This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

관심의 단백질을 발현 안정적인 세포주 1 세대 <ol><li> 열 - 불 활성화 FCS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 용지를 준비 시판 Dulbecco&#39;s은 루타-I, 피루브산 4.5 g / L D- 글루코스로 보충 된 이글 중간 (DMEM)를 수정한다. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미디어 HEK293 세포를 배양. 모든 사흘 세포를 하위 육성. 용지를 제거하고 15 ml의 신선한 매체 세포를 재현 탁. 새로운 75cm 2 세포 배양 플라스크에 넣고 피펫 1ml를 14 ml의 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혈구를 이용하여 세포 수를 분석한다. </li><li> 웰 당 2 × 105 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 HEK293 세포는 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 형질 감염을 위해 형질 전환 시약의 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 사용한다. 형질 전환 시약을 사용하여있는 pEGFP-C2 나있는 pEGFP-C2-CaeB와 세포를 형질. 사용 형질 reag을 따뜻하게 이전ENT과 RT에 필요한 매체. DNA로 형질 전환 시약 : 1 비율 3을 사용합니다. <ol><li> 구체적으로는, 피펫 직접 무 혈청 DMEM 배지 50 ㎕를 형질 감염 시약으로 1.5 μL. 복합체 형성의 경우, 트랜 스펙 션 시약 혼합물을 함유하는 DNA 인코딩 GFP 또는 GFP-CaeB 0.5 μg의 피펫 및 RT에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 적가 방식으로 반응 혼합물을 첨가하여 세포를 형질 감염 24 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 배양한다. </li></ol></li><li> 1 ㎎을 추가 / 5 % CO 2에서 37 ° C에서 GFP 양성 클론의 선택을 위해 네티 ㎖로. </li><li> 1 비율 : 6 일 후, 1 중간 HEK293 상층 액을 품고 96 웰 플레이트에 정렬 유동 세포 계측법에 의해 단일 ​​세포를 분리. 4,966 × g으로 15 분간 원심 분리 하였다 배양 합류 HEK293 세포로부터 HEK293 상등액을 생성한다. </li><li> 다음 날, 배지를 포함하는 1.5와 배지를 대체0; ㎎ / ㎖ 네티. 일주일에 한 번 미디어를 변경합니다. 세포가 컨 플루 언트 단일 층을 형성하는 경우, 24 웰 플레이트로 옮긴다. 1.5 mg의 / ml의 제 네티 함유 배지에서 5 : 1의 비율로 일주일에 두 번 세포를 서브 배양. 마지막으로, 면역 블롯 분석에 의해 GFP 양성 세포의 비율을 분석하고 유동 세포 계측법. </li></ol> 면역 블롯 분석에 의한 안정적인 세포주 2. 분석 <ol><li> 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행. </li><li> PVDF 막 위에시킨다 단백질 (0의 기공 크기.트랜스 - 블롯의 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 정전압에서 45 μm의). </li><li> PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막. </li><li> MPT 4 ㎖에 방지 GFP 항체의 4 μl를 희석하고 4 ℃에서 막 O / N을 품어. </li><li> 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다. </li><li> MPT 4 ㎖의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 접합 이차 항체 0.8 μL와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (2.6에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다. </li></ol> 3. 흐름 사이토를 사용하여 세포를 분석 할 수 있습니다. <ol><li> PBS로 세포를 재현 탁. 순방향 SC를 조정할 음성 대조군으로서 HEK293 세포를 사용atter (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC) 세포 규모되도록. 세포는 이중, 단위 및 세포 파편을 제외하여 살아있는 세포에 게이트를 그립니다. </li><li> 흠없는 세포가 훨씬 FL1 채널 (488 nm의 아르곤 레이저)에 대한 히스토그램의 왼쪽에 있도록 광전자 증 배관 (PMT)의 이득을 조정합니다. </li><li> HEK293-GFP 및 HEK293-GFP-CaeB 세포의 형광 강도를 분석하는 FL1 채널의 히스토그램을 열고 게이트 모집단 만 이벤트를 취득. </li><li> 상업적 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol> 유도 성 발현 벡터 시스템과 안정적인 세포주 4. 형질 <ol><li> 종자 HEK293 세포를 안정적 / 웰의 1 × 105 세포의 밀도로 12 웰 플레이트에서 GFP 또는 GFP-CaeB 표현. </li><li> 19 시간 후 - 시드, 레귤레이터 플라스미드 및 응답 플라스미드 중 인코딩 Bax의 또는 활성화 된 카스파 제 3 세포를 공동 - 형질. <ol><li> 안정된 HEK293 세포를 공동 트랜pWHE125-P 레귤레이터 플라스미드 100 NG (그림 2)와 응답 플라스미드 pWHE655-hBax 또는 pWHE655-revCasp3 (그림 3)과 폴리에틸렌 이민 0.4 μL의 100 NG와. </li><li> 옵티-MEM 배지의 75 μL의 DNA와 폴리에틸렌 이민 형질 전환 시약을 각각 준비하고 실온에서 정확히 5 분 동안 품어. 복합체 형성의 경우, RT에서 15 분 동안 혼합물 모두를 함께 배양한다. </li></ol></li><li> 폴리에틸렌 이민 / DNA 용액 드롭 현명한 세포를 추가하고 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어. </li></ol> 세포 사멸 5. 유도 <ol><li> 트랜 스펙 션 후 5 시간은 배지 1 μg의 / ㎖의 독시사이클린을 첨가하여 프로 - 세포 사멸 단백질의 발현을 유도한다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 18 시간 동안 세포를 인큐베이션. </li></ol> 면역 블롯 분석에 의한 숙주 세포 사멸 6. 분석 <ol><li> 시간 전에 세포 검사광학 현미경 arvesting하는 세포 사멸 유도를 확인합니다. 사멸 세포가 죽어가는 세포를 둘러싸는 세포 자멸 소체의 존재시켜 검출한다. </li><li> 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행. </li><li> 트랜스 - 블롯 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 전압을 일정 PVDF 멤브레인 상에 도말 단백질 (0.45 ㎛, 기공 크기). </li><li> PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막. </li><li> 4 μ를 희석MPT 4 용액에 안티 - 절단 폴리 ADP 리보오스 중합 효소 (PARP) 항체의 L과 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다. </li><li> 4 ML의 MPT에 희석 0.8 μL 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 - 복합 이차 항체와 세포막을 품어. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (6.7에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다. </li><li> 7 ml의 서쪽 오점 스트립 버퍼로 실온에서 30 분 배양에 구속 항체를 제거합니다. </li><li> PBS로 세 세척 / 0.05 % (6.7에서 설명) 트윈 (20) 후, 4 ℃에서 MPT O / N의 4 용액에 안티 굴지 항체의 4 μL와 세포막을 조사. </li><li> (6.7에서 설명) MPT 세 세척 단계 후, 호 0.8 μL와 세포막을 품어rseradish 퍼 옥시다아제 접합 이차 항체는 MPT 4 ㎖에 희석 하였다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, 0.05 % / PBS로 막은 6.7에 기재된 트윈 20 (세 번 세척하고 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화 막 개발 표준 장비를 적용한다. 참고 : 모든 배양 단계가 지정된 시간과 온도에 대한 플레이트 진탕 기에서 수행되었다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

많은 병원성 박테리아는 분비 또는 숙주 세포에 박테리아 효과기 단백질을 분비하기 위해 이동시키다 시스템 항구. 이러한 이펙터 단백질은 박테리아가 생존하고 각 세포의 틈새 내에 복제 할 수 있도록 숙주 세포에서 처리하고 경로를 조절하는 능력을 갖는다. 생화학 활동 및 효과기 단백질의 분자 메커니즘을 이해하면 병원성의 더 나은 이해를 향해 도움 질병을 퇴치하기위한 새로운 치료 도?...

많은 그람 음성 박테리아 병원균의 독성은 진핵 숙주 세포를 납치 전문 분비 시스템에 따라 달라집니다. 박테리아 세포 생화학 다양한 활동을 조절하는 숙주 세포에 박테리아 병원성 단백질 (이펙터) 주입이 분비 시스템을 사용한다. 효과기 단백질의 연구는 호스트 / 병원균 상호 작용의 기본적인 양상에 또한 진핵 세포 (1)의 기초 생물학에 현저한 통찰력을 제공하고뿐만 아니라. 숙주 세포 사멸의 조절은 많은 세포 내 병원체에 대한 중요한 독성기구 것으로 도시되었으며, 세포 사멸을 조절 효과기 단백질의 수는 2-9 확인되었다. 그러나, 이들 활동의 정확한 분자 메커니즘은 많은 경우에 남아 도비. 아폽토시스 프로그램 된 세포 사멸의 형태는 감염 10의 면역 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 사멸에 이르는 두 가지 주요 경로는이확인되었다 : 원형질막 (외인성 사멸)에서 세포 사멸 수용체를 통하여 미토콘드리아 (극한 아폽토시스) 또는 신호 전달의 직접적인 타겟팅. 고유 또는 미토콘드리아 매개 세포 사멸 경로는 세포 내 신호에 의해 트리거 백스와 박,하는 Bcl-2 가족의 두 프로 - 세포 사멸 회원의 활성화를 포함한다. 이 패밀리는 세포 사멸을 조절 11-14 프로 및 안티 사멸 조절 단백질로 구성된다. 백스와 박가 세포질에 시토크롬 C 릴리스의 결과로, 미토콘드리아 외막의 후속 투과성으로 다음의 세포 사멸의 활성화는 올리고머로 연결됩니다. 시토크롬 C의 릴리스는 apoptosome을 15 카스파 제 9의 활성화를 통해 이펙터 카스파 3과 7의 활성화를 시작합니다. 이것은 다른 사람의 사이에서, 세포 표면 (16)에 포스파티딜 세린의 노출 결과, 선택된 기판의 단백질 분해로 연결하고 채널을 프래그먼트 전용 DNase의를 해제romatin (17, 18). 개별 이펙터 단백질 방해 사멸 캐스케이드 내에 유도 발현 시스템 (19)을 사용 위치를 판별하기 위해. 유전자의 조건식을위한 규제 시스템은 세포 내에서 단백질의 기능이나 조직, 기관 및 유기체 개발의 중요성뿐만 아니라, 개시, 진행 및 질병 20-23의 유지 보수시를 분석에 매우 중요한 도구왔다. 전형적으로, 이러한 시스템 테트 금회 24 유도 성 제어 시스템은 인공 전사 부 (도 1 참조)를 형성한다. 하나의 컴포넌트는 전사 활성화 또는 24, 26 사일런을 매개 포유류 단백질 도메인 박테리아 전사 리프레 TetR 25의 융합에 의해 형성 TTA (테트라 사이클린 - 의존성 전사 활성제)라고 인위적 조작 된 전사 인자이다. 2 성분은 하이브리드프로모터, 적어도 TATA 박스 및 전사 개시 부위를 포함하는, 진핵 최소 프로모터로 이루어진, TRE (테트라 사이클린 - 반응 요소)라고 TetR, TETO 24,25 대한 동족 DNA 결합 부위의 다중 반복에 접합. 제 3 성분은 TetR, 테트라 사이클린 또는 독시사이클린 또는 anhydrotetracycline 25 그의 유도체, 하나의 천연 리간드이다. 문화 매체에 리간드 또한시, TetR는 TETO에 대한 친 화성을 ​​잃고 트레에서 해리. 결과적으로, 표적 유전자의 전사가 폐지된다. 형질 전환 유전자 발현, 즉, 단단히 모두 세포 배양 시간 및 용량 - 의존적으로 동물 20,23,24 제어 될 수있다. TTA으로, 도입 유전자의 발현은 항생 물질의 존재를 제외하고는 구조적으로 발생한다. 테트라 사이클린 제 트랜스 expressio 전에, 시스템으로부터 제거되어야하기 때문에 이는 세포 독성 또는 발암 단백질의 연구에서 불리 할 수​​있다N이 발생하고 세포에 표적 단백질의 효과를 모니터링 할 수있다. 이것은 많은 시간이 소요될 수 특히 형질 전환 동물 (27)에, 항상 완전하지 않습니다 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 독시사이클린의 존재에 응답하여 역으로 TetR 변이주 새로운 전사 인자를 생성하는 데 사용 된, rtTA 28 (TTA 역방향). 그것은 단지 TRE에 결합하고, 부수적으로, 독시사이클린의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 시스템, 즉 잔류 leakiness., TRE - 결합 전사 인자의 부재하에 트랜스 유전자 발현, 게놈 통합 사이트 위치 효과로부터의 (ⅰ)을 발생, (ⅱ) TRE 자체 (29), 또는 (ⅲ) 비부터 특이 TTA / rtTA 28의 결합, 추가 전사 사일런서를 도입하여 해결하고, 시스템 (테트라 사이클린 - 의존성 전사 소음기) (30)를 TTS 불린다. 그것은 rtTA (도 1 참조)과 함께 이중 조절기 네트워크를 형성한다.독시 싸이클린이없는 경우, TTS는 트레에 결합 적극적으로 남아있는 전사를 종료합니다. 독시사이클린의 존재 하에서 TTS는 TRE로부터 해리 rtTA 동시에 표적 유전자의 발현을 유도 결합한다. 엄격이 추가 레이어는 활성이 높은 세포 독성 단백질 31-34을 표현하는 것이 필요하다. 이 엄격하게 제어 듀얼 레귤레이터 시스템을 사용하여 세포 사멸 캐스케이드 주어진 이펙터 단백질이 아폽토시스 유도를 방해 할 수 있는지 여부를 분석 할 수 있도록 정의 단계에서 시작될 수있다. 이 방법은 세균 효과기 단백질의 세포 자멸 억제 활성을 연구하기 위해 사용될뿐만 아니라, 프로 - 세포 사멸 또는 독성 단백질의 발현을위한 유도 성 또는 다른 신호 전달 경로와 간섭을 해부 용 수 없다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

여기에 제시된 기술은 신호 전달 경로의 구성 요소와 상호 작용하는 하나의 표적 단백질, 또는 대안 적 소분자 단계를 분석 할 수있다. 방법을 기반으로 한 손으로, 특정 단백질의 발현 유도에 선택된 시그널링 캐스케이드에서 정의 된 소정의 단계에서의 시그널링 이벤트를 개시한다. 발현 된 목적 단백질의 활성이 얻어지는 신호 전달 경로의 판독에 따라, 상류 측에 위치 또는 개시 시그널링 이벤트의 하류 경우 병용 식 반면에, 관심의 유전자의 후 조사자 평가할 수있다. 여기, 세포 사멸 폭포는 프로토콜의 기능을 보여주기 위해 정의 된 신호 전달 경로로 선정되었다. 이러한 Coxiella burnetii 등의 병원균, 박테리아 세포에서의 생존을 보장하기 위해 숙주 세포에서 숙주 세포 사멸 유도 방해 효과기 단백질을 이동시키다 촉진 그들의유기체의 보급. C. burnetii 효과기 단백질 CaeB 효과적으로 UV 광 또는 스타 우로 스포린과 함께 아폽토시스의 유도 후 숙주 세포 사멸을 억제한다. 단계 CaeB는 세포 사멸 신호의 전파를 방해하는 좁히려, 잘 특성화 프로 - 세포 사멸 활성을 선택 단백질은 독시사이클린 유도 방식으로 일시적으로 발현되었다. CaeB이 단백질의 상류 역할을하는 경우, 세포 사멸은 방해받지 않고 진행됩니다. CaeB 하류 작용하면, 세포 사멸을 억제한다. 선택된 테스트 단백질 주요 집행자 프로테아제 인 미토콘드리아의 레벨, 및 카스파 제 3, Bax의 작용에이었다. CaeB는 Bax의 발현에 의해 유도되는 세포 사멸을 방해,하지만 카스파 제 3 식으로. CaeB, 따라서,이 두 단백질 사이의 사멸 캐스케이드와 상호 작용한다.

먼저, GFP 융합 단백질로서 안정적으로 관심 (CaeB)의 단백질을 발현하는 HEK293 세포주를 확립 하였다. 대조군으로서, 안정적 GFP를 발현 HEK293 세포주는 또한 생성 하였다. 및 GFP-CaeB GFP의 발현은 면역 블롯 분석에 의해 확인되었다. 대표적인 면역 (그림 4A)는 GFP와 GFP - CaeB의 안정적이고 명확하게 검출 식을 보여줍니다. 모든 세포가 GFP 또는 GFP - CaeB을 표현 여부 그러나이 분석은 확인할 수 ...

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Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K 조회수.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

연구

면역학 및 감염병학

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

의 양육 및 분사<em&gt; Manduca sexta</em박테리아 독성을 평가하기&gt; 애벌레

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

리슈마니아 아마존과 생체 감염에서 마우스에서 기생충 독성을 평가하기 위해

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...