우리는 마이클 Feiss과 파지 생성 및 정화에 안내를위한 장 Sippy에 감사하고 있습니다. 우리는 세포 인식 소프트웨어, Schnitzcell를 제공하기 위해 마이클 Elowitz 감사드립니다. , 웰치 재단 (기금 Q-1759)과 인간 프론티어 과학 : 골딩 연구실에서 작품은 국립 보건원 (R01GM082837), 국립 과학 재단 (살아있는 세포의 물리 센터 082,265, PFC)의 보조금에 의해 지원됩니다 프로그램 (RGY 2,008분의 70).

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

박테리아 변종, 파지 및 Plasmids : 스트레인 LE392은 supF입니다. 그것은 (자세한 내용은 표 1 참조) 파지의 게놈에 Sam7 돌연변이를 억제하기 위해 선정되었습니다. 따라서, 유도 lysogens 결국 lyse과 파지 입자를 공개, lytic 경로를 선택으로 의지 감염된 세포합니다. Lysogenic 세포가 30에서 재배 ° C 파지의 게놈에서 857 allele CI 민감한 온도의 존재로 인해. 열 유도 후, gpD - EYFP과 야생 유형 gpD는 λ LZ1의 게놈과 플라스미드 pPlate * D 각각에서 공동으로 표현됩니다. 그 결과, 새로 만든 파지 λ LZ2의 capsid는 gpD - EYFP 및 gpD 단백질의 혼합물이 포함되어 있습니다. 이 모자이크 파지는 개별 phages 5 감지를 허용 구조적으로 안정적이고 충분히 형광입니다. PP RE - mCherry는 lysogenic pathwa의 선택을 검색하는 데 사용 플라스미드 기자입니다Y. 발기인 P의 RE는 lysogeny 1,11의 설립시 CII에 의해 활성화됩니다. PP RE - mCherry 5 mCherry 12 GFP를 교체하여 PE-GFP 11에서 파생되었다. 자세한 내용은 이전 작품 5를 참조하십시오. 성장 조건 매개 변수 : lysogen 유도 동안 (제 1), 180 rpm에서의 가벼운 흔들림은 좋은 바이러스 수율이 13을 제공합니다. 포도당 신진 대사로 피해야한다 성장 매체에 포도당의 이용은 산성 신진 대사 제품을 생성하고, 성숙 람다 입자는 산성 pH의 13 살 불안정합니다. MgSO 4의 추가는 파지 capsid 3 안정화 목적으로합니다. 야생 유형 CI를 (대신 CI 857의) 수행 phages를 들어, lysogen은 DNA-손상 에이전트 미토 마이신 C 3을 사용 유도 할 수 있습니다. 단계 1.3에서, 37의 부화는 ° C는 일반적으로 90 분 초과 할 수 없습니다. 이 usef입니다<html> 매 30 분 OD 600까지 셀 밀도를 확인 UL. 좋은 lysate를 들어, OD 600 주변에 0.2 이하로 들어가게되고, 나머지 OD 600 세포 파편의 결과입니다. 새로 만든 파지는 세포 파편에 자신의 DNA를 삽입하기 시작 수 있으므로 너무 오래 잠복기는 낮은 파지 수율 될 수 있습니다. 단계 2.11과 2.13에 보이는 파지 밴드를 (적어도 1 개 10 11 파지 입자)을 획득하려면, 단계 1.2에서 적어도 500 ML 문화를 성장. 단계 5.1 및 5.2의 성장 매체에 0.2 % 말토오스의 추가는 양고기, 파지 람다 흡착 3,14에 대한 수용체의 표현을 유도 목적으로합니다. mCherry - 대신 단계 5.2의 100 배의 1,000 배 희석은 기자 플라스미드 PP의 RE에서 mCherry 배경 수준을 감소 목적으로합니다. 35를 실행 파지의 DNA 주입을위한 단계 5.5 ° C는 온도에 민감한 cI857 allele의 유도를 방지하기 위해 선택됩니다. 파지 정화 : jove_content &quot;&gt; 파지 정화 단계 (2.11 단계 2.1) 기타 정화 프로토콜 5 대체하지만, CsCl 평형 기울기 (단계 2.12 및 2.13)을 통해 최종 ultracentrifugation은 피할 수 있습니다. 스윙 버킷 로터는 단계 2.10과 2.12에 필요합니다 순수한 파지 주식을 취득하는 것은 쉽게 주일까지 소요될 수 있습니다. 날카로운 눈에 보이는 파지 밴드를 보장하기 때문에 확실히 아무 중간 단계에서 잘못하지 못하게 길을 따라 파지의 titer를 확인 할 필요가 있습니다. 파지 처리 : 제 2의 모든 정화 절차 동안, 그것은 파지는 파지 헤드에서 파지의 꼬리를 전단 않도록 부드럽게 lys​​ate 처리하는 것이 중요합니다. 제 5 (예를 들어, 5.7을 통해 5.5 단계)의 세포 감염 동안, 그것은 또한 감염된 세포에서 파지 입자의 전단을 방지하는 것이 중요합니다. 파지는 그 DNA를 주입 한 후 감염된 세포에서 끊어 경우, 결과는 &quot;어둠&quot;의 감염입니다 참고로 즉fection의 결과는 실험에서 관찰하지만 감염 파지는 안 될 것입니다. phages 또는 파지 / 세포 혼합물을 처리 할 때마다 이러한 문제를 최소화하기 위해, 우리는 다양한 피펫 팁을 사용합니다. DAPI 테스트 : DAPI (제 4 항)과 파지 주식을 염색하면 파지 주식의 순도를 확인하기 위해 신속하고 효율적인 방법입니다. 또한 시간이 지남에 따라 기존 파지 주식의 가능한 저하를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 순수한 주식은 형광 현미경으로 YFP와 DAPI 신호의 공동 지방화 가까운 100 %이어야합니다. 우리는 일반적으로 YFP 명소의 1 % 미만이 입자가 성공적으로 바이러스 DNA를 포장하지 못했음을 나타냅니다하거나 이미 다른 곳에서 자신의 DNA를 주입 한 DAPI을 (바이러스 성 게놈없이 capsids을 대표하는) 포함하지 않는 것이 관찰합니다. DAPI 명소의 1 % 미만이 YFP를 (비 형광 phages에 해당)를 포함하지 않습니다. 이 경우가 아닌 경우, O에서 반복 할 필요가 2.14으로 2.12 단계를다시 정화 rder. 더 장기적으로 라이브 셀 이미징 여기 필요하지 않습니다 때문에 이미지 매개 변수로 돌아가서 단계 4.3 현미경 설정은 섹션 5에서처럼 중요하지 않습니다. 바라던 하나의 파지 입자의 형광 강도를 조정하는 경우 5 항에서와 같은 현미경 설정을 유지하는 데 유용합니다. PBS-아가로 오스 판은 매우 깨끗하고, 또는 DAPI 염색을 사용 너무 많이없는 경우, 파지의 DNA에 해당하는 일부 DAPI 장소는 &quot;후광&quot;로 둘러싸여 될 수 있습니다. 너무 작은 DAPI의 염료를 사용하는 경우, DAPI 채널의 신호는 매우 약한 수 있습니다. 현미경 시스템 : 제 6의 이미지를 들어, 우리는 100x 목표 (계획 Fluo, 수치 공 1.40, 기름 침수 세례) 및 표준 필터 세트 (니콘)와 상업 역 epifluorescence 현미경 (이클립스 TE2000-E, 니콘)을 사용합니다. 형광 광원은 빛 강도 ​​제어 아크 램프입니다. x, y 및 z PO : 다음 기능은 컴퓨터 제어sition, 시야 및 형광 셔터, 그리고 형광 필터 선택하실 수 있습니다. 자동 초점 기능이 필요합니다. 그렇지 않으면, 초점은 쉽게 시간 경과 동영상 (일반적으로 4시간 길이) 동안 멀어지기 수 있습니다. 이 병렬에서 여러 감염 이벤트를 수행 할 수 있습니다 각 시점에서 (X, Y) 여러 위치를 취득 할 수있는 기능은 유용합니다. 우리는 일반적으로 100 감염 이벤트까지 따라 각 영화 8 단계 위치를 취득. 우리가 사용하는 카메라는 16 비트 (Cascade512, Photometrics)의 동적 범위 16x16 규격 μm 픽셀 카메라와 냉각 512x512 CCD입니다. 인수는 MetaMorph 소프트웨어 (분자 장치)를 사용하여 수행됩니다. 현미경은 온도 조절 객실에 배치해야한다 또는 현미경 단계는 온도 조절 챔버로 둘러싸인해야합니다. 이미지 수집 : 라이브 셀 이미징를 들어, 표백하고 검사하고 사진을로 이어질 수 샘플의 불필요한 노출을 방지하기 위해 중요합니다totoxicity. 따라서 먼저 표백 과도하거나 억제 세포의 성장으로 이어지는되지 않고 형광 검출이 가능 최적의 빛 노출을 찾기 위해 시스템을 특징하는 것이 가장 좋습니다. 좋은 형광 이미지를 얻으려면 흥미 진진한 광도, 노출 시간 및 카메라 게인을 재생합니다. 단계 6.2-6.3에서 10 분 프레임 간격은 빛 노출을 최소화하기위한 목적으로 선택됩니다. 각 프레임에서 단지 하나의 포커스에 이미지가 위상 대비 (셀 인식) 및 형광 채널 (세포의 운명을 결정하는)에 필요합니다. 제 1 시점에서 YFP 채널을 통해하지만, 여러 Z-위치 이미지는 세포 표면에있는 모든 감염 phages를 캡처 할 필요가 있습니다. 초기 프레임에 YFP 노출 시간도 나중에 프레임에서 시간 경과 영화에 사용보다 더해야 할 수 있습니다. 이미지 분석 : 매우 신중하게 단계 7.1에서 세포 표면 주위에 파지 입자를 계산합니다. 으로상술 한 바와 같이, 우리는 단계 6.2에서 YFP 채널을 통해 Z-스택 일련의를. 그러나이 아직 계산을 도전 일부 형광 파지 입자 밖에서 초점을 남길 수 있습니다. 초기 시간 프레임에서 셀의 길이는 Metamorph 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다. 셀의 길이는 ImageJ 또는 다른 소프트웨어 도구에 의해 측정 할 수 있습니다. 또한, 자동화 된 집 지어 MATLAB 프로그램은 세포 lineages 따라 시간이 지남에 형광 변화 등의 정보를 얻어 매우 유용 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 피셔 과학 </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 피셔 과학 </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM 버퍼 </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 시그마 </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> 투석 카세트 </td><td> 열 과학 </td><td> 66,333 </td></tr><tr><td> 현미경 슬라이드 </td><td> 코닝 </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti 초 투명 관 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti 초 투명 관 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti 회 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti 회 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> 굴절계 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifluorescence 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 TE2000-E </td></tr></tbody></table> 표 2. 시약 및 장비.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

박테리오파지 (파지) 람다와 박테리아 E.를 포함하는 시스템 대장균은 오래 세포의 운명 결정 1,2의 패러다임을 역임했다. phages의 숫자로 셀의 동시 감염에 이어 두 경로 중 하나가 선택되어 lytic (악성) 또는 lysogenic (휴지) 3,4. 우리는 최근 휘황 개인 phages 라벨을위한 방법을 개발, 개인 phages와 셀 (5)의 수준에서 현미경으로 실시간으로 후 감염 결정을 검토 할 수 있었다. 여기, 우리는 이전 일 5에 설명 된 감염 실험을 수행하기위한 전체 절차를 설명합니다. 이 형광 phages의 창조, 세포의 감염, 현미경 이미징 및 데이터 분석을 포함하고 있습니다. 형광 파지는 capsid gpD 단백질의 &quot;하이브리드&quot;공동 표현 야생 유형과 YFP 퓨전 버전입니다. 원유 파지의 lysate 먼저 gpD-EYFP (Enh의 lysogen을 유도함으로써 얻을 수 있습니다플라스미드 표현 야생 유형 gpD을 품고, 옐로우 형광 단백질) 파지를 anced. 정화 단계의 시리즈는 다음 현미경으로 DAPI-라벨 및 이미징 다음, 수행됩니다. 이것은 균일, DNA 포장 효율성, 형광 신호와 파지 주식의 구조 안정성을 확인하기 위해 수행됩니다. 박테리아에 phages의 초기 흡착는 ° C 바이러스 DNA 주입 6 실행하는 35 짧은 부화에 의해 다음 다음에 얼음이 수행됩니다. 파지 / 박테리아 혼합는 다음 얇은 영양 한천 판, coverslip으로 덮여 있으며 epifluorescence 현미경 이미징의 표면으로 이동됩니다. 후 감염 과정은 10 분 간격으로, 4 시간에옵니다. 여러 단계 순위는 ~ 100 셀 감염이 단일 실험에서 추적 할 수 있도록 추적합니다. 각 위치와 시간 시점에서, 이미지가 위상 대비 빨간색과 녹색 형광 채널에 인수되어 있습니다. 위상 대비 이미지가 자동 cel 나중에 사용됩니다형광 채널이 감염 결과를 특성화하는 데 사용하는 동안 난 인정 : 재개 세포의 성장과 분열에 이어 lysogeny 요소의 세포 용해, 또는 표현 (빨간색)에 이어 새로운 형광 phages (녹색)의 생산. 인수 시간 경과 영화는 수동 및 자동 방법의 조합을 사용하여 처리됩니다. 각 감염 이벤트 (phages을 감염 예 수와 위치)뿐만 아니라 감염 결과 (용해 / lysogeny)에 감염 매개 변수의 식별의 데이터 분석 결과. 원하는 경우 추가 매개 변수를 추출 할 수 있습니다.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를 설명합니다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 박테리아, 현미경으로 감염 결과에 따라, 그리고 감염 결과의 분석.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.2K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. 이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를 설명합니다 E. 대장균 박테리아, 현미경으로 감염 결과에 따라, 그리고 감염 결과의 분석.

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic의 비 침습 모델<em&gt; 대장균</em&gt; 신생아 쥐에 감염

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...