한 방법을 제공합니다. 그들은 쉽게 세포주기 진행의 변경을 감지하고 제어와 비교하여 차이점을 계량하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 세포 증식의 라벨링 시약 </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 BrdU 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347,580 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 마우스 FITC 항체 복합 </td><td> 벡터 실험실 </td><td> FI - 2000 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 스트레인 필터 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,235 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CD20 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347,673 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 사이클 소프트웨어 </td><td> 피닉스 흐름 시스템 </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

세포 증식의 조절은 다세포 생물의 개발 기간 동안 조직 morphogenesis 데있어서 중심이되는 부분입니다. 또한, 세포 증식의 조절의 손실이 암 같은 질병의 병리를 underlies. 같은 세포 증식을 조사하고 세포주기의 각 단계에서 세포의 비율을 quantitate 수 있도록 큰 필요가있다. 그것은 indistinguishably 큰 인구 내에서 DNA를 복제 아르 세포를 식별하는 데 필수적인 중요성 또한이다. 분아 따위에 의해 번식하는 세포의 결정은 DNA 합성을 시작하고 세포주기의 나머지 부분을 통해 진행하기 전에 바로 G1 단계에서 만들어진 것이므로,이 단계에서 DNA 합성의 감지 세포 배양 성장 조절의 상태를 모호하지 않은 결정을 허용 실험. 세포에서 DNA의 내용은 쉽게 propidium 요오드화물의, 형광 DNA intercalating 염색 물들일 세포의 유동세포계측법에 의해 quantitated 수 있습니다.마찬가지로, 적극적인 DNA 합성은 세포를 수확하고, 산성 불용성 분획에 방사능의 결합을 측정, 방사성 thymidine의 면전에서 culturing 세포에 의해 quantitated 수 있습니다. 우리는 세포주기 분석 상당한 전문 지식을 가지고 다른 접근 방식을 권장합니다. 우리는 bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (BrdU로 간단히 축약) 최근 DNA 합성 이러한 thymine analogs의 결합을 감지 염색법을 사용하여 세포 증식을 조사합니다. 라벨 및 유동세포계측법 1 propidium 요오드화물 및 분석하여 총 DNA의 얼룩과 함께 BrdU와 세포를 얼룩하면 세포주기의 다양한 단계에서 세포의 가장 정확한 측정을 제공합니다. 그것이 propidium 요오드화물의 전체 DNA의 내용과 BrdU의 항체 기반의 얼룩을 통해 적극적인 DNA 합성의 검출을 결합하기 때문에 우리가 선호하는 방법입니다. 이것은 초기 단계에서 S G1에서 세포의 명확한 분리, 또는 늦은 S G2 / M.의 위상을 허용또한,이 방식이 서로 다른 세포주기의 단계를 통해 진행의 규정에 다양한 세포 자극 및 pharmacologic 대리인의 효과를 조사하기 위해 이용하실 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 교양 세포뿐만 아니라 유동세포계측법하여 분석을 라벨과 얼룩에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한이 방법은 성장 등 TGF - β1으로 크린 시토킨에서 억제 신호와 같은 cyclin 의존 키나제 억제제, p27KIP1로 proliferative 억제제의 효과를 측정하는 데 사용할 수있는 방법을 실험 예제를 포함합니다. 우리는 또한 큰 문화의 5 이내 세포의 하위 인구의 세포주기의 위치 분석을 허용 다른 프로토콜을 포함합니다. 이 경우, 우리는 크게 같은 문화에 untransfected 세포 열세에도 retinoblastoma 유전자와 transfected 세포의 세포주기 정지를 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 예제는 DNA의 얼룩 많은 방법을 설명하고유동세포계측법은 활용 및 포유 동물 세포주기 조절의 근본적인 문제를 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

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Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

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59.7K 조회수.  University of Western Ontario. 세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

연구

생물학

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...