Name: purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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우리는이 원고 준비에 대 한 도움 한 나 폭스를 인정합니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01AI030612를 부여.

1. 세포 배양, 바이러스 성 감염 및 EdC 라벨 ( 그림 1) 다음 프로토콜 작업 바이러스를 포함. 학교를 참조 하십시오 &#39; 바이러스 및 다른 생물 학적 에이전트의 안전한 취급에 관한 s 바이오 안전 프로토콜. 이 프로토콜의 피츠버그 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
<ol><li>MRC-5 셀 confluent 150 cm 2 조직 배양 플라스 크를 trypsinize 하 고 600 cm 2 조직 문화 접시 100ml DMEM 플러스 10%를 포함 하는 셀 전송 FBS. Confluency 및 고정 단계를 도달 하기 위하여 3-4 일의 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. Confluent 600 cm 2 접시 7을 ~ 10 7 셀에 포함 되어 있습니다. 각 조건에 대해 1 접시와 각 해당 부정적인 컨트롤 1 접시 준비. 
	참고: 셀 그 유일한 vDNA를 분류 하 고 이후 단계에서 정화 되도록 세포 DNA 복제를 억제 하는 고정 단계에 도달 해야 합니다. 
	참고: 각 샘플 필요 합니다 무료로 동일한 감염 조건 및 EdC의 추가 없이 시간 포인트를 사용 하 여 준비 하는 부정적인 컨트롤 레이블 없음. 
	참고:이 실험의 버전을 축소 하는 A 실행 되어야 한다 유사한 세포 성장, 감염, EdC 조건, 라벨을 사용 하 여 이미징에 의해 세포 DNA의 라벨에 대 한 테스트 및 포인트를 시간에 (단계 2 참조).</li>
	<li>7 x 10 8 PFU HSV-1 7 mL에 희석 찬 Tris-Buffered 염 분 (TBS). 성장 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 저장 감염, MRC-5 셀을 실 온에서 1 h 바위 7 mL 희석된 바이러스를 추가 합니다. 흡착, 다음 inoculum을 제거 하 고 50 mL 실내 온도 TBS, 린스 원래 성장 매체를 대체. 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. 각 실험 조건 및 부정적인 제어를 위해이 단계를 실시 한다. 
	참고: 증가 EdC 라벨 얻을 수 바이러스 성 dUTPase (UL50 유전자) uracil glycosylase (UL2 유전자)의 표현에 대 한 결함이 HSV-1 돌연변이 사용 하 여. HSV-1 dUTPase는 낮은 기질 특이성 및 여러 nucleoside 아날로그 25 , 27의 활성화를 줄일 수 있다.</li>
	<li>레이블 EdC와 바이러스 성 게놈입니다. 들어오는 게놈 (1.3.1.), 유전자 (1.3.2.), 또는 바이러스 성 복제 포크 (1.3.3) 복제를 지시를 따릅니다. 
	참고: 유일한 단계 1.3.1, 1.3.2, 또는 1.3.3 실행 되어야 한다 있는지 여부에 따라 들어오는 게놈, 복제 된 유전자, 또는 복제 포크 후속 단계에 각각 분석. 
	참고: 듀 또는 f-아 듀 EdC에 교체하실 수 있습니다. Nucleoside 아날로그의 독성 모니터링 하 고 최소화 해야 합니다.
	<li>사용 <ol>prelabeled 감염 단계 1.2에서 수행 하 고 2 단계로 진행 하는 주식 또는 3 4 h 이내 게시물 감염 (hpi) 복제 되지 않은 vDNA ( 그림 1A)를 조사 하. 
		참고: 앞에서 설명한 프로토콜 25를 사용 하 여 주식 prelabeled 바이러스를 준비 합니다. 바이러스 주식 어떤 잔여 EdC를 제거 하려면 G-25 열을 통과 해야 합니다.</li>
		<li>5-25 µ M를 추가 하 여 복제 vDNA 라벨 2-4 h ( 그림 1B)에 감염 된 세포의 세포 배양에 EdC. 추가 하기 전에, 성장 매체의 1 mL에 EdC 희석.</li>
		<li>VDNA 복제의 발병 후 바이러스 성 복제 포크를 (&#8805; 4 hpi), 5-25 µ M와 vDNA 복제 펄스 레이블 EdC 5-20 분. 추격, 체이스 매체 포함 하는 25-100 µ M 2´deoxycytidine와 3 배를 씻어 (deoxyC), 및 다음 추가 20-40 분 ( 그림 1C) 체이스 매체의 품 어. 
		참고: 펄스와 체이스 매체를 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO 2 equilibrated 한다. 
		참고: 펄스 추적 실험, 그것은 입력 하는 셀 고 DNA 복제에 포함 될 수 있습니다 전에 phosphorylated nucleosides 하는 데 걸리는 시간을 고려 하는 것이 중요. 이 실험적으로 결정 되어야 합니다. 
		참고: 펄스 체이스 실험의 해상도 확인 하려면 사용 하는 실험 조건 하에서 바이러스 성 복제 속도 계산 합니다. 이는 한 단계 성장 시간 코스 26 동안 바이러스 성 게놈의 양이 많은 PCR에 의해 결정 될 수 있다. 
		참고: 바이러스 성 게놈을 이미징에 대 한 2 단계를 진행 하 고 바이러스 성 게놈의 정화에 대 한 3 단계를 진행.</li>
	</ol></li></ol> 2. EdC의 영상 DNA ( 그림 2A) 라는 참고: 그것은 영상에에서 세포질 DNA 실험에 표시 되지 않는 확인 하려면 바이러스 성 게놈 정화 방법으로 수행 하는 데 유용. 영상 또한 레이블된 vDNA의 특성을 시각화 하 고 proteomics 데이터 유효성 검사를 사용할 수 있습니다. 패턴을 얼룩이 지는 세포와 바이러스 성 DNA의 예는 그림 3에 나와 있습니다.
<ol><li>감염 수행 및 성장 매체의 1 mL를 포함 하는 12 음 조직 문화 접시에 coverslips에 조건 EdC 라벨을 사용 하 여 제외 하 고 1 단계에서에서 표시 된 대로 축소.</li>
	<li>1 mL 3.7%와 수정 셀 paraformaldehyde 실시간에 15 분 동안 1 x PBS에서 고정, 후 린스 세포를 PBS에서 1 mL 3 %BSA 2 x. 
	주의: Paraformaldehyde 심각한 또는 영구적인 부상을 일으킬 수 있습니다. 안전 예방 조치를 따르십시오. 
	참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 coverslips 두 번째 세척에 4 ° C에서 최대 3 일 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1 mL permeabilization 버퍼와 세포를 permeabilize [참조 테이블의 자료] 락을 하는 동안 실 온에서 20 분.</li>
	<li>흔들어 3 %BSA 한 다음 실 온에서 30 분 PBS에 1 mL 3 %BSA 블록 1 mL로 씻어.</li>
	<li>칵테일 클릭 반응의 1 개 mL를 추가 [참조 테이블의 자료] covalently 알 렉 사 Fluor 488 켤레를 coverslips에 EdC에 아 지 드 라는 DNA. 락을 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.</li>
	<li>락을 하는 동안 실 온에서 30 분 PBS에 Hoechst의 1:2,000 희석의 1 mL와 함께 얼룩 세포질 DNA. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.</li>
	<li>얼룩 표준 차 및 2 차 항 체와 간접 면역 형광 검사 프로토콜 25. 
	참고: 레이블된 vDNA colocalizes ICP8, ICP4, 또는 UL42 및 세포 라는 DNA Hoechst 얼룩과 colocalizes.</li>
	<li>슬라이드에 coverslips를 탑재 하 고 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지. 
	참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안.</li>
</ol> 3. VDNA와 관련 된 단백질의 정화 참고:이 프로토콜의 몇 가지 측면에서 양조위 외 적응 되었습니다 22 참고: 모든 버퍼 및 시 약은 사용 하기 전에 얼음에 냉장 해야 하 고 모든 단계 실행 되어야 한다 얼음에 달리 명시 하지 않는 한.
<ol><li>핵 수확. 
	참고: 핵의 격리, 하기 전에 포름알데히드 crosslink 단백질 DNA 사용할 수 있습니다. 더 엄격한 세척 조건 다음 streptavidin 입히는 구슬에 DNA 정화 하는 동안 사용할 수 있습니다. Cr에 대 한osslinking와 세척 조건 참조 Sirbu 외. 21. <ol><li>20 mL 핵 추출 버퍼 (코)와 성장 매체를 대체 하 고 가끔 락 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 핵 현미경에 표시 될 것입니다.</li>
		<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에서 핵을 긁 고 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 작은 핵, 삭제는 상쾌한 하 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 원심 분리기. 
		참고: Trypan 푸른 얼룩 세포에서 핵의 절연을 확인을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>부드럽게 10 ml PBS, 15 mL 원뿔 튜브에 핵 펠 릿을 꺼내 려 하 고 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 의해 펠 렛. 
		참고: 핵 얼 수 있다 고 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다. 이렇게 하려면 부드럽게 500에서 핵 펠 릿을 resuspend µ L 고정 버퍼 및 에탄올/드라이 아이스 목욕 튜브를 품 어. -80 ° c.에 언된 핵 저장 사용 하기 전에, 핵 실 온에서 해 동 하 고 신속 하 게 얼음, 10 mL PBS, 혼합, 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛을 부드럽게 록 추가 전송 완전히 PBS를 제거 합니다. 감소 된 수확량 귀 착될 지도 모른다 핵 동결.</li>
	</ol></li> <li>아 지 biotin-covalently 어원이 드 EdC 표시 vDNA.
	<li>10 mL 클릭 반응에서 핵 펠 릿 혼합 [참조 테이블의 자료] 부드럽게 위아래로 pipetting으로 5 번 10ml 피펫으로 resuspend <ol>. 
		참고: 그것은 중요 한 클릭 반응 혼합에 포함 시 약 표시 된 순서로 추가 됩니다.</li>
		<li>1 h 4 ° c.에 대 한 회전 회전 하는 동안 준비 하 고 버퍼 B1, B2 및 B3 [재료의 표 참조] 진정.</li>
		<li>4 ° C. 완전히 제거에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여 펠 릿 핵 반응 혼합을 클릭 하 고 부드럽게 10 mL PBS에에서 resuspending 및 4에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 펠 릿을 세척 ° c.</li>
		<li>부드럽게 1 mL PBS에서에서 핵 펠 릿과 큰 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 1.5 mL microfuge 관에 resuspend. 2500 x 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 g와 플래시 동결 액체 질소에에서 10 분 동안 centrifuging 여 핵을 펠 렛. 
		참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서 하 고 얼어붙은 핵 핵 될 플래시 단계 3.3 같은 날에 진행 하는 경우에 동결 하는 것이 좋습니다 그래서-80 ° c. 동결 해 동 수 후속 세포에 저장 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>Lyse 핵과 DNA 조각.
	<ol><li>얼음에 핵을 녹여 고 아래로 pipetting으로 버퍼 B1 500 µ L에서 resuspend. 45 분에 대 한 얼음에 품 어</li>
		<li>Sonicate 샘플 6 회 30 s 각 40% 진폭 3mm microtip 프로브를 사용 하 여. 30 대 한 얼음에 견본을 두 펄스 사이 s. 쥡니다, 샘플 표시 명확 하 고, 아니 흐린. 
		참고: 쥡니다 조건 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다. 쥡니다 조건을 최적화 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 렁 외. 22.</li> <li>centrifuging 14000 x g 4 ° c.에서 10 분에 의해 세포 파편을 펠 렛 펠 릿 크기는 크게 감소 한다. 100 µ M 셀 스 트레이너를 통해는 상쾌한을 필터링 하 고 유지를 통해 흐름.</li>
		<li>추가 500 µ L이이 샘플의 필터링 된 상쾌한. 900 µ L 버퍼 B2 단계 3.4.2에서에서 사용 됩니다.</li>
		<li>DNA 절연 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 고 추가 SDS-중 탄산 솔루션 x 50 µ L 2 [재료의 표 참조]. DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.</li>
		<li>입력된 단백질 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2를 추가, 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 ° C. 사용 단계 3.5.6에서에서.</li>
	</ol></li> <li>Streptavidin 바인딩 biotinylated DNA 코팅 구슬.
	<li>1.5 mL microfuge 관에 구슬 슬러리의 300 µ L를 전송 하 여 준비 Streptavidin T1 자석 구슬 <ol>. 샘플 당 구슬의 1 개의 관을 준비 합니다. 워시 비즈 1 mL 버퍼 B2 resuspend에 vortexing, 자석 구슬, 분리를 적용 하 고 발음 워시 버퍼와 함께 3 x. 
		참고: 최적화 조건 결과 최대화 항복에 최소한의 배경 바인딩 바인딩. 그것은 실험적으로 Streptavidin T1 자석 구슬 agarose 구슬, 뿐만 아니라 다른 Streptavidin 구슬 보다 갈수록 배경 바인딩 Streptavidin C1 비즈 보다 상당히 큰 바인딩 능력을가지고 결정 했다 ( 그림 4A ).</li>
		<li>단계 3.3.4에서에서 샘플의 추가 900 µ L. 씻어 구슬 하 고 회전 4에서 하룻밤 ° c. 
		참고: 샘플은 그들에 게 추가 되 면 소용돌이 구슬 하지 마십시오. 
		참고: 경우 상당한 양의 DNA 또는 단백질 레이블이 없는 부정적인 제어에 격리 되어,이 단계에서에서 줄일 수 있습니다 하룻밤을 줄이기 위해 배경 바인딩 4 h.</li>
	</ol></li> <li>구슬 세척 하 고 vDNA와 관련 된 단백질을 elute. 
	참고:이 좋습니다 나머지 단계에 대 한 필터 팁을 사용 하 여.
	<li>마그네틱 microfuge 관 랙, 제거 상쾌한 장소 샘플 부드럽게 1 ml 버퍼 B2, 회전 4 ° C에서 5 분에 대 한 resuspend</li> <ol>
		<li>반복 단계 3.5.1 세 번.</li>
		<li>마그네틱 microfuge 관 랙 샘플, 상쾌한 제거, 부드럽게 1 ml 버퍼 B3, resuspend 놓고 5 분의 4 ° C에서 회전</li>
		<li>전송 100 µ L 혼합물 (1/10 번째 볼륨) 바인딩된 DNA 분리에 대 한 새로운 튜브 구슬. 자석에이 튜브를 적용, 상쾌한 제거, SDS-중 탄산 솔루션 x 100 µ L 1에에서 구슬 resuspend 및 DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.</li>
		<li>단계 3.5.3에서에서 나머지 900 µ L 비드 혼합물을 포함 하는 튜브 적용. 자석, 상쾌한, 제거 및 단백질 및 DNA 단백질 복합물을 elute Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2에에서 구슬 resuspend.</li>
		<li>종 샘플에서 95 ° C 15 분, 소용돌이, 빠르고 microfuge에 회전 자석 적용. 새로운 튜브, 플래시 동결, 그리고-80에 게 eluate 전송 ° c. 
		참고: 사용 모자 자물쇠 튜브 팝업 하지 않습니다 보장 하기 위해 끓는 동안 열. 
		참고: 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 몇 주 동안-80 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>Coomassie 파란 얼룩, 부 럽, 또는 표준 절차 25 질량 분석 분석 단백질 견본. 대표 결과 그림 4 및 그림 5에 표시 됩니다. 
		참고: 단백질 수율 질량 분석에 대 한 충분 한 인지를 확인 하려면 각 샘플의 7.5 µ L은 분석 Coomassie 블루 얼룩 및 사용 대표적인 바이러스 성 게놈의 서 부 럽 대 7.5 µ L 관련 단백질 (ICP4, ICP8, 또는 UL42). 단계의 3.3.6 lysates의 같은 볼륨. 입력된 단백질 수준에 대 한 제어와 함께 실행 됩니다. 나머지 샘플 (35 µ L) 질량 분석 후 분석 앞에서 설명한 25.</li>
	</ol></li> <li>DNA 격리 <ol><li>단계 3.3.5에서에서 샘플을 품 어. 및 3.5.4. 필요한 경우 4-16 h. 제거 65 ° C에서 자석 구슬에서 샘플.</li>
		<li>150 µ L 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (PCI)와 샘플을 추출 하 고 새 튜브를 수성 단계 전송.</li>
		<li>100 µ L와 나머지 PCI 추출 트리 스-EDTA (테) 새로운 튜브에 수성 단계 추가.</li>
		<li>200 µ L 클로 프롬: isoamyl 알콜 (24:1)와 샘플 추출.</li>
		<li>정화 수성 단계 제조 업체에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 &#39; s 프로토콜. 
		참고: 버퍼 샌드위치에 pH 표시기 샘플에 추가 될 때 자주색 돌 것 이다. 추가 10 & #181. L 3 M NaOAc pH 5.0 샘플의 pH 감소.</li>
		<li>결정 DNA 농도 fluorometer를 사용 하 여. 
		참고:이 프로토콜은 일반적으로 100-400 ng 비드 바인딩된 DNA 생성합니다. 아니 DNA는 EdC 1.3 단계에서에서 추가 되지 않은 부정적인 컨트롤의 eluate에서 감지 해야 합니다.</li>
		<li>DNA 낮은 DNA 바인딩에 저장할 수 있습니다 4 또는-20 ° C에서 튜브와 실시간 PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts.">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10.">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li><li>Ishov, A. M., Maul, G. 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B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 여러 단계를 신중 하 게 따르지 않으면 크게 감소 단백질 수확량 또는 세포질 DNA로 오염 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 그것은 중요 한 세포질 DNA는 하지 표시 하 고 정화 고정 셀 모든 실험을 위해 사용 됩니다. 이것은 단백질 견본에 세포질 DNA polymerases의 부재에 의해 HSV-1 게놈 종합을 위한 세포질 DNA 중 합 효소를 사용 하지 않습니다 때문에 확인할 수 있습니다. EdC 라벨 및...

바이러스는 필수적인 기능을 수행 하 고 따라서 감염 바이러스 성 유전자 발현, 복제, 복구, 재결합, 전송 등의 중요 한 측면을 촉진 하기 위하여 호스트 요소에 따라 제한 된 용량을가지고. 이러한 호스트 요인의 활동은 종종 virally 인코딩된 단백질에 의해 증강 된다. 또한, 바이러스 성 감염에 세포질 응답에 의해 바이러스 탐지 및 방해를 피해 야 한다. 따라서, 바이러스 호스트 상호 작용은 감염의 결과 지정합니다. 파라마운트의 중요성 이해 어떻게 바이러스 바이러스 성 프로세스를 촉진 하기 위하여 세포질 기계에 맞게 셀룰러 환경 변경. 특히 관심의 어떤 요소와 프로세스 행동 전염 성 주기에 걸쳐 바이러스 성 게놈에 식별 됩니다.
헤 르 페 스의 단순 바이러스 타입 1 (HSV-1)는 더블 좌초 인간의 인구의 상당한 비율을 감염 하는 DNA 바이러스입니다. 감염의 첫 번째 시간, 바이러스 성 게놈은 핵, 바이러스 성 유전자 발현의 순서 캐스케이드 바이러스 DNA (vDNA) 복제1조정에서 ensues 들어간다. 핵에서 게놈 epigenetic 규정이 적용, 수리 및 재결합, 받을 있으며 첫 번째 자손 virions 6 시간 미만 생산 되도록 capsids,으로 패키징 됩니다. 감염의 과정을 통해 관련 된 바이러스 성 게놈 단백질의 종합 평가 하는 바이러스 성 게놈에 행동 하 고 있는 바이러스 및 세포질 요인에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다. 프로세스의 분자 세부 조사를 기초 누워 것입니다. 감염의 다양 한 단계에 포함 된다입니다.
바이러스 성 감염에 관련 된 호스트 요인의 조사에 대 한 이전 방법 포함 관련된 세포 단백질2,3,,45 의 분석에 대 한 바이러스 성 단백질의 친 화력 정화 , 6 , 7 , 8 , 9. 이러한 분석 수단이 포함 된 세포질 요인의 식별에 대 한 호스트 항 바이러스 응답 뿐만 아니라 바이러스 chromatin 수정, 유전자 발현 및 DNA 복구. 그러나, 그것은 상호 작용 vDNA, 연관에 따라 달라 집니다 그리고 proteomics 특정 바이러스 성 요인의 기능으로 발생 하는 상호 작용에 대 한 통찰력을 제공 여부를 확인 하기가 어렵습니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 특정 바이러스 및 세포질 단백질 바이러스 성 게놈10,11,12,,1314 바인딩할 식별 하는 데 사용 되었습니다. , 15 그리고 형광 성 제자리 교 잡 (물고기) immunocytochemistry와 함께 vDNA16,,1718, 와 colocalize 세포 요소의 시각화 수 있게 되었습니다. 19 , 20.이 분석 실험 공간 및 시간 분석에 대 한 허용. 그러나, 한계는 매우 구체적인 항 체, 제한 된 감도 및 이전 통찰력 바이러스 호스트 상호 작용에 대 한 필요성에 대 한 필요성을 포함합니다. 우리는 따라서 iPOND (초기 DNA에 단백질의 격리)21 에 따라 방법을 개발 및 선택적으로 레이블을 지정 하 고 정화에서 vDNA aniPOND (가속된 네이티브 iPOND)22 감염 바이러스 성 게놈의 편견된 식별에 대 한 셀 관련된 단백질 질량 분석에 의해입니다. iPOND 세포 복제 포크 역학 조사에 대 한 수단이 되었습니다.
감염 된 세포에서 바이러스 성 게놈의 선택적 정화에 대 한 수정 ethynyl nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 또는 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (그림 1), 다음 화학식으로 표시 됩니다 vDNA 복제 통해 biotin 아 지 드를 활용 한 단계 바이러스 성 게놈 및 streptavidin 입히는 구슬 (그림 2B)에 관련 된 단백질의 정화를 촉진 하기 위하여 화학을 클릭 합니다. 중요 한 것은, 감염 vDNA의 특정 라벨 수 있도록 세포 DNA 복제에 종사 하지 않습니다 고정 된 셀에서 수행 됩니다. 또한, HSV-1 감염 세포 주기 검거 원인과 세포 DNA 복제23,24를 억제 합니다. 바이러스를 들어오는 바이러스 성 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 감염 전에 prelabeled 또는 새로 합성된 vDNA (그림 1B)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 DNA 복제 하는 동안 표시 수 있습니다. 25. 또한, 펄스 체이스 분석 바이러스 성 복제 포크 (그림 1C)26와 관련 된 단백질의 특성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, ethynyl 수정 vDNA 단백질 역동성 (그림 2A 및 그림 3)의 공간을 위해 fluorophore를 covalently 활용 될 수 있습니다. 이미징은 vDNA의 직접적인 시각화에 대 한 허용 및 vDNA-단백질 상호 작용의 유효성 검사에 대 한 무료 접근 이며 감염을 통해 바이러스 성 게놈을 추적 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리 예상 대기 시간 및 재 조직를 포함 하 여 herpesviral 감염의 어떤 양상 든 지 공부 하 고 다른 DNA 바이러스 연구를 이러한 접근 더 수정 될 수 있습니다. 또한, 5-ethynyl uridine로 (EU) RNA 바이러스 성 게놈의 분석에 대 한 허용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MRC-5 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&amp;nbsp; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td></tr><tr><td>600 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 stock</td><td></td><td></td><td>Stocks with titers greater than 1x10&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; PFU/mL work best</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&amp;nbsp; column (PD-10 Desalting Column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;acute;-Ethynyl-2&amp;acute;-deoxycytidine (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2&amp;acute;-deoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dilute to 1x in sterile water before use)</td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &amp;deg;C for up to 1 month</td></tr><tr><td>(+) Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td></tr><tr><td>Biotin azide</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C for up to 1 year&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Click Reaction Mix</td><td></td><td></td><td>Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td></tr><tr><td>Freezing buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &amp;mu;L 50x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B1</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B2</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B3</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli sample buffer</td><td></td><td></td><td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&amp;nbsp; &amp;deg;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td></tr><tr><td>Cap locks for 1.5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standard western blotting reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Prepare 3% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10337</td><td>Prepare according to manufactorer&#039;s protocol</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 year</td></tr><tr><td>Mouse anti-ICP8 primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-bicarb solution</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope equipped with imaging software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blocks</td><td></td><td></td><td>65 &amp;deg;C and 95 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

이 프로토콜의 목표를 포진 심 플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)의 식별에 감염 된 세포에서 DNA 관련 바이러스 이며 여 세포질 단백질 질량 분석. 바이러스 성 유전자와 상호 작용 하는 단백질 감염의 결과 결정에 있는 주요 역할 비록 바이러스 성 게놈 관련 단백질의 포괄적인 분석 이전 가능 되지 않았습니다. 여기 감염 된 세포에서 HSV-1 유전자의 직접 정화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 DNA 복제 alkyne 기능 그룹을 포함 하는 수정 된 세포핵으로 선택적으로 표시 됩니다. 레이블이 지정 된 DNA는 다음 구체적으로 그리고 돌이킬 수 태그 biotin 통해 구리 (I) 아 지 드의 공유 첨부 파일을 통해-아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 클릭 반응 촉매. Biotin 태그 DNA streptavidin 입히는 구슬에 정화와 관련 된 단백질은 eluted 질량 분석에 의해 확인 된. 이 메서드는 선택적 대상 지정 및 HSV-1 복제 포크 또는 복잡 한 생물 학적 환경에서 전체 게놈의 격리 수 있습니다. 또한,이 방법의 적응은 herpesviral 감염의 다양 한 측면의 다른 DNA 바이러스의 유전자 검사의 수사 허용 하 고 있습니다.

세포에서 DNA의 정화에 대 한 클릭 화학을 사용 하 여 먼저 iPOND 메서드21에 의해 달성 되었다. IPOND의 목적은 정화 관련된 단백질의 id에 대 한 세포 복제 포크입니다. 우리는 특별히 감염 시 vDNA 단백질 상호 작용 연구에이 기술을 적응 시켰다. EdC (그림 1)와 함께 동기화 된 감염, 바이러스 성 게놈을 접근의 조작 선택적 분리와 vDNA의 ?...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine. 이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

비디오: Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

생물학

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, causing delays in treatment and further spread of the virus. Developing new sensors that can inform on the infectability of clinical or environmental samples will meet this unmet challenge. However, very few methods can obtain sensing molecules that can recognize an intact infectious virus and differentiate it from the same virus that has been rendered non-infectious by disinfection methods. Here, we describe a protocol to select aptamers that can distinguish infectious viruses vs non-infectious viruses using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). We take advantage of two features of SELEX. First, SELEX can be tailor-made to remove competing targets, such as non-infectious viruses or other similar viruses, using counter selection. Additionally, the whole virus can be used as the target for SELEX, instead of, for example, a viral surface protein. Whole virus SELEX allows for the selection of aptamers that bind specifically to the native state of the virus, without the need to disrupt of the virus. This method thus allows recognition agents to be obtained based on functional differences in the surface of pathogens, which do not need to be known in advance.

We provide a protocol that can be generally applied to select aptamers that bind to infectious viruses only and not to viruses that have been rendered non-infectious by a disinfection method or to any other similar viruses. This opens the possibility of determining infectivity status in portable and rapid tests.

감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

생체공학

<meta charset="utf8"></head><body>Dual-Reporter 및 Multiplex 기술을 사용한 SARS-CoV-2 분석

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Advancing Antiviral Strategies Through Novel Immunocapture and Mass Spectrometry Techniques (새로운 면역포획 및 질량 분석 기법을 통한 항바이러스 전략 발전)

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

요약

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탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

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