우리는 마이클 Feiss과 파지 생성 및 정화에 안내를위한 장 Sippy에 감사하고 있습니다. 우리는 세포 인식 소프트웨어, Schnitzcell를 제공하기 위해 마이클 Elowitz 감사드립니다. , 웰치 재단 (기금 Q-1759)과 인간 프론티어 과학 : 골딩 연구실에서 작품은 국립 보건원 (R01GM082837), 국립 과학 재단 (살아있는 세포의 물리 센터 082,265, PFC)의 보조금에 의해 지원됩니다 프로그램 (RGY 2,008분의 70).

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

박테리아 변종, 파지 및 Plasmids : 스트레인 LE392은 supF입니다. 그것은 (자세한 내용은 표 1 참조) 파지의 게놈에 Sam7 돌연변이를 억제하기 위해 선정되었습니다. 따라서, 유도 lysogens 결국 lyse과 파지 입자를 공개, lytic 경로를 선택으로 의지 감염된 세포합니다. Lysogenic 세포가 30에서 재배 ° C 파지의 게놈에서 857 allele CI 민감한 온도의 존재로 인해. 열 유도 후, gpD - EYFP과 야생 유형 gpD는 λ LZ1의 게놈과 플라스미드 pPlate * D 각각에서 공동으로 표현됩니다. 그 결과, 새로 만든 파지 λ LZ2의 capsid는 gpD - EYFP 및 gpD 단백질의 혼합물이 포함되어 있습니다. 이 모자이크 파지는 개별 phages 5 감지를 허용 구조적으로 안정적이고 충분히 형광입니다. PP RE - mCherry는 lysogenic pathwa의 선택을 검색하는 데 사용 플라스미드 기자입니다Y. 발기인 P의 RE는 lysogeny 1,11의 설립시 CII에 의해 활성화됩니다. PP RE - mCherry 5 mCherry 12 GFP를 교체하여 PE-GFP 11에서 파생되었다. 자세한 내용은 이전 작품 5를 참조하십시오. 성장 조건 매개 변수 : lysogen 유도 동안 (제 1), 180 rpm에서의 가벼운 흔들림은 좋은 바이러스 수율이 13을 제공합니다. 포도당 신진 대사로 피해야한다 성장 매체에 포도당의 이용은 산성 신진 대사 제품을 생성하고, 성숙 람다 입자는 산성 pH의 13 살 불안정합니다. MgSO 4의 추가는 파지 capsid 3 안정화 목적으로합니다. 야생 유형 CI를 (대신 CI 857의) 수행 phages를 들어, lysogen은 DNA-손상 에이전트 미토 마이신 C 3을 사용 유도 할 수 있습니다. 단계 1.3에서, 37의 부화는 ° C는 일반적으로 90 분 초과 할 수 없습니다. 이 usef입니다<html> 매 30 분 OD 600까지 셀 밀도를 확인 UL. 좋은 lysate를 들어, OD 600 주변에 0.2 이하로 들어가게되고, 나머지 OD 600 세포 파편의 결과입니다. 새로 만든 파지는 세포 파편에 자신의 DNA를 삽입하기 시작 수 있으므로 너무 오래 잠복기는 낮은 파지 수율 될 수 있습니다. 단계 2.11과 2.13에 보이는 파지 밴드를 (적어도 1 개 10 11 파지 입자)을 획득하려면, 단계 1.2에서 적어도 500 ML 문화를 성장. 단계 5.1 및 5.2의 성장 매체에 0.2 % 말토오스의 추가는 양고기, 파지 람다 흡착 3,14에 대한 수용체의 표현을 유도 목적으로합니다. mCherry - 대신 단계 5.2의 100 배의 1,000 배 희석은 기자 플라스미드 PP의 RE에서 mCherry 배경 수준을 감소 목적으로합니다. 35를 실행 파지의 DNA 주입을위한 단계 5.5 ° C는 온도에 민감한 cI857 allele의 유도를 방지하기 위해 선택됩니다. 파지 정화 : jove_content &quot;&gt; 파지 정화 단계 (2.11 단계 2.1) 기타 정화 프로토콜 5 대체하지만, CsCl 평형 기울기 (단계 2.12 및 2.13)을 통해 최종 ultracentrifugation은 피할 수 있습니다. 스윙 버킷 로터는 단계 2.10과 2.12에 필요합니다 순수한 파지 주식을 취득하는 것은 쉽게 주일까지 소요될 수 있습니다. 날카로운 눈에 보이는 파지 밴드를 보장하기 때문에 확실히 아무 중간 단계에서 잘못하지 못하게 길을 따라 파지의 titer를 확인 할 필요가 있습니다. 파지 처리 : 제 2의 모든 정화 절차 동안, 그것은 파지는 파지 헤드에서 파지의 꼬리를 전단 않도록 부드럽게 lys​​ate 처리하는 것이 중요합니다. 제 5 (예를 들어, 5.7을 통해 5.5 단계)의 세포 감염 동안, 그것은 또한 감염된 세포에서 파지 입자의 전단을 방지하는 것이 중요합니다. 파지는 그 DNA를 주입 한 후 감염된 세포에서 끊어 경우, 결과는 &quot;어둠&quot;의 감염입니다 참고로 즉fection의 결과는 실험에서 관찰하지만 감염 파지는 안 될 것입니다. phages 또는 파지 / 세포 혼합물을 처리 할 때마다 이러한 문제를 최소화하기 위해, 우리는 다양한 피펫 팁을 사용합니다. DAPI 테스트 : DAPI (제 4 항)과 파지 주식을 염색하면 파지 주식의 순도를 확인하기 위해 신속하고 효율적인 방법입니다. 또한 시간이 지남에 따라 기존 파지 주식의 가능한 저하를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 순수한 주식은 형광 현미경으로 YFP와 DAPI 신호의 공동 지방화 가까운 100 %이어야합니다. 우리는 일반적으로 YFP 명소의 1 % 미만이 입자가 성공적으로 바이러스 DNA를 포장하지 못했음을 나타냅니다하거나 이미 다른 곳에서 자신의 DNA를 주입 한 DAPI을 (바이러스 성 게놈없이 capsids을 대표하는) 포함하지 않는 것이 관찰합니다. DAPI 명소의 1 % 미만이 YFP를 (비 형광 phages에 해당)를 포함하지 않습니다. 이 경우가 아닌 경우, O에서 반복 할 필요가 2.14으로 2.12 단계를다시 정화 rder. 더 장기적으로 라이브 셀 이미징 여기 필요하지 않습니다 때문에 이미지 매개 변수로 돌아가서 단계 4.3 현미경 설정은 섹션 5에서처럼 중요하지 않습니다. 바라던 하나의 파지 입자의 형광 강도를 조정하는 경우 5 항에서와 같은 현미경 설정을 유지하는 데 유용합니다. PBS-아가로 오스 판은 매우 깨끗하고, 또는 DAPI 염색을 사용 너무 많이없는 경우, 파지의 DNA에 해당하는 일부 DAPI 장소는 &quot;후광&quot;로 둘러싸여 될 수 있습니다. 너무 작은 DAPI의 염료를 사용하는 경우, DAPI 채널의 신호는 매우 약한 수 있습니다. 현미경 시스템 : 제 6의 이미지를 들어, 우리는 100x 목표 (계획 Fluo, 수치 공 1.40, 기름 침수 세례) 및 표준 필터 세트 (니콘)와 상업 역 epifluorescence 현미경 (이클립스 TE2000-E, 니콘)을 사용합니다. 형광 광원은 빛 강도 ​​제어 아크 램프입니다. x, y 및 z PO : 다음 기능은 컴퓨터 제어sition, 시야 및 형광 셔터, 그리고 형광 필터 선택하실 수 있습니다. 자동 초점 기능이 필요합니다. 그렇지 않으면, 초점은 쉽게 시간 경과 동영상 (일반적으로 4시간 길이) 동안 멀어지기 수 있습니다. 이 병렬에서 여러 감염 이벤트를 수행 할 수 있습니다 각 시점에서 (X, Y) 여러 위치를 취득 할 수있는 기능은 유용합니다. 우리는 일반적으로 100 감염 이벤트까지 따라 각 영화 8 단계 위치를 취득. 우리가 사용하는 카메라는 16 비트 (Cascade512, Photometrics)의 동적 범위 16x16 규격 μm 픽셀 카메라와 냉각 512x512 CCD입니다. 인수는 MetaMorph 소프트웨어 (분자 장치)를 사용하여 수행됩니다. 현미경은 온도 조절 객실에 배치해야한다 또는 현미경 단계는 온도 조절 챔버로 둘러싸인해야합니다. 이미지 수집 : 라이브 셀 이미징를 들어, 표백하고 검사하고 사진을로 이어질 수 샘플의 불필요한 노출을 방지하기 위해 중요합니다totoxicity. 따라서 먼저 표백 과도하거나 억제 세포의 성장으로 이어지는되지 않고 형광 검출이 가능 최적의 빛 노출을 찾기 위해 시스템을 특징하는 것이 가장 좋습니다. 좋은 형광 이미지를 얻으려면 흥미 진진한 광도, 노출 시간 및 카메라 게인을 재생합니다. 단계 6.2-6.3에서 10 분 프레임 간격은 빛 노출을 최소화하기위한 목적으로 선택됩니다. 각 프레임에서 단지 하나의 포커스에 이미지가 위상 대비 (셀 인식) 및 형광 채널 (세포의 운명을 결정하는)에 필요합니다. 제 1 시점에서 YFP 채널을 통해하지만, 여러 Z-위치 이미지는 세포 표면에있는 모든 감염 phages를 캡처 할 필요가 있습니다. 초기 프레임에 YFP 노출 시간도 나중에 프레임에서 시간 경과 영화에 사용보다 더해야 할 수 있습니다. 이미지 분석 : 매우 신중하게 단계 7.1에서 세포 표면 주위에 파지 입자를 계산합니다. 으로상술 한 바와 같이, 우리는 단계 6.2에서 YFP 채널을 통해 Z-스택 일련의를. 그러나이 아직 계산을 도전 일부 형광 파지 입자 밖에서 초점을 남길 수 있습니다. 초기 시간 프레임에서 셀의 길이는 Metamorph 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다. 셀의 길이는 ImageJ 또는 다른 소프트웨어 도구에 의해 측정 할 수 있습니다. 또한, 자동화 된 집 지어 MATLAB 프로그램은 세포 lineages 따라 시간이 지남에 형광 변화 등의 정보를 얻어 매우 유용 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 피셔 과학 </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 피셔 과학 </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM 버퍼 </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 시그마 </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> 투석 카세트 </td><td> 열 과학 </td><td> 66,333 </td></tr><tr><td> 현미경 슬라이드 </td><td> 코닝 </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti 초 투명 관 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti 초 투명 관 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti 회 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti 회 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> 굴절계 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifluorescence 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 TE2000-E </td></tr></tbody></table> 표 2. 시약 및 장비.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

박테리오파지 (파지) 람다와 박테리아 E.를 포함하는 시스템 대장균은 오래 세포의 운명 결정 1,2의 패러다임을 역임했다. phages의 숫자로 셀의 동시 감염에 이어 두 경로 중 하나가 선택되어 lytic (악성) 또는 lysogenic (휴지) 3,4. 우리는 최근 휘황 개인 phages 라벨을위한 방법을 개발, 개인 phages와 셀 (5)의 수준에서 현미경으로 실시간으로 후 감염 결정을 검토 할 수 있었다. 여기, 우리는 이전 일 5에 설명 된 감염 실험을 수행하기위한 전체 절차를 설명합니다. 이 형광 phages의 창조, 세포의 감염, 현미경 이미징 및 데이터 분석을 포함하고 있습니다. 형광 파지는 capsid gpD 단백질의 &quot;하이브리드&quot;공동 표현 야생 유형과 YFP 퓨전 버전입니다. 원유 파지의 lysate 먼저 gpD-EYFP (Enh의 lysogen을 유도함으로써 얻을 수 있습니다플라스미드 표현 야생 유형 gpD을 품고, 옐로우 형광 단백질) 파지를 anced. 정화 단계의 시리즈는 다음 현미경으로 DAPI-라벨 및 이미징 다음, 수행됩니다. 이것은 균일, DNA 포장 효율성, 형광 신호와 파지 주식의 구조 안정성을 확인하기 위해 수행됩니다. 박테리아에 phages의 초기 흡착는 ° C 바이러스 DNA 주입 6 실행하는 35 짧은 부화에 의해 다음 다음에 얼음이 수행됩니다. 파지 / 박테리아 혼합는 다음 얇은 영양 한천 판, coverslip으로 덮여 있으며 epifluorescence 현미경 이미징의 표면으로 이동됩니다. 후 감염 과정은 10 분 간격으로, 4 시간에옵니다. 여러 단계 순위는 ~ 100 셀 감염이 단일 실험에서 추적 할 수 있도록 추적합니다. 각 위치와 시간 시점에서, 이미지가 위상 대비 빨간색과 녹색 형광 채널에 인수되어 있습니다. 위상 대비 이미지가 자동 cel 나중에 사용됩니다형광 채널이 감염 결과를 특성화하는 데 사용하는 동안 난 인정 : 재개 세포의 성장과 분열에 이어 lysogeny 요소의 세포 용해, 또는 표현 (빨간색)에 이어 새로운 형광 phages (녹색)의 생산. 인수 시간 경과 영화는 수동 및 자동 방법의 조합을 사용하여 처리됩니다. 각 감염 이벤트 (phages을 감염 예 수와 위치)뿐만 아니라 감염 결과 (용해 / lysogeny)에 감염 매개 변수의 식별의 데이터 분석 결과. 원하는 경우 추가 매개 변수를 추출 할 수 있습니다.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를 설명합니다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 박테리아, 현미경으로 감염 결과에 따라, 그리고 감염 결과의 분석.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.0K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. 이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를 설명합니다 E. 대장균 박테리아, 현미경으로 감염 결과에 따라, 그리고 감염 결과의 분석.