우리는이 원고 준비에 대 한 도움 한 나 폭스를 인정합니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01AI030612를 부여.

1. 세포 배양, 바이러스 성 감염 및 EdC 라벨 ( 그림 1) 다음 프로토콜 작업 바이러스를 포함. 학교를 참조 하십시오 &#39; 바이러스 및 다른 생물 학적 에이전트의 안전한 취급에 관한 s 바이오 안전 프로토콜. 이 프로토콜의 피츠버그 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
<ol><li>MRC-5 셀 confluent 150 cm 2 조직 배양 플라스 크를 trypsinize 하 고 600 cm 2 조직 문화 접시 100ml DMEM 플러스 10%를 포함 하는 셀 전송 FBS. Confluency 및 고정 단계를 도달 하기 위하여 3-4 일의 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. Confluent 600 cm 2 접시 7을 ~ 10 7 셀에 포함 되어 있습니다. 각 조건에 대해 1 접시와 각 해당 부정적인 컨트롤 1 접시 준비. 
	참고: 셀 그 유일한 vDNA를 분류 하 고 이후 단계에서 정화 되도록 세포 DNA 복제를 억제 하는 고정 단계에 도달 해야 합니다. 
	참고: 각 샘플 필요 합니다 무료로 동일한 감염 조건 및 EdC의 추가 없이 시간 포인트를 사용 하 여 준비 하는 부정적인 컨트롤 레이블 없음. 
	참고:이 실험의 버전을 축소 하는 A 실행 되어야 한다 유사한 세포 성장, 감염, EdC 조건, 라벨을 사용 하 여 이미징에 의해 세포 DNA의 라벨에 대 한 테스트 및 포인트를 시간에 (단계 2 참조).</li>
	<li>7 x 10 8 PFU HSV-1 7 mL에 희석 찬 Tris-Buffered 염 분 (TBS). 성장 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 저장 감염, MRC-5 셀을 실 온에서 1 h 바위 7 mL 희석된 바이러스를 추가 합니다. 흡착, 다음 inoculum을 제거 하 고 50 mL 실내 온도 TBS, 린스 원래 성장 매체를 대체. 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. 각 실험 조건 및 부정적인 제어를 위해이 단계를 실시 한다. 
	참고: 증가 EdC 라벨 얻을 수 바이러스 성 dUTPase (UL50 유전자) uracil glycosylase (UL2 유전자)의 표현에 대 한 결함이 HSV-1 돌연변이 사용 하 여. HSV-1 dUTPase는 낮은 기질 특이성 및 여러 nucleoside 아날로그 25 , 27의 활성화를 줄일 수 있다.</li>
	<li>레이블 EdC와 바이러스 성 게놈입니다. 들어오는 게놈 (1.3.1.), 유전자 (1.3.2.), 또는 바이러스 성 복제 포크 (1.3.3) 복제를 지시를 따릅니다. 
	참고: 유일한 단계 1.3.1, 1.3.2, 또는 1.3.3 실행 되어야 한다 있는지 여부에 따라 들어오는 게놈, 복제 된 유전자, 또는 복제 포크 후속 단계에 각각 분석. 
	참고: 듀 또는 f-아 듀 EdC에 교체하실 수 있습니다. Nucleoside 아날로그의 독성 모니터링 하 고 최소화 해야 합니다.
	<li>사용 <ol>prelabeled 감염 단계 1.2에서 수행 하 고 2 단계로 진행 하는 주식 또는 3 4 h 이내 게시물 감염 (hpi) 복제 되지 않은 vDNA ( 그림 1A)를 조사 하. 
		참고: 앞에서 설명한 프로토콜 25를 사용 하 여 주식 prelabeled 바이러스를 준비 합니다. 바이러스 주식 어떤 잔여 EdC를 제거 하려면 G-25 열을 통과 해야 합니다.</li>
		<li>5-25 µ M를 추가 하 여 복제 vDNA 라벨 2-4 h ( 그림 1B)에 감염 된 세포의 세포 배양에 EdC. 추가 하기 전에, 성장 매체의 1 mL에 EdC 희석.</li>
		<li>VDNA 복제의 발병 후 바이러스 성 복제 포크를 (&#8805; 4 hpi), 5-25 µ M와 vDNA 복제 펄스 레이블 EdC 5-20 분. 추격, 체이스 매체 포함 하는 25-100 µ M 2´deoxycytidine와 3 배를 씻어 (deoxyC), 및 다음 추가 20-40 분 ( 그림 1C) 체이스 매체의 품 어. 
		참고: 펄스와 체이스 매체를 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO 2 equilibrated 한다. 
		참고: 펄스 추적 실험, 그것은 입력 하는 셀 고 DNA 복제에 포함 될 수 있습니다 전에 phosphorylated nucleosides 하는 데 걸리는 시간을 고려 하는 것이 중요. 이 실험적으로 결정 되어야 합니다. 
		참고: 펄스 체이스 실험의 해상도 확인 하려면 사용 하는 실험 조건 하에서 바이러스 성 복제 속도 계산 합니다. 이는 한 단계 성장 시간 코스 26 동안 바이러스 성 게놈의 양이 많은 PCR에 의해 결정 될 수 있다. 
		참고: 바이러스 성 게놈을 이미징에 대 한 2 단계를 진행 하 고 바이러스 성 게놈의 정화에 대 한 3 단계를 진행.</li>
	</ol></li></ol> 2. EdC의 영상 DNA ( 그림 2A) 라는 참고: 그것은 영상에에서 세포질 DNA 실험에 표시 되지 않는 확인 하려면 바이러스 성 게놈 정화 방법으로 수행 하는 데 유용. 영상 또한 레이블된 vDNA의 특성을 시각화 하 고 proteomics 데이터 유효성 검사를 사용할 수 있습니다. 패턴을 얼룩이 지는 세포와 바이러스 성 DNA의 예는 그림 3에 나와 있습니다.
<ol><li>감염 수행 및 성장 매체의 1 mL를 포함 하는 12 음 조직 문화 접시에 coverslips에 조건 EdC 라벨을 사용 하 여 제외 하 고 1 단계에서에서 표시 된 대로 축소.</li>
	<li>1 mL 3.7%와 수정 셀 paraformaldehyde 실시간에 15 분 동안 1 x PBS에서 고정, 후 린스 세포를 PBS에서 1 mL 3 %BSA 2 x. 
	주의: Paraformaldehyde 심각한 또는 영구적인 부상을 일으킬 수 있습니다. 안전 예방 조치를 따르십시오. 
	참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 coverslips 두 번째 세척에 4 ° C에서 최대 3 일 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1 mL permeabilization 버퍼와 세포를 permeabilize [참조 테이블의 자료] 락을 하는 동안 실 온에서 20 분.</li>
	<li>흔들어 3 %BSA 한 다음 실 온에서 30 분 PBS에 1 mL 3 %BSA 블록 1 mL로 씻어.</li>
	<li>칵테일 클릭 반응의 1 개 mL를 추가 [참조 테이블의 자료] covalently 알 렉 사 Fluor 488 켤레를 coverslips에 EdC에 아 지 드 라는 DNA. 락을 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.</li>
	<li>락을 하는 동안 실 온에서 30 분 PBS에 Hoechst의 1:2,000 희석의 1 mL와 함께 얼룩 세포질 DNA. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.</li>
	<li>얼룩 표준 차 및 2 차 항 체와 간접 면역 형광 검사 프로토콜 25. 
	참고: 레이블된 vDNA colocalizes ICP8, ICP4, 또는 UL42 및 세포 라는 DNA Hoechst 얼룩과 colocalizes.</li>
	<li>슬라이드에 coverslips를 탑재 하 고 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지. 
	참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안.</li>
</ol> 3. VDNA와 관련 된 단백질의 정화 참고:이 프로토콜의 몇 가지 측면에서 양조위 외 적응 되었습니다 22 참고: 모든 버퍼 및 시 약은 사용 하기 전에 얼음에 냉장 해야 하 고 모든 단계 실행 되어야 한다 얼음에 달리 명시 하지 않는 한.
<ol><li>핵 수확. 
	참고: 핵의 격리, 하기 전에 포름알데히드 crosslink 단백질 DNA 사용할 수 있습니다. 더 엄격한 세척 조건 다음 streptavidin 입히는 구슬에 DNA 정화 하는 동안 사용할 수 있습니다. Cr에 대 한osslinking와 세척 조건 참조 Sirbu 외. 21. <ol><li>20 mL 핵 추출 버퍼 (코)와 성장 매체를 대체 하 고 가끔 락 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 핵 현미경에 표시 될 것입니다.</li>
		<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에서 핵을 긁 고 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 작은 핵, 삭제는 상쾌한 하 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 원심 분리기. 
		참고: Trypan 푸른 얼룩 세포에서 핵의 절연을 확인을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>부드럽게 10 ml PBS, 15 mL 원뿔 튜브에 핵 펠 릿을 꺼내 려 하 고 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 의해 펠 렛. 
		참고: 핵 얼 수 있다 고 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다. 이렇게 하려면 부드럽게 500에서 핵 펠 릿을 resuspend µ L 고정 버퍼 및 에탄올/드라이 아이스 목욕 튜브를 품 어. -80 ° c.에 언된 핵 저장 사용 하기 전에, 핵 실 온에서 해 동 하 고 신속 하 게 얼음, 10 mL PBS, 혼합, 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛을 부드럽게 록 추가 전송 완전히 PBS를 제거 합니다. 감소 된 수확량 귀 착될 지도 모른다 핵 동결.</li>
	</ol></li> <li>아 지 biotin-covalently 어원이 드 EdC 표시 vDNA.
	<li>10 mL 클릭 반응에서 핵 펠 릿 혼합 [참조 테이블의 자료] 부드럽게 위아래로 pipetting으로 5 번 10ml 피펫으로 resuspend <ol>. 
		참고: 그것은 중요 한 클릭 반응 혼합에 포함 시 약 표시 된 순서로 추가 됩니다.</li>
		<li>1 h 4 ° c.에 대 한 회전 회전 하는 동안 준비 하 고 버퍼 B1, B2 및 B3 [재료의 표 참조] 진정.</li>
		<li>4 ° C. 완전히 제거에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여 펠 릿 핵 반응 혼합을 클릭 하 고 부드럽게 10 mL PBS에에서 resuspending 및 4에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 펠 릿을 세척 ° c.</li>
		<li>부드럽게 1 mL PBS에서에서 핵 펠 릿과 큰 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 1.5 mL microfuge 관에 resuspend. 2500 x 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 g와 플래시 동결 액체 질소에에서 10 분 동안 centrifuging 여 핵을 펠 렛. 
		참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서 하 고 얼어붙은 핵 핵 될 플래시 단계 3.3 같은 날에 진행 하는 경우에 동결 하는 것이 좋습니다 그래서-80 ° c. 동결 해 동 수 후속 세포에 저장 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>Lyse 핵과 DNA 조각.
	<ol><li>얼음에 핵을 녹여 고 아래로 pipetting으로 버퍼 B1 500 µ L에서 resuspend. 45 분에 대 한 얼음에 품 어</li>
		<li>Sonicate 샘플 6 회 30 s 각 40% 진폭 3mm microtip 프로브를 사용 하 여. 30 대 한 얼음에 견본을 두 펄스 사이 s. 쥡니다, 샘플 표시 명확 하 고, 아니 흐린. 
		참고: 쥡니다 조건 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다. 쥡니다 조건을 최적화 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 렁 외. 22.</li> <li>centrifuging 14000 x g 4 ° c.에서 10 분에 의해 세포 파편을 펠 렛 펠 릿 크기는 크게 감소 한다. 100 µ M 셀 스 트레이너를 통해는 상쾌한을 필터링 하 고 유지를 통해 흐름.</li>
		<li>추가 500 µ L이이 샘플의 필터링 된 상쾌한. 900 µ L 버퍼 B2 단계 3.4.2에서에서 사용 됩니다.</li>
		<li>DNA 절연 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 고 추가 SDS-중 탄산 솔루션 x 50 µ L 2 [재료의 표 참조]. DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.</li>
		<li>입력된 단백질 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2를 추가, 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 ° C. 사용 단계 3.5.6에서에서.</li>
	</ol></li> <li>Streptavidin 바인딩 biotinylated DNA 코팅 구슬.
	<li>1.5 mL microfuge 관에 구슬 슬러리의 300 µ L를 전송 하 여 준비 Streptavidin T1 자석 구슬 <ol>. 샘플 당 구슬의 1 개의 관을 준비 합니다. 워시 비즈 1 mL 버퍼 B2 resuspend에 vortexing, 자석 구슬, 분리를 적용 하 고 발음 워시 버퍼와 함께 3 x. 
		참고: 최적화 조건 결과 최대화 항복에 최소한의 배경 바인딩 바인딩. 그것은 실험적으로 Streptavidin T1 자석 구슬 agarose 구슬, 뿐만 아니라 다른 Streptavidin 구슬 보다 갈수록 배경 바인딩 Streptavidin C1 비즈 보다 상당히 큰 바인딩 능력을가지고 결정 했다 ( 그림 4A ).</li>
		<li>단계 3.3.4에서에서 샘플의 추가 900 µ L. 씻어 구슬 하 고 회전 4에서 하룻밤 ° c. 
		참고: 샘플은 그들에 게 추가 되 면 소용돌이 구슬 하지 마십시오. 
		참고: 경우 상당한 양의 DNA 또는 단백질 레이블이 없는 부정적인 제어에 격리 되어,이 단계에서에서 줄일 수 있습니다 하룻밤을 줄이기 위해 배경 바인딩 4 h.</li>
	</ol></li> <li>구슬 세척 하 고 vDNA와 관련 된 단백질을 elute. 
	참고:이 좋습니다 나머지 단계에 대 한 필터 팁을 사용 하 여.
	<li>마그네틱 microfuge 관 랙, 제거 상쾌한 장소 샘플 부드럽게 1 ml 버퍼 B2, 회전 4 ° C에서 5 분에 대 한 resuspend</li> <ol>
		<li>반복 단계 3.5.1 세 번.</li>
		<li>마그네틱 microfuge 관 랙 샘플, 상쾌한 제거, 부드럽게 1 ml 버퍼 B3, resuspend 놓고 5 분의 4 ° C에서 회전</li>
		<li>전송 100 µ L 혼합물 (1/10 번째 볼륨) 바인딩된 DNA 분리에 대 한 새로운 튜브 구슬. 자석에이 튜브를 적용, 상쾌한 제거, SDS-중 탄산 솔루션 x 100 µ L 1에에서 구슬 resuspend 및 DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.</li>
		<li>단계 3.5.3에서에서 나머지 900 µ L 비드 혼합물을 포함 하는 튜브 적용. 자석, 상쾌한, 제거 및 단백질 및 DNA 단백질 복합물을 elute Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2에에서 구슬 resuspend.</li>
		<li>종 샘플에서 95 ° C 15 분, 소용돌이, 빠르고 microfuge에 회전 자석 적용. 새로운 튜브, 플래시 동결, 그리고-80에 게 eluate 전송 ° c. 
		참고: 사용 모자 자물쇠 튜브 팝업 하지 않습니다 보장 하기 위해 끓는 동안 열. 
		참고: 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 몇 주 동안-80 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>Coomassie 파란 얼룩, 부 럽, 또는 표준 절차 25 질량 분석 분석 단백질 견본. 대표 결과 그림 4 및 그림 5에 표시 됩니다. 
		참고: 단백질 수율 질량 분석에 대 한 충분 한 인지를 확인 하려면 각 샘플의 7.5 µ L은 분석 Coomassie 블루 얼룩 및 사용 대표적인 바이러스 성 게놈의 서 부 럽 대 7.5 µ L 관련 단백질 (ICP4, ICP8, 또는 UL42). 단계의 3.3.6 lysates의 같은 볼륨. 입력된 단백질 수준에 대 한 제어와 함께 실행 됩니다. 나머지 샘플 (35 µ L) 질량 분석 후 분석 앞에서 설명한 25.</li>
	</ol></li> <li>DNA 격리 <ol><li>단계 3.3.5에서에서 샘플을 품 어. 및 3.5.4. 필요한 경우 4-16 h. 제거 65 ° C에서 자석 구슬에서 샘플.</li>
		<li>150 µ L 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (PCI)와 샘플을 추출 하 고 새 튜브를 수성 단계 전송.</li>
		<li>100 µ L와 나머지 PCI 추출 트리 스-EDTA (테) 새로운 튜브에 수성 단계 추가.</li>
		<li>200 µ L 클로 프롬: isoamyl 알콜 (24:1)와 샘플 추출.</li>
		<li>정화 수성 단계 제조 업체에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 &#39; s 프로토콜. 
		참고: 버퍼 샌드위치에 pH 표시기 샘플에 추가 될 때 자주색 돌 것 이다. 추가 10 & #181. L 3 M NaOAc pH 5.0 샘플의 pH 감소.</li>
		<li>결정 DNA 농도 fluorometer를 사용 하 여. 
		참고:이 프로토콜은 일반적으로 100-400 ng 비드 바인딩된 DNA 생성합니다. 아니 DNA는 EdC 1.3 단계에서에서 추가 되지 않은 부정적인 컨트롤의 eluate에서 감지 해야 합니다.</li>
		<li>DNA 낮은 DNA 바인딩에 저장할 수 있습니다 4 또는-20 ° C에서 튜브와 실시간 PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts.">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10.">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li><li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+periphery+of+nuclear+domain+10+(ND10)+as+site+of+DNA+virus+deposition.">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li><li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment.">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 여러 단계를 신중 하 게 따르지 않으면 크게 감소 단백질 수확량 또는 세포질 DNA로 오염 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 그것은 중요 한 세포질 DNA는 하지 표시 하 고 정화 고정 셀 모든 실험을 위해 사용 됩니다. 이것은 단백질 견본에 세포질 DNA polymerases의 부재에 의해 HSV-1 게놈 종합을 위한 세포질 DNA 중 합 효소를 사용 하지 않습니다 때문에 확인할 수 있습니다. EdC 라벨 및...

바이러스는 필수적인 기능을 수행 하 고 따라서 감염 바이러스 성 유전자 발현, 복제, 복구, 재결합, 전송 등의 중요 한 측면을 촉진 하기 위하여 호스트 요소에 따라 제한 된 용량을가지고. 이러한 호스트 요인의 활동은 종종 virally 인코딩된 단백질에 의해 증강 된다. 또한, 바이러스 성 감염에 세포질 응답에 의해 바이러스 탐지 및 방해를 피해 야 한다. 따라서, 바이러스 호스트 상호 작용은 감염의 결과 지정합니다. 파라마운트의 중요성 이해 어떻게 바이러스 바이러스 성 프로세스를 촉진 하기 위하여 세포질 기계에 맞게 셀룰러 환경 변경. 특히 관심의 어떤 요소와 프로세스 행동 전염 성 주기에 걸쳐 바이러스 성 게놈에 식별 됩니다.
헤 르 페 스의 단순 바이러스 타입 1 (HSV-1)는 더블 좌초 인간의 인구의 상당한 비율을 감염 하는 DNA 바이러스입니다. 감염의 첫 번째 시간, 바이러스 성 게놈은 핵, 바이러스 성 유전자 발현의 순서 캐스케이드 바이러스 DNA (vDNA) 복제1조정에서 ensues 들어간다. 핵에서 게놈 epigenetic 규정이 적용, 수리 및 재결합, 받을 있으며 첫 번째 자손 virions 6 시간 미만 생산 되도록 capsids,으로 패키징 됩니다. 감염의 과정을 통해 관련 된 바이러스 성 게놈 단백질의 종합 평가 하는 바이러스 성 게놈에 행동 하 고 있는 바이러스 및 세포질 요인에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다. 프로세스의 분자 세부 조사를 기초 누워 것입니다. 감염의 다양 한 단계에 포함 된다입니다.
바이러스 성 감염에 관련 된 호스트 요인의 조사에 대 한 이전 방법 포함 관련된 세포 단백질2,3,,45 의 분석에 대 한 바이러스 성 단백질의 친 화력 정화 , 6 , 7 , 8 , 9. 이러한 분석 수단이 포함 된 세포질 요인의 식별에 대 한 호스트 항 바이러스 응답 뿐만 아니라 바이러스 chromatin 수정, 유전자 발현 및 DNA 복구. 그러나, 그것은 상호 작용 vDNA, 연관에 따라 달라 집니다 그리고 proteomics 특정 바이러스 성 요인의 기능으로 발생 하는 상호 작용에 대 한 통찰력을 제공 여부를 확인 하기가 어렵습니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 특정 바이러스 및 세포질 단백질 바이러스 성 게놈10,11,12,,1314 바인딩할 식별 하는 데 사용 되었습니다. , 15 그리고 형광 성 제자리 교 잡 (물고기) immunocytochemistry와 함께 vDNA16,,1718, 와 colocalize 세포 요소의 시각화 수 있게 되었습니다. 19 , 20.이 분석 실험 공간 및 시간 분석에 대 한 허용. 그러나, 한계는 매우 구체적인 항 체, 제한 된 감도 및 이전 통찰력 바이러스 호스트 상호 작용에 대 한 필요성에 대 한 필요성을 포함합니다. 우리는 따라서 iPOND (초기 DNA에 단백질의 격리)21 에 따라 방법을 개발 및 선택적으로 레이블을 지정 하 고 정화에서 vDNA aniPOND (가속된 네이티브 iPOND)22 감염 바이러스 성 게놈의 편견된 식별에 대 한 셀 관련된 단백질 질량 분석에 의해입니다. iPOND 세포 복제 포크 역학 조사에 대 한 수단이 되었습니다.
감염 된 세포에서 바이러스 성 게놈의 선택적 정화에 대 한 수정 ethynyl nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 또는 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (그림 1), 다음 화학식으로 표시 됩니다 vDNA 복제 통해 biotin 아 지 드를 활용 한 단계 바이러스 성 게놈 및 streptavidin 입히는 구슬 (그림 2B)에 관련 된 단백질의 정화를 촉진 하기 위하여 화학을 클릭 합니다. 중요 한 것은, 감염 vDNA의 특정 라벨 수 있도록 세포 DNA 복제에 종사 하지 않습니다 고정 된 셀에서 수행 됩니다. 또한, HSV-1 감염 세포 주기 검거 원인과 세포 DNA 복제23,24를 억제 합니다. 바이러스를 들어오는 바이러스 성 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 감염 전에 prelabeled 또는 새로 합성된 vDNA (그림 1B)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 DNA 복제 하는 동안 표시 수 있습니다. 25. 또한, 펄스 체이스 분석 바이러스 성 복제 포크 (그림 1C)26와 관련 된 단백질의 특성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, ethynyl 수정 vDNA 단백질 역동성 (그림 2A 및 그림 3)의 공간을 위해 fluorophore를 covalently 활용 될 수 있습니다. 이미징은 vDNA의 직접적인 시각화에 대 한 허용 및 vDNA-단백질 상호 작용의 유효성 검사에 대 한 무료 접근 이며 감염을 통해 바이러스 성 게놈을 추적 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리 예상 대기 시간 및 재 조직를 포함 하 여 herpesviral 감염의 어떤 양상 든 지 공부 하 고 다른 DNA 바이러스 연구를 이러한 접근 더 수정 될 수 있습니다. 또한, 5-ethynyl uridine로 (EU) RNA 바이러스 성 게놈의 분석에 대 한 허용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1930">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">MRC-5 cells</td>
			<td style="width:197px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CCL-171</td>
			<td style="width:1215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">26140-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">12800-082</td>
			<td>substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&#160; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">600 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">166508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">HSV-1 stock</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Sephadex G-25&#160; column (PD-10 Desalting Column)</td>
			<td style="width:197px;">GE Healthcare</td>
			<td align="right" style="width:101px;">17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">5&#180;-Ethynyl-2&#180;-deoxycytidine (EdC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T511307</td>
			<td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2&#180;-deoxycytidine (deoxyC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D3897</td>
			<td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:197px;">Bellco glass</td>
			<td style="width:101px;">7731-22000</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">PBS, pH 7.2 (10x)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">C489</td>
			<td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">(+) Sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A4034</td>
			<td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biotin azide</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">B10184</td>
			<td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &#176;C for up to 1 year&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Click Reaction Mix</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:101px;">11697498001</td>
			<td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &#176;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">freezing buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &#956;L 50x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td>
			<td style="width:197px;">Sonics</td>
			<td style="width:101px;">VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:197px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:101px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:101px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Mini-Tube Rotator</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">260750F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2X Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&#160; &#176;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cap locks for 1.5 mL tube</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">NC9679153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Standard western blotting reagents</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">LC6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">12-well tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:101px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Coverslips</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-545-100</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:197px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:101px;">15710</td>
			<td>dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">BP1605</td>
			<td>prepare 3% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787</td>
			<td>prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:197px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:101px;">C10337</td>
			<td>prepare according to manufactorer&#39;s protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">H1399</td>
			<td>prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-ICP8 primary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab20194</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab19311</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">a11005</td>
			<td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Immu-mount</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2x SDS-bicarb solution</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:101px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">3 M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit assay tubes</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fluorescence microscope equipped with imaging software</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Heat blocks</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>65 &#176;C and 95 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

이 프로토콜의 목표를 포진 심 플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)의 식별에 감염 된 세포에서 DNA 관련 바이러스 이며 여 세포질 단백질 질량 분석. 바이러스 성 유전자와 상호 작용 하는 단백질 감염의 결과 결정에 있는 주요 역할 비록 바이러스 성 게놈 관련 단백질의 포괄적인 분석 이전 가능 되지 않았습니다. 여기 감염 된 세포에서 HSV-1 유전자의 직접 정화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 DNA 복제 alkyne 기능 그룹을 포함 하는 수정 된 세포핵으로 선택적으로 표시 됩니다. 레이블이 지정 된 DNA는 다음 구체적으로 그리고 돌이킬 수 태그 biotin 통해 구리 (I) 아 지 드의 공유 첨부 파일을 통해-아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 클릭 반응 촉매. Biotin 태그 DNA streptavidin 입히는 구슬에 정화와 관련 된 단백질은 eluted 질량 분석에 의해 확인 된. 이 메서드는 선택적 대상 지정 및 HSV-1 복제 포크 또는 복잡 한 생물 학적 환경에서 전체 게놈의 격리 수 있습니다. 또한,이 방법의 적응은 herpesviral 감염의 다양 한 측면의 다른 DNA 바이러스의 유전자 검사의 수사 허용 하 고 있습니다.

세포에서 DNA의 정화에 대 한 클릭 화학을 사용 하 여 먼저 iPOND 메서드21에 의해 달성 되었다. IPOND의 목적은 정화 관련된 단백질의 id에 대 한 세포 복제 포크입니다. 우리는 특별히 감염 시 vDNA 단백질 상호 작용 연구에이 기술을 적응 시켰다. EdC (그림 1)와 함께 동기화 된 감염, 바이러스 성 게놈을 접근의 조작 선택적 분리와 vDNA의 ?...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine. 이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

연구

면역학 및 감염병학

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화