우리는 protozoan 세포 감염에 대한 템플릿을 제공하는 박사 크레이그 로이 박사 다리오 잠보니 감사드립니다. 원고의 중요한 검토 박사는 룰루 Cambronne, 우리는 박사 Jagdeep Obhrai 박사 Georgiana 퍼디 박사 프레드 Heffron 및 장비와 시약에 대한 토드 Wisner 감사드립니다. 유동 세포 계측법은 OHSU의 유동 세포 계측법 공유 자원 시설에서 수행되었다. 이 작품은 오리건 주와 NIH 보조금 R21 AI088275 (EDC)의 의학 연구 재단의 교부금으로 일부 지원되었다.

1. 프라이밍 단계 감염에 대한 Legionella pneumophila의 문화의 작성 <ol><li> 모든 L. 변환 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 인코딩 플라스미드 pAM239과 분석에 사용 pneumophila의 변종은 녹색 형광 단백질 (GFP) 28 inducible. 연속은 철과 시스테인로 박테리아 변종은 숯불 효모 추출물 한천 (CYEA)는 6.25 μg / ML chloramphenicol (CM) (플라스미드 유지 보수 용)과 72에 품다를 포함하는 버퍼 N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic 산을 (ACES) 보충 37 번 시간 ° C. </li><li> 보충 ACES에 박테리아 스트레인의 inoculum는 6.25 μg / ML의 CM과 1 밀리미터 IPTG로 (예) 효모 추출물의 국물을 버퍼 전송 37에 궤도 셰이커에 고정 단계 (O / N)으로 육성 ° C. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 체외 문화에서의 GFP 발현을 확인합니다. 덮개를 유리 슬라이드에 문화의 10 μl를 전송슬립와 GFP의 여기 / 방출 큐브 (AMG EVOS 층)와 60X 목적을 사용하여 이미지입니다. </li><li> 멸균 H 2 O를 사용 1시 10분에 체외 문화의 각 100 μl 나누어지는을 희석 1 ㎜의 IPTG, 6.25 μg / ML의 cm 물과 빈 네 100 μl를 사용하여 미디어를 확인합니다. 분광 광도계를 사용하여 dilutions의 OD600 측정 (바이오 RAD 스마트 사양 플러스)를보십시오. 체외 문화에 각각에 대해 나 역시 = 20에서 잘 감염에 볼륨이 필요한 계산 : V = [(아메바 시드) × - 나] / [OD 600 X (희석 계수) × (상수)] = [(1 X 10 6 ) × (20)] / [OD 600 X (10) X (1 × 10 6)] = 2/OD 600. 박테리아의 농도는 OD 600에 따라 결정된다 = 1.0 = 1 × 10 9 CFU / ML. </li></ol> 2. Acanthamoeba castellanii를 사용하여 프라이밍 단계 감염 <ol><li> 유지 RT에서 175cm 두 플라스크에 ATCC 712 PYG 매체에 amoebae을 배양. </li><li> amoebae 막에서 미디어를 교체tures 박테리아 액체 문화를 시작하기 전에 24 시간. 같은 날 액체 박테리아 문화가 시작되며, 수집하고 hemocytometer를 사용하여 가벼운 현미경에 셀을 계산합니다. </li><li> 1 개 10 6 세포 / ML의 최종 농도에 새로운 미디어 amoebae을 희석. amoebae 1 ML의 aliquots로 씨는 12도 세포 배양 접시 RT O / N.에서 반복 pipettor과 품다를 사용하여 </li><li> 부화 후, 1 ML 멸균 PBS는 10 ML 혈청 학적의 피펫과 피펫 수동 보조를 이용한 3 배 12도 세포 배양 플레이트의 우물을 씻는다. </li><li> PBS의 흡인 후, 1 ㎜의 IPTG와 각도에 6.25 μg / ML cm로 감염 미디어 (ATCC 712 PYG 미디어 마이너스 포도당, 펩톤, 그리고 효모 추출물)의 1ml를 추가합니다. 1 시간에 RT에있는 접시를 품다. </li><li> 나 역시 = 20에서 우물을 감염. 5 분 (Eppendorf 5810R) 400 XG에서 판을 원심 분리기 5 분에 37 ° C의 물을 욕조에 떠. 37 ° C, 18 시간에 대한 5퍼센트 CO 2 인큐베이터로 판을 전송합니다. </li><li> 박테리아의 세포 용해와 수확을 호스트하기 전에 형광 현미경에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 감염을 확인합니다. </li></ol> 3. 대상 셀 무대 감염에 대한 THP-1 세포을 퍼 뜨리고 <ol><li> (사전 액체 박테리아 문화를 설정하고이 과정을 24 시간을 시작합니다). 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI 1640 미디어 가까운 confluency에 75cm 두 문화 플라스크에 THP-1 세포를 배양. </li><li> hemocytometer를 사용하여 정지 세포 수를 계산, 1 × 10 6 세포 / ML의 농도 10 % FBS, 100 NG / ML phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA)를 RPMI 1640 미디어 THP-1 세포를 희석 , 및 12도 세포 배양 접시에 1 ML aliquots에서 판. 37 48 시간의 번호판을 길러 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 4. 프라이밍 단계 감염 후 대상 셀 무대 감염 박테리아의 처리 <ol><li> 중이오 amoebae에서 미디어를 대기음. </li><li> 를 Lysemoebae는 10 분 동안 RT에서 얼음 차가운, 멸균 초 필터링 (UF) H 2 O와 품다 500 μl을 사용합니다. </li><li> 풀 유형을 변형하고 형광 플레이트 리더를 (분자 장치 Spectramax 쌍둥이 EM)을 사용하여 풀링 된 lysates 각각에 대해 E 512 nm의 측정을에 따라 lysates. </li><li> - + 0.0019 calcOD 600 = 0.0008 (lysate 배경 E 1024) : 풀링 된 lysates에 대한 OD 600 측정을 계산합니다. 수식이 이전 OD 600 L.의 dilutions의 E 512 nm의 측정을 모두 직접 비교를 그래프화할 수에 의해 결정되었다 체외 문화에 고정 단계 (그림 1 *)에서 pneumophila는 야생 타입의 표현 GFP. 감염된 아메바와 같은 실험 조건에 따라 감염되지 않은 아메바의 lysates은, 빈로 사용 방정식에 포함 된 보정 값 (예를 들면 lysate 배경) 제공됩니다. 볼륨 필요한 t에서 잘 감염 O - 나 = 20 각 lysate 수영장에 대해 계산됩니다 V = [(THP-1 시드) × - 나] / [calcOD 600 X (상수)] = [(1 X 10 6) X (20)] / [calcOD 600 X (1 × 10 6)] = 20 / calcOD 600. </li><li> PBS로 3 배 THP-1 세포를 씻어 각도에 1 ML 신선한 RPMI 1640을 (10 % FBS)를 추가합니다. 37 번 1 시간에 품다 THP-1 세포 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 풀링 된 lysates를 사용하여 - 나 계산에서 THP-1 세포를 감염. 우물 일련의 흐름 cytometric 분석을위한 대조군으로 제공 감염되지 않은 상태로 유지 할 수 있습니다. 프라이밍 단계의 처리는 이하의 30 분에 완료해야합니다. lysates는 감염되기 전에 박테리아 유전자 발현의 변화를 제한하는 얼음에 보관됩니다. </li><li> 판을 원심 분리기, 온도를 높이 떠 있으며, 프라이밍 단계에서와 같이 품다. </li><li> 한 시간 후 감염, 흡인하여 미디어를 제거하고 세포 박테리아를 제거 할 수 PBS로 3 배 우물을 씻는다. </li><li> fre 1 ML을 추가쉬 RPMI 우물에 1,640 (10 % FBS)과 보육에 판을 반환합니다. 바로 미디어 교체 후 시간은 시간 제로 (T 0) 역할을합니다. 37 14-16 시간의 THP-1 세포를 배양 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 5. 실험 분석 5.1 라이브 셀 이미징 감염된 10X에서 형광 현미경 (AMG EVOS 층)를 사용하여 우물 또는 20X 배율 (그림 1A-D) 이미지. 이미지는 프라이밍 단계 및 대상 셀 무대 감염 모두에서 감염의 수준을 결정하는 중 질적 또는 양적 비교할 수 있습니다. 5.2 유동 세포 계측법 <ol><li> 다른 감염의 방출 봉우리는 유동 세포 계측법 (BD FACS Calibur)로 비교할 수 있습니다. 감염된 THP-1 세포를 Trypsinize 부드럽게 피펫으로 PBS에 혼합하여 우물에서 그들을 씻어. </li><li> 2 1800 XG 15 ML 팔콘 튜브 및 펠렛에 풀 변형 유형으로 세포를테이블 탑 원심 분리기에 분. </li><li> 1 ML PBS에서 알약을 일시 중지하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 1800 X g (Eppendorf 5424)에서 중지를 원심 분리기 1 ML PBS에서 산탄에게 다시 일시 중지합니다. 결과 현탁액이 높은 흐린 경우 (OD 600 ≥ 1.0) 사람들은 흐름 cytometer의 라인 막힘을 방지하기 위해 추가 PBS (1시 3분)에 희석해야합니다. </li><li> 흐름 cytometer의 평균에 대한 및 샘플 주사 사이의 세척 단계 살균 필터 PBS를 사용합니다. 이전 대상 셀 감염 샘플의 주입에 감염되지 않은 대상 세포의 전진 /면 분산시킵니다. </li><li> 488 nm의 레이저 여기와 FL1 채널을 사용하여 각 조건에 대해 총 20,000 이벤트를 수집합니다. </li><li> 게이트 포스트 캡처 전지 인구는 감염되지 않은 세포와 막대 그래프의 플롯 형광 강도 (FlowJo) (그림 1E)를 제외 할 수 있습니다. </li></ol> 5.3 CFU 도금 <ol><li> 효율성 O를 검사유동 세포 계측법에 수확 세포의 CFU 도금에 의해 F 감염. 초 필터링 H 2 10 -1에서 O, 10 -2, 10 -3에서 샘플 시리얼 dilutions을 준비합니다. </li><li> 6.25 μg / ML의 CM 각 희석 CYEA 판의 1 / 3로의 플레이트 20 μl. </li><li> 72 시간에 37 ° C에서 접시를 품다. </li><li> 이쑤시개와 셀 카운터를 사용하여 식민지를 계산합니다. </li></ol>

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제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

박테리아 유전자 발현이 밀접하게 생활주기의 진행과 주변 microenvironment의 신호에 응답의 조합을 통해 제어됩니다. 이러한 L. 같은 Vacuolar 병원균 phagosome에 compartmentalized 때 pneumophila는 호스트 세포 유래 단서의 다양한 응답 할 수 있습니다. 숙주 세포에 영양소를 고갈의 집단 결과, 세균은 이후 숙주 세포 25 성공적인 배포에 필요한 요소를 표현하여 보상. L.는 pneumophila 효율...

수많은 세균 병원체는 세포 내 구획의 생존과 복제 호스트 세포를 이용하기 위해 일반화 된 전략을 적응하고 있습니다. 많은 경우, 병원성 메커니즘은 protozoan과 metazoan 세포 사이의 비슷합니다. 그러나,이 두 microenvironments은 매우 다른과 독성 요인 1-4의 미분 표현 될 수 있습니다. 이 부대 &#39;병 박테리아 Legionella pneumophila는 ubiquitously 5 전 세계적으로 담수 환경과 연결되어 있습니다. 중요한 것은, L. pneumophila는 유전자 6-8을 재배에서 체외보다 다른 protozoan 셀을 종료 세균의 글로벌 유전자 발현 프로파일을 제안, 인간 단핵 세포 병원성 이득의 감염 이전에 protozoan 세포에서 재배. 자연에서 민물 amoebae는 침입 세균의 급속한 확대를 위해 영양이 풍부한 굴레를 제공합니다. L. 인간의 취득 pneumophila는 대개 세균을 포함 오염 된 물방울의 흡입에 따라 결정됩니다. 그것은 가능성이 이러한 방울 항구 protozoan 세포 관련 세균이, protozoan 전지는 기존의 수처리 관행 9,10에 더 강한 위치. 11-13 protozoan 호스트 세포에서 세균의 세포 수명주기와 거의 동일한 방식으로 폐 폐포 대 식세포 진행의 감염. 생존과 진핵 세포에서 복제하기 위해, L. pneumophila 다트 / ICM은 숙주 세포 14-16의 세포 기질에 거의 300 &#39;이펙터&#39;단백질을 제공하는 칭했다 전문 유형 IVb 분비 시스템을 사용합니다. 이러한 효과기 단백질은 집합 적으로 세균 17,18의 복제 허용 구획을 생성하기 위해 셀룰러 프로세스를 파괴하는 기능을 수행합니다. 세포 복수에 결함이있는 변종의 점 / ICM 전송 결과를 구성하는 26 유전자의에서 삭제iplication 19-23. 역사적으로, 개별 이펙터 인코딩 유전자의 삭제는 거의 세포 성장을위한 감쇠 변종이 발생하지 않습니다. 이러한 현상은 중복 기능과 effectors의 paralogous 사본 등 여러 가지 가설에 기인되었습니다. 일부 독성 요소는 호스트 세포 관련 세포 성장 (24)의 맥락에서 표현됩니다. 우리는 특정 이펙터 만 protozoan 감염의 맥락에서 표현 된 경우, 이펙터의 노력이 모두 체외에서 배양 된 야생 타입의 변형과 비교되지 않을 수 rationalized. replicative에서 투과성 단계로 L. pneumophila는 전환이 문화 25 고정 단계에 들어가면서. 위상 전환 표현형은 세포 성장을하는 동안 발생 및 운동성 26 flagella의 조립을 통해 예시되어있는 영양소를 고갈를 나타냅니다. 때문에 L. pneumophila 더 inva입니다protozoan 세포에서 수확 때 sive 및 악성, 우리는 호스트 대 식세포가 발생 될 때 더욱 충실 세균의 병원성 상태를 표현하는 검정을 개발을 모색하고 있습니다. 이를 위해, 우리는 첫 번째 (프라이밍 세포)와 두 번째 (대상 셀) 무대 감염 모두에 대한 적절한 호스트를 수용 할 수있는 다목적 protozoan의 프라이밍 분석을 개발했습니다. 감염 과정은 안정적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 박테리아의 사용을 통해 다루기 쉬운 것입니다. protozoan Acanthamoeba castellanii의 감염 모델은 널리 필드에 27에서 사용되는 방법론을 따른다. 프라이밍 단계 L.에게 들어 pneumophila의 긴장이 표시 &#39;투과성&#39;박테리아를 (그림 1A) 생산 액체 미디어에 고정 단계로 체외에서 재배되고있다. 박테리아는 다음 A.의 monolayers를 감염하는 데 사용됩니다 castellanii 18 시간 동안 세포 생활주기의 후반 단계를 달성합니다. 대형 액포가 포함되어ING 박테리아는 형광 현미경 (그림 1A)를 사용하여이 시점에서 시각화 할 수 있습니다. Protozoan 전지는 다음 lysed되고 lysate에서 발견 한 박테리아는 형광 플레이트 리더를 사용하여 512 nm의에서 방출 측정합니다. 형광은 타겟 세포의 감염 (그림 1, * 상관 관계 곡선)에 대한 다중성 수준의 감염 (나 역시)를 계산하는 광학 밀도와 상관 있습니다. 침공 (T 0) 18 시간 후 침공 (T 18) 후, 대상 세포는 세포 내 박테리아를 대표하는 형광에 대한 평가합니다. 형광은 현미경과 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 할 수 있으며, 가능한 카운트는 식민지 도금을 통해 측정 할 수 있습니다. 프라이밍 분석은 항상 야생 형 L.과 감염에 의해 동반 pneumophila 및 도트 / ICM 유형 IV 분비 시스템 (Δ dotA) (그림 1A)에 결함이 부담. 이 중요한 야생 형 사이의 직접 비교에 대한 내부 통제를 제공합니다감염 과정에 사용되는 차있는 isogenic 돌연변이 변종. 프라이밍 단계 동안 avirulent Δ dotA 변형의 포함은 체외에서 배양 아르 isogenic 돌연변이 변종과 관련된 감쇠 성장 phenotypes의 관찰에 대한 임계 값을 설정합니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>chloramphenicol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP904-100</td>
 <td>antibiotic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1755-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9758-1KG</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATCC medium: 712 PYG</td>
 <td>ATCC</td>
 <td></td>
 <td>growth media for protozoans</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBS</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>SH30256FS</td>
 <td>phosphate buffered saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>activated charcoal</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>C272-212</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>yeast extract</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1422-500</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>peptone</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>211677</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1423-2</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-cysteine, 99%+</td>
 <td>Acros organics</td>
 <td>173601000</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferric nitrate nonahydrate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>I110-100</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>AMG</td>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>fluorescence microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Smart Spec Plus</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-2525</td>
 <td>spectrophotometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5810 R centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22627023</td>
 <td>bench top centrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater plus</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22230201</td>
 <td>repeating pipette</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SpectraMax Gemini EM</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td></td>
 <td>microplate reader</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Softmax Pro 5.3</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>0200-310</td>
 <td>microplate reader software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5424 microfuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22620401</td>
 <td>table top microcentrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast-release pipette pump II</td>
 <td>Scienceware</td>
 <td>379111010</td>
 <td>pipette aid</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FACS Calibur</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td></td>
 <td>flow cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FlowJo 7.6.1</td>
 <td>FlowJo</td>
 <td>license</td>
 <td>flow cytometery software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>polypropylene conical tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.6 ml microfuge tube</td>
 <td>Neptune</td>
 <td>3745.X</td>
 <td>microcentrifuge tubes</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria

대부분의 세포 내 세균 병원균이 있습니다. 환경에서 확산을위한 자연 저수지로 민물 protozoans를 사용하여 Legionella pneumophila, 부대 &#39;폐렴의 원인이되는 에이전트는 먼저 이전 포유류의 대 식세포의 감염 protozoan 세포에서 수확 체외 배양 균에 비해 병원성 이점을 얻게되었습니다. 이 중요한 독성 요소가 제대로 체외로 표현되지 않을 수 있습니다 제안합니다. 우리는 프라이밍 L.위한 다루기 쉬운 시스템을 개발 포유류의 세포 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 Acanthamoeba castellanii을 통해 pneumophila 사전. 모든 독성 요소의 기여는 protozoan의 프라이밍 후 야생 형 박테리아에 돌연변이 변종의 세포 성장을 비교하여 검사 할 수 있습니다. GFP-표현 야생 타입과 돌연변이 L. pneumophila의 긴장은 프라이밍 단계에서 protozoan monolayers를 감염하는 데 사용과 세포 성장의 후반 단계에 도달 할 수 있습니다. 형광 박테리아는 다음이 감염된 세포를 채취와 포유류의 대 식세포에 후속 감염 박테리아의 비교 숫자를 생성하는 분광 광도법에 의해 표준화되어 있습니다. 정량화를 들어, 라이브 박테리아는 형광 현미경, 유동 세포 계측법, 그리고 식민지 도금하여 사용 감염 후 모니터링됩니다. 이 기술은 강조하고 자연 수집 경로에 발생 될 환경을 모방하여 호스트 세포에 의존 유전자 발현의 기여에 의존하고 있습니다. 이 방법은 병원성 우위를 확보하기위한 수단으로 중간 호스트를 사용하는 세균을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

전체 감염 프로세스에 대한 일반적인 결과는 그림 1에 설명되어 있습니다. 야생 형 L.에 감염된 A.castellanii의 monolayers을 그린 셀 형광의 micrographs 라이브 프라이밍 단계 동안 pneumophila는 그림 1A에 표시됩니다. 프라이밍 단계의 성공적인 측정이 전부다에서 GFP이라는 세균으로 채워 큰 액포를 포함하는 호스트 세포의 약 90 %의 인구로 이어질 것입니다. 18 ?...

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K 조회수.  Oregon Health & Science University. 이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

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