We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

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	<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoding+in+Bacteriophages.">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities.">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community.">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes.">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li><li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa.">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li><li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes.">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li><li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The bacteriophages. , (2006).</li><li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences.">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li><li>Klenk, H. -. P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules.">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li><li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses.">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li><li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+ecosystems:+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus.">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741 (2003).</li><li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+S-PM2,+a+&#8220;photosynthetic&#8221;+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains.">The genome of S-PM2, a &#8220;photosynthetic&#8221; T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li><li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses.">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li><li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains.">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li><li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes:+signature+features+and+ecological+interpretations.">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).</li><li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages.">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li><li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40:+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage.">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li><li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism.">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li><li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution.">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li><li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins.">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+for+Enterobacteria.">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+expression+of+the+P(BAD)+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter.">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li><li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles.">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van&#8217;t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TagCleaner:+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets.">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288 (2011).</li><li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli.">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002 (2009).</li><li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+for+plant+metabolomics:+reporting+MSI-compliant+studies.">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li><li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+viruses+exploit+their+host&#8217;s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation.">Marine viruses exploit their host&#8217;s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li><li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules.">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li><li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid.">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li><li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism.">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype.">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기서는 추정 파아지 유전자의 기능적 특성화 노믹 방법을 제시한다. 기술 모니터링 호스트 동화 대사 능력 개발 분석을 포함 멀티 표현형 분석 플레이트 (매핑)하여, 이화 대사에 대한 효과를 측정 할 수있는 대사 체학의 확립 된 방법에 추가하여. 우리는 높은 처리량 처리 및 분석 24 있도록 이러한 기술에 의한 대용량 데이터 세트를 관리하기위한 추가 툴을 제공 하였다. 마지막으로, 주석 파지 캡시드 단백질, 파지 티 오레 독신,이 추정 대사 파지 유전자, 평균 실험 응답의 비교를 통해 우리는 표현형 동향 및 아웃 라이어의 식별의 확인에 중점을두고, 데이터 세트 및 유전자 클래스 모두를 해석하는 다양한 전략을 제안한다. 언급 한 바와 같이, 두 접근 정량적 호스트 대사의 절반만을 측정한다. 임의의 상대 기능을 해석 할조사에서 새로운 단백질, 두 방법 모두에서 데이터 기능의 증거를 제공해야합니다. 이것이 우리의 현재 원고의 초점은 아니지만, 각 노믹 방법의 데이터 출력은 랜덤 숲과 주성분 분석과 같은 클러스터링 기술에 초점을 조합 적 분석을 통해 배치됩니다. 또한, 결합 분석에 의한 가설은 이후 기존의 유전 적 방법에 의해 검증되어야합니다. 마지막으로, 방법은 주로 박테리아의 생리학에 영향을 따라서 동일한 표준을 따르고 제시된다. 어느 방법을 착수 할 때, 고려되는 실험 독립 클론 집단을 보장하기 위해 필요; 오염이 방지된다; 하나의 변수는 테스트되고; 적절한 컨트롤을 동시에 실행되고있다. 이러한 점을 고려하지 않으면 어떤 생리 학적 분석과 유사 불분명 결과가 발생합니다. 멀티 표현형 분석 플레이트(MAP에) 맵의 개발은 높은 처리량과 현재 이용 가능한 기술 (도 5a 및 표 1,2)와 비교 분석 적응을 제공한다. 분석은 모든 미생물 실험실에서 사용할 수 공급, 장비, 기본 기술을 사용합니다. 이후의 데이터 처리 및 분석을위한 연산 파이프 라인의 혼입, PMAnalyzer 24 빠른 데이터 해석을 보장한다. 또한, 접근법 모두 실험 및 분석 양태 용이 조정될 수 또는 사용자 정의 목적 동조. 데이터의 많은 부분은 제 4 절에서 설명 된 필터를 통과하지 못하는 경우, 예를 들어, 하나의 수동으로 문제를 식별하기 위해 성장 곡선을 통해 가려 낼 수있다. 문제가 엄격한 필터 파라미터들로 인해 발생하는 경우, 스크립트에 대한 조정이 이루어질 수있다. 또한, 문제가 실험 과정과 관련된 경우 (즉, 연장 응축, 부적절한 세균 CEL의 전송LS는 등) 추가적인 복제 쉽게 반복 될 수있다. 쿠에바스 등. 24에서 설명한 바와 같이, PMAnalyzer 응집력, 자동화 된 파이프 라인과 구문 분석 및 분석 스크립트를 실행하는 래퍼 스크립트로 작성된 하나의 bash는 프로그램입니다. 모든 스크립트 중으로 데이터 사이를 각 시점에 대해 중간 값을 취함으로써 25 자식 저장소로부터 자유롭게 액세스 할 수 있으며 계속해서 지연 시간을 획득하기 위해 로지스틱 곡선, 최대 성장 속도, 점근선과 신규 용어 성장 수준을 매개 변수화. 중앙값은 큰 이상치의 효과를 감소시키는 연구에서는 평균 걸쳐 선택되었다 그러나, 스크립트는 용이하게 복제 된 데이터의 평균을 계산하도록 구성 될 수있다. 감소 변화 복제 데이터 (그림 2A)에 걸쳐 본 (SE)으로 인해 우리는 물류 곡선 피팅에 대한 PMAnalyzer의 중간의 사용을 유지했다. 또한, 본 연구에서 성장을 차단 (GL ≥ 0.4) DETE했다데이터 성장 레벨과 최대 증가율에 걸쳐 분리 방법과 비교하여 rmined (도 1A, B). 이의 재정을 필요로하는이 용어가 다를 수 있습니다 사용되는 장비 및 모델 시스템에 따라 값을 잘라. 우리의 분석의 가장 큰 장점은 우리가 성장 레벨 (GL)로 정의하는 전체 미생물의 성장을 특징 짓는 하나의 매개 변수를 사용하여 표현형을 비교하는 기능입니다. GL은 조화 평균, 따라서 데이터에 큰 이상 값의 영향을 완화시킨다. 이동 물류-장착 값을 조화 평균의 사용은 성장의 요약은 시행 착오를 통해에 도착했다 제공합니다. 다른 방법은 성장이 포함 차별화를 시도 : 그것은 걸린 시간은 특정 곡선 파라미터 (반 μ 최대, μ 최대 및 운반 능력), 결정 (R 2)의 계수, 특정 곡선의 매개 변수를 곱한 R 2의 조합에 도달 할 수 있습니다. 시프트와 조화 평균을 이용하여GL에 대한 물류 맞는 값은 따라서 선택의 방법이되었다, 성장을 평가하는 가장 큰 범위를 제공했다. 주목해야 할 한가지 고려 사항은 동적 성장 곡선 패턴이 단일 파라미터 또는 피팅 모델을 사용할 때 손실 될 가능성이 있다는 것이다. 예를 들어, 로지스틱 곡선 GL의 개별 곡선 파라미터 이상성 성장을 나타내는 능력이있다. 하나의 탄소 환경에서 성장이 효과는 기판 사용으로 기판 또는 변화 중 하나 변환에 바이러스 성 단백질의 중재를 의미한다. 여러 성장 매개 변수를 고려하지 않을 경우 잠재적 손실 추가 효과는 다음과 같습니다 연장 지연 시간, 바이러스 성 기계 또는 제품의 증가 부담을 제안을; 빠르게 에너지 생산 경로를 호스트하기 위해 결합 된 바이러스 성 단백질을 제안, 지수 상을 가속; 호스트 영양소 흡수 및 동화에 바이러스 지원 암시 매스 형성하거나 더 높은 수준 (데이터는 미도시). 따라서, (초기 성장 곡선을 그리는 <stGL은 클론의 전반적인 성공을 표현하는 하나의 양적 번호를 제공, 계정에 물류 모델의 주요 변수를 취 반면 룽&gt; 그림 2A, B)는 시간이 지남에 동향에 관한 정보를 제공합니다. 지도의 구조적 및 대사 유전자 기부 상이한 반응을 고려할 때, 해당 다른 기판 클래스 단백질 기능에 대한 증거를 제공 큰 것으로 관찰된다. 예를 들어, 대사 단백질은 종종 중앙 대사 16, 32를 호스팅하는 불특정 있습니다 제한 영양소의 획득과 연결되어 있습니다. 예비 실험은 MAP 중앙 대사 탄소원 (도 2a) 상에 성장 될 때, 추정 대사 파아지 유전자 형질 클론 증가 유도기이 있는지 알 수있다. 반대로, 호스트 에너지와의 dNTP 풀의 큰 비율을 필요로 추정 구조 유전자를 운반하는 클론, %의 성장에 거짓 긍정적 인 반응을 초래할RAL 아미노산 대사 탄소 기질. (미도도 2A 및 데이터) 현미경을 통해 관찰이 때문에 호스트 filamentation 및 / 또는 봉입체 결과 불용성 단백질의 축적 가능성이 높다. 추가 분석은 이러한 예비 결과를 검증 할 필요가 있지만, 맵은 특정 파아지 유전자 클래스의 함수를 가정하는 상관 표현형 반응을 입수 할 수있다. 미지의 바이러스 단백질의 해명 외에지도 개별 세균의 대사 작용과 다양성 또는 박테리아의 커뮤니티를 조사하는 신규 한 자원이다. MAP 성분은 세균의 범위의 성장을 지원하기 위해 설계 쉽게 변경되며 해양, 영양 요, 혐기성 미생물을 포함. 다른 속 세균은 맵에서 지원 될 수 있기 전에 사전 정의 된 기저 성장 매체가 추가 또는 조정 된 화학 종을 필요 이러한 노력을 용이.MAP에 이러한 사용 중 하나는 주 트립 톤, 효모 추출물 및 펩톤 등 성분의 사용을 금지하고, 정의 된 미디어를 유지하는 것이다. 대사 체학 대사 체학 분야는 질량 분석에 의해 확인 된 고립 된 대사 산물을 포함 대사 데이터베이스에 따라 달라집니다. 여기에 선택 핵심 시설은 가장 큰 대사 체학 데이터베이스 중 하나가 있습니다. 다른 사람이 전에 우리의 호스트에 기록 된 적이 없었다 동안 흥미롭게도, 우리의 실험과에서 발생하는 대사의 절반 이상이 (~ 65 %)을 식별 할 수없는했다, 대장균은 (예는 다음과 같습니다 인돌 3 아세트산 (33), 살리실산 (34), 및 디 히드로 산 35). 이 사실은 식물 대사 산물, 또는 조사 대상인 특정 단백질 데이터베이스를 향해 강한 바이어스 중 하나에 기인 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 그 결과 데이터 표시 및 분석을 위해 사용 가능한 공지 대사 산물의 한정된 수이다. 푸에진짜야는 다양한 데이터베이스를 사용하여 여러 대사 체학 방법은 더 큰 대사 범위를 허용한다. 현재, 모두 알려진 비교하고 우리의 새로운 바이러스 성 단백질을 대조 할 때 알 수없는 대사가 사용된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 기능적으로 유사한 단백질을 형질 클론들이 완전한 대사 체 프로파일 증가 유사성을 공유한다는 가설. 예비 대사 체학 분석은 구조 및 신진 대사에 영향을 미치는 유전자를 명확하게 서로 분리되지 않는 동안 (그림 6)의 상관 관계 않는 과발현 때, 그 유전자가 호스트에 비슷한 효과를 보이는 것으로 나타났다. 예를 들어, 밀접하게 추정 대사 유전자 주석 캡시드 유전자 클러스터는이 연구, EDT2440 및 EDT2441 강조. 공개 트랜스 토폴로지 및 신호 펩티드 예측 프로그램을 이용하여 조사 모두 추정 대사 유전자가 단일 막 횡단 도메인 항구 증거를 보였다. 흥미롭게도 5 일 중(대부분 Dendrogram이 부분을 좌) 첫 번째 클러스터 그룹 E 9 클론 같은 토폴로지 프로그램을 사용하여 경막 도메인을 예측 하였다. 또한, 조사가 필요하다, 그러나, 이들 클론의 과발현시 본 대사 물질 또는 막 구조의 부담으로 인한 세포 스트레스 반응과 관련된 것으로 보인다. 이러한 증거는 대사 체학 데이터 잡음 증가량을 보유하면서,이 방법은 유전자 내 및 클래스 걸쳐 두 유전자의 일반적인 효과를 구별 신호를 강조 할 수있는 것을 지원한다. 이 방법은 유전자 기능의 특정 정보를 추출 할 수 있는지 여부를 확인하려면, 대사 산물 특정 대사 경로로 분류되었다. 클론은 단일 통로 특정 대사에 영향을 미치는 경우 가설 존재는, 그 후에 과잉 발현 유전자는 그 경로에서 활성화된다. 우리 대사 체학 품질 보증 파이프 라인의 설립 이전에, 예비 데이터는 위에 밝혀소수 D 대사 산물들은와 연관된 경로에 적은 정보를 제공하는, 일반적으로 &quot;알&quot;이었다 (데이터는 보이지 않음). 대사 체학 전처리 된 데이터는, 그러나, 대사 산물 프로파일의 대부분이 유사하고 단지 알려지지 공지 대사 존재비의 선택 수가 인스턴스 퓨 트레 및 우라실 (도 6)의 경우, 클론 걸쳐 달라질 것으로 나타났다. 단백질 기능 노력의 높은 해상도를 제공하기 위해 실험적으로 기능적 특성을 기초 대사의 &quot;구멍&quot;을 작성하는 데 사용될 수 공지 파지 유전자에 대해 신규 파아지 유전자를 비교하도록 이루어지고있다. 이 기술을 사용하여, 공지의 바이러스 유전자의 할당 기능 미지 유전자의 기능에 대한 기준을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 대사 체의 분석 제한 요인은 데이터베이스의 크기와 관련이있다. 이 연구에 논리적 인 사람이어야 메타 볼로 데이터베이스가 개발 될 필요가 이러한 제한, 수정하기 위해; 이러한E.의 아스카의 컬렉션에 특정 대사 산물의 데이터베이스와 자신의 존재비 등 콜라이 클론 된 단일 ORF 36 과발현된다. Lawerence 버클리 국립 연구소의 연구원이 모델 박테리아 (37)의 전체 돌연변이 라이브러리에 특정 대사 산물의 최초의 종합 데이터베이스를 컴파일 할 때 이러한 데이터베이스의 필요성에 대한 증거는 2013 년에 제공되었다. 이 연구는 표현형과 유전자형 사이의 명확한 연결을 공개, 특정 대사 산물의 이용에 필요한 유전자에 새로운 통찰력을 제공했다. 공구로 대사 체학을 고려하면, 처리 정권 코어 시설에서 뒤에 정의하는 것이 중요하다. 대부분의 실험 절차의 유물은 사용의 악기와 관련된 일상의 변화이다. 지금까지 모든 GC-MS 분석은 각각의 실행을 분석에 포함되는 내부 표준을 사용하는 구현; 그러나, 프로젝트 별 내부 샘플 또한 &lt;/ EM은&gt; 실험 매일 추가 분산을 제거 달렸다. 이러한 고려 사항은 정상화 문제와 편견을 피하기 위해 조기 해결해야합니다. 또 다른 해결책은 동일한 시스템의 핵심 시설에서 단일 배치, 어떤 핵심 시설에서 사용할 수있는 옵션으로 모든 샘플을 처리하는 것입니다. 다양한 도구를 모두 도입 소설은 화면과 기능적으로 미지의 파지 유전자의 특성을 의미한다 제공이 원고에 다시는-탐구. 연산 파이프 라인의 유선형 사용하여 실험 기술의 단순성과 적응성이 방법은 연구 노력과 필드의 넓은 범위에 적용 할 수있는 보장합니다. 우리의 목표는 여기에 제시된 노믹 방법이 동일하게 기능적으로 정의하는 시스템뿐만 아니라 새로운 파지 단백질의 추가 조사를 도울 것입니다.

(박테리오파지 또는 파지 일명) 박테리아를 감염시키는 바이러스는 환경 1,2 세계적 입자와 같은 10 개 이상의 31 바이러스 (VLP를)에 존재하는 다른 모든 생물을 능가 할 것으로 추정된다. 해양 환경과 관련된 바이러스 성 지역 사회를 조사하는 첫 번째 metagenomic 연구는 바이러스 성 분수 3에서 볼 수있는 다양성을 정량화에 초점을 맞추었다. 또한, Breitbart 연구진은 바이러스 성 사회 서열의 65 % 이상이 공공 데이터베이스에서 사용할 수있는 시퀀스에 더 동성을 공유 없다는 것을 발견했다. 이후 metagenomic 연구는 유사한 증거를 발견 : 샌디에고 해양 퇴적물에서 metagenomes, 캘리포니아 75 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 (4)를 포함; Salton의 바다의 hypersaline 호수에서 metagenomes 98 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 (5)를 포함; 98 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 6 - 산호 관련 metagenomes 95이 포함되어 있습니다. 주석이 달려 있지 않은 정보의이 축적 가져왔다7 &quot;생물학적 우주의 암흑 물질&quot;인 파지의 유전 물질. 파지의 게놈 특성은 기존의 핵산 및 단백질 데이터베이스에 대해 비교를 통해 서열의 유사성을 식별에 의존하고있다. 파지 인코딩 된 유전 정보는 주로 알 수 없기 때문에, 상 동성 기반의 방법은 효과가 있습니다. 전사 및 복제 유전자, 대사 유전자 및 구조 유전자 그들의 게놈 내에서, 일반적으로는 파지를 세 가지 종류의 유전자를 인코딩한다. 전사 및 복제 유전자 (클래스 I / II 유전자 8) 중합 효소, primases, 엔도 / 엑소 뉴 클레아 제, 및 키나아제를 포함한다. 이 유전자는 매우 전사와 파지의 유전 물질을 복제, 파지 감염의 중요성으로 인해 보존된다. 파아지 중합 효소 용이 인해 전역 보존 9에 서열 상 동성 전통적인 방법을 이용하여 식별되고 효과적인 계통 마커 (10)를 제공하는 것으로 나타났다.반면, 파지 대사 및 구조 유전자 (클래스 II / III 유전자를 8) 점점 발산 종종 가상의 유전자로 주석이 있습니다. 파지 대사 유전자는 숙주의 대사 능력에 영향을 미칠 필요는 바이러스 복제를 위해 요구되지 않는다. 종종 보조 대사 유전자 11 (AMGs) 함이 유전자는, 호스트 신진 대사를 조절하고 감염과 비리 성숙의 성공의 최적의 진행을 할 수 있도록 나타납니다. AMGs은 제한 영양소 나 에너지 생산 경로의 활용 및 흡수와 관련이있다. 몇 가지 예는 광계의 다양한 cyanophage 12-16의 게놈에있는 유전자, 유전자에 연결 인산 대사 17, 18, ​​및 파지의 dNTP 생합성 (18, 19)에 대한 탄당 인산 경로의 활용에 의해 규제를 포함한다. 비교, 구조 유전자는 감염 동안 생산 늦게 유전자 중반 사이에있는 다른 파지 호에 걸쳐 다양세인트 시스템. 구조 단백질의 생산은 전사, 번역, 조립 8 바이러스의 dNTP의 가용성 및 에너지 저장고에 의존한다. 캡시드 테일 섬유 구조 단백질은 모든 바이러스 성 단백질을 코딩하는 유전자의 대부분의 발산으로 간주되며 성공적인 비리 온 생산을 위해 필요하다. 이들의 차이는 일반적으로 그들은 바이러스 호스트 공진화 (20)을 형성에서 재생 적극적인 역할에 기인한다. 전통적인 상동 서열 정렬 기술을 이용하여 단백질을 발산 할 때, 상관없이 유전자 클래스의 용이 간과된다. 엄격한 서열 비교하여 볼 한계를 보정하기위한 노력은 인공 신경망 (21) 등의 관계를 결정하기 위해 시퀀스의 특성을 이용할 수있는 바이오 인포 매틱스 도구를 가져왔다. 인공 신경망 (앤스) 구조적 및 대사 유전자의 예측이 가능하지만, 직접 특성화 하류 실험 검증을 필요유전자 기능. 이 원고의 목적은 신규 한 파아지 유전자의 발현시에 숙주 세균의 양 이화 및 동화 대사를 모니터링 할 노믹 프로토콜을 제공하는 기능적 앤스 통해 예측. phenomics의 필드, 세포 표현형과 관련된 생물학은 잘 알 수 없거나다면 발현 성 기능을 가진 단백질의 조사에 도움을 시스템 생물학에 설립된다. 노믹 도구는 유전자형 정보 표현형 정보를 연결하는 데 사용됩니다. 우리는 자신의 기능 (들)가 파아지 유전자 발현시 관찰 호스트 생리적 효과를 통해 결정될 수있다 추정 파아지 유전자 가설. 이 가설을 조사하기 위해, 두 정량적 방법이 선택되었다. 대사 체학은 특정 싸다 성장하는 동안 호스트 대사 산물의 다양성과 상대적 풍요를 측정하는 동안 멀티 표현형 분석 플레이트 (지도) 호스트 기판 활용 및 후속 바이오 매스 형성을 모니터링하는 데 사용되었다정신 상태. 추정 구조 및 신진 대사에 영향을 미치는 단백질을 대장균에서 과발현 된 두 실험에서 대표적인 결과를 비교. 수많은 영상 기술과 높은 처리량 처리 파이프 라인은 실험 복제를 용이하게하기 위해 제공됩니다. 마지막으로, 제시된 방법의 재현성 및 정확성 주석 캡시드 단백질 및 파지 단백질 대사, 티 오레 독신, 플러스 두 추정 AMGs 예상 생리 효과의 맥락에서 논의되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

파지 - 호스트 상호 작용에 현재 조사 (메타) 게놈에서 지식을 외삽에 따라 달라집니다. 흥미롭게도, 60 - 모든 파지 시퀀스의 95 %는 현재 주석 단백질에는 동성을 공유하지 않습니다. 결과적으로, 파아지 유전자의 많은 부분은 가정으로 주석된다. 이 현실은 크게 두 구조 및 보조 대사 유전자의 주석에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 이러한 알 수없는 파지 유전자 중 하나의 표현 동안 선택된 호스트의 생리적 반응 (들)을 캡처하도록 설계 노믹 방법을 제시한다. 대사 체학은 대사 풍부한 다양성을 모니터링함으로써 양방향 생성물 분석을 제공하면서 멀티 표현형 분석 플레이트 (맵), 숙주 기질 활용 및 후속 매스 형성의 다양성을 모니터링하는 데 사용된다. 두 도구 단일 파아지 추정되는 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 발현과 연관된 표현형 프로파일을 제공하기 위해 동시에 사용된다. 두 가지 방법에 대한 대표적인 결과는 highl 비교추정 구조 또는 대사 파아지 유전자를 운반하는 호스트의 표현형 프로파일 차이 ighting입니다. 또한, 실험 분석을 용이하게 시각화 기술과 높은 처리량 계산 파이프 라인이되게됩니다.

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Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K 조회수.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

앞으로 유전 접근<em&gt; 클라미디아의 trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.