이 방법은 세포 주기 의존적 치료 효과에 대한 정보를 제공하고 DNA 손상에 대한 세포 증식과 대처 메커니즘 간의 상호 작용에 대한 심층 연구를 허용하고 심도 있게 연구합니다. 이 방법은 이중 가닥 프랙 인식 및 수리, 세포 주기 효과 및 세포 사멸에 의한 최종 세포 사멸을 포함한 DNA 손상 반응에서 중요한 엔드포인트를 하나의 포괄적인 분석으로 결합합니다. 우리는 임상 종양학에 있는 방사선 화학 요법 처리의 특정 처리 반응 그리고 부작용을 조사하기 위하여 이 기술을 주로 이용했습니다.
분석은 방사선 생물학 및 방사선 요법의 필드에 있는 상관 관계 연구에 아주 유용합니다, 그러나 또한 종양학의 각종 그밖 지역에 적용될 수 있습니다. 표준 세포 수집 절차에 따라 배양으로부터 세포를 수집한 후, PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리한다. 그리고 후드에 고정 솔루션의 두 밀리리터로 세포를 전송합니다.
실온에서 10 분 잠복 후, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 상체를 데칭한다. 세포를 단일 셀 현탁액으로 고정하고 모든 샘플에 대해 고정 시간을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 부착 셀에게 분석을 위해 잘 둥근 세포를 얻기 위해 분리할 충분한 시간을 줍니다.
그런 다음 70 %의 에탄올의 세 밀리리터에서 세포를 두드리고 다시 눌러 펠릿을 풀어 놓습니다. 염색하기 전에 세포를 세척하고, 원심분리에 의해 세포를 퇴적시키고, 두드려 펠릿을 풀어주세요. 그런 다음 세안용 3밀리리터와 1밀리리터의 세척용으로 2회 연속 세척으로 세포를 다시 중단합니다.
각 세척 사이에 상체를 폐기합니다. 마지막 세척 후, 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼 나탄을 흡인하고 관심의 항체 칵테일의 100 마이크로 리터에 윤센트 펠릿을 다시 중단. 실온에서 1 시간 후, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼 나탄을 흡인.
그런 다음, 느슨한 펠릿을 DNA 염색 용액의 100~250 마이크로리터로 재중단하고 35마이크로미터 메쉬 모공 크기로 샘플 튜브의 세포 스트레이너 캡을 통해 세포를 분배한다. 흐름 세포측정에 의해 세포를 분석하려면 사이토미터 창에서 매개 변수 탭을 열고 표에 표시된 대로 매개 변수를 선택합니다. 다음으로 워크시트 창을 열고 표시된 대로 플롯을 만듭니다.
제어 샘플을 사이토미터에 로드하고 실행 버튼을 누릅니다. 브라우저 창에서 첫 번째 튜브를 선택하고 튜브 이름을 클릭합니다. 검사기 창의 파라미터 탭에서 전방 및 측면 분산 및 DAPI에 대한 검출기 전압을 조정합니다.
대기 버튼을 눌러 소프트웨어의 워크시트 설정을 계속합니다. 다각형 게이트 도구를 사용하여 측면 분산 영역 플롯과 전방 분산 영역에서 셀의 모집단을 정의하고 사각형 게이트 도구를 사용하여 DAPI 영역 플롯대 DAPI에서 단일 셀의 모집단을 정의합니다. 제어 G를 눌러 채우기 계층 구조를 표시하고 기본 게이트 이름을 클릭하여 이름을 변경합니다.
그런 다음 모든 히스토그램을 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 컨텍스트 메뉴에서 표시 개체 수와 단일 셀을 선택합니다. 제어 및 처리된 샘플을 획득하여 항체 결합 형광에 대한 검출기 전압을 최적화하여 전체 동적 신호 범위를 커버합니다. 샘플을 측정하려면 사이토미터의 실행 버튼을 누르고 소프트웨어의 획득 대시보드를 사용하여 샘플을 측정합니다.
그런 다음 파일, 내보내기 및 실험을 선택하여 대화 상자에서 디렉터리 내보내기를 선택하여 데이터를 도트 FCS 파일로 저장합니다. 데이터를 평가하려면 도트 FCS 파일을 유량 사이토메트릭 분석 소프트웨어의 샘플 브라우저에 드래그앤드롭합니다. 그리고 다각형 도구를 사용하여 전방 및 측면 분산 영역 플롯에서 셀의 인구를 정의하고 분석에서 이물질을 제외합니다.
DAPI 영역 플롯대 DAPI에서 사각형 도구를 사용하여 단일 셀의 모집단을 정의하고 분석에서 셀 이중 또는 덩어리를 제외합니다. DAPI 영역 히스토그램에서, 비섹터 도구를 사용하여 정상적인 DNA 함량을 저하된 DNA를 가진 세포로부터 정상적인 DNA 함량을 구별한다. 공구 생물학 및 세포 주기를 선택하여 세포 주기 모델링 도구를 열고 딘 제트 폭스를 선택하여 G 1 S 및 G 2M 단계에서 세포의 주파수를 추정합니다.
세포 주기 집단의 DAPI 영역 플롯 대 DAPI와 함께 DAPI에서 G 1 S 및 G 2 및 M 상 게이트를 생성하여 세포 주기 특정 감마 H 2 A X 측정을 가능하게 한다. 이중 섹터 도구를 사용하여 세포 주기 집단의 Alexa 555 영역 히스토그램에서 인포히스톤 H 3개의 양성 및 음수 세포를 구별하고 단일 세포의 개체수의 알렉사 647 영역 히스토그램에서 CAS 베이스 3개의 양성 및 음수 세포를 구별한다. 컨트롤 T를 눌러 테이블 편집기를 열고 표시된 대로 테이블을 구성합니다.
그런 다음 파일을 선택하여 메뉴 리본의 출력 섹션에서 형식과 대상을 설정하고 데이터를 스프레드 시트로 내보냅니다. 탄소 이온은 교모세포종 세포에서 더 높은 감마 H 2 AX 피크 수준을 유도하여 더 느리게 감소하고 동일한 물리적 용량에서 광자 방사선에 비해 24~48시간 동안 현저하게 상승합니다. 탄소 이온과 광자 방사선 모두에 대해, 감마 H 2 AX 수준은 DNA 이중 가닥 파손 복구가 세포 주기에서 이 단계에서 결합하는 비균성 종말의 통로로 제한되기 때문에 G 1상 세포에서 가장 높았다.
더 높은 이중 가닥 파손 유도 속도와 느린 수리 운동에 따라, 탄소 이온은 G 2 상에서 더 강하고 오래 지속되는 세포 주기 체포와 광자보다 더 높은 세포 주기 체포를 유도합니다. 치료 효과의 강도에 따라, 다른 세포 주기 단계의 해상도 어려울 수 있습니다. 일부 세포주에서, DAPI 농도는 세포 주기 단면도의 질에 큰 영향을 미치고 조정될 필요가 있습니다.
슬라이드는 혈류 세포측정 후 나머지 샘플로부터 제조하여 감마 H 2 AX 포시의 개수, 크기 및 모양을 평가하고 초점과 파핵 감마 H 2 AX 염색을 구별할 수 있다. 우리의 방법을 사용하여, 우리는 중간엽 줄기 세포가 이온화 방사선 및 투포아소머제 억제에 상대적으로 저항하지만 교묘한에 민감하다는 것을 보여줄 수 있었습니다. PFA 연기가 독성이기 때문에 고정 솔루션을 준비할 때와 고정 단계에서 항상 연기 후드를 사용하십시오.
또한 DAPI를 취급할 때 장갑을 착용해야 합니다.
