저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트 Inc의)에 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는 (AS에) R01 HL108880 (OPO에) R01 DK095029과 (TSP에) K99 HL116603 (TSP에) 국립 신장 재단 IG1724 (OPO에) 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13GRNT16220002 및 부여 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다 (DVI에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동.

아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 휴스턴 텍사스 건강 과학 센터의 대학의 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다. 도 1은 조직의 분리 및 처리 과정의 주요 단계를 설명한다. 간단히, PCK 또는 SD 쥐에서 신장 건강이 아닌 다이얼 세관 또는 낭종에서 하나 덕트를 수집 상피 단일 층의 수동 분리를 위해 사용된다. 여기에서 우리는 4-16 주 된 PCK 쥐 10,13에서 신장을 공부했다. 1. 신장 낭종과 연결 세관 (CNT) /의 분리 수집 덕트 (CD) 세그먼트 <ol><li> 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. 동물은 계속적으로 적절한 제작을 위해 모니터링되어야마취의 VEL. 안정적인 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다. </li><li> 개복술을 수행하고 복부 대동맥 (17)를 통해 인산염 완충 식염수 (PBS)와 신장을 세척하십시오. <ol><li> 폴리에틸렌 튜브 카테터 (PE50)을 준비하고 PBS로 가득 주사기 펌프에 연결합니다. 측면 및 장간막과 복강 동맥 분기와 하행 대동맥에 액세스하려면 면봉으로 복부 장기를 이동하는 측면에서 복부에 걸쳐 가로 복부 절개를 한 후, 원격 교육 알바를 따라 피부와 복부 벽을 잘라. 자신의 건조를 방지하기 위해 추가 과정에서 따뜻한 식염수와 내부 장기를 적셔. </li><li> 하나 장간막과 복강 동맥 주위에 합자 (# 1)과 다른 합자 (# 2) 다이어프램에서 대동맥 주위 (넥타이를하지 않는)을 놓습니다. 조심스럽게 분리. 얇은 집게로 주위 결합 조직을 해부하고 두 합자를 배치 무디게하여 abdominalis ~ 3왼쪽 신장 동맥 아래 MM (# 3)과 장골 동맥의 분기점 위 (# 4). </li><li> 합자 # 4 타이 왼쪽 신장 동맥과 합자 # 3 사이의 대동맥 주위 혈관 클램프를 연결합니다. 단단히 카테터를 해결하기 위해 합자 # 3를 사용, 클램프 및 대동맥을 카테 테르를 꽂다하는 합자 # 4 사이에 절개를합니다. </li><li> 클램프를 풀고 혈액 펄스가 올바른 설치를 위해 카테터에 볼 수 있는지 확인하십시오. 6 mL의 속도로 관류 시작 / 분, 합자 # 1, # 2를 묶어, 좌측 신장의 혈관을 절단. 장기가 완전히 희게 될 때까지 1 ~ 2 분 동안 세척을 계속합니다. </li><li> 가위 신장 혈관, 요도 주변 결합과 지방 조직을 절단하는 것은 신장을 수집. 그리고 신장 캡슐에서 짧은 눈물을하고이를 디 캡슐하기 위해 신장을 떼어. 얼음처럼 차가운 PBS로 신장을 놓습니다. 안락사는 개흉술에 의해 확인된다. </li></ol></li><li> 폴리 -L- 라이신 코팅 5 × 5mm 커버 유리 칩을 준비합니다. 커버 GLA를 잘라다이아몬드 연필과 장소 각 유리 칩에 0.01 % 멸균 여과 폴리 -L- 라이신 솔루션의 약 20 μL와 SS. 생리 및 해부 용 시계 포셉 두 쌍을 준비합니다. </li><li> 1-2mm 두께 ~의 조각으로 정면 평면을 따라 면도날과 신장을 잘라. 실체 현미경에서 조각 중 하나를 놓습니다. 조직의 분리 빙냉 염수에서 수행되어야한다. </li><li> 둥근 모양의 캐비티 (그림 2A)와 같은 실체 현미경 하에서 낭종을 찾습니다; 그 벽은 자주 증식 혈관의 저명한 네트워크를 포함하고있다. 사용 뾰족한 집게 단층 영역을 얻기 위해 가능한 한 얇은 낭종 내부 상피층 해부. 폴리 -L- 라이신으로 덮여 유리 칩에 연결합니다. 스티커 폴리 -L- 라이신 표면은 연구자가 단단히 유리의 내부 낭종 층을 배치 할 수 있습니다. 피펫 (그림 2B)에 대한 액세스를 제공하기 위해 혀끝의면을 위로하여 낭종을 노출. </li><li> PCK 또는 SD 쥐 아이를 사용하여비 팽창 된 탄소 나노 튜브 / CCDsegments 18 ~ 21의 분리를위한 유두를 포함 네이 중앙 조각. 참고 : 유두 조직이 피질 이상과 집게로 유두 관 밴드를 잡고 슬라이스가 얇은 분야로 절단 할 수있다 축 반경 방향을 따라 찢어보다 내구성이 있습니다. 개별 세관은 볼 수 있으며 커버 유리 칩 상에 배치 될 인출 할 수있다. </li><li> , 분기점으로 근위 세뇨관과 큰 눈에 띄게 보이는 세포 (그림 2C)보다 높은 투명성을 탄소 나노 튜브 / CCD 세분을 확인하십시오. 마이크로 피펫을 구동하기에 적합한 미세 조작기를 구비 한 현미경을 첨부 tubules와 커버 유리 칩을 배치했다. 유리 가장자리를 선명 가능한 Micropipette에게 분할 오픈 세관를 사용하여 연결하면 (그림 2D) 혀끝의 표면에 액세스 할 수 있도록합니다. </li></ol> 2. 단일 채널 패치 클램프 전기 생리학 <ol><li> 욕 용액 패치 - 클램프 챔버를 채우고 커버 유리 칩을 전송할실에 격리 된 조직과. 패치 클램프 Micropipette과 신뢰성에 셀 (세포 부착) 측정을 위해 7 ~ 10 MΩ의 저항이 있는지 확인합니다. </li><li> 세포 부착 측정을 위해 20 배 증폭기 이득 비율을 설정하고 여덟 폴 베셀 필터가 300 Hz에서 전류를 저역 통과. ENAC 채널 모니터링의 경우, 밀리미터에서 목욕 솔루션, 사용 : 150의 NaCl, CaCl2를 1, 2의 MgCl 2, 10 HEPES (PH 7.4); 피펫 : (140)의 LiCl, 2의 MgCl 2, 10 HEPES (PH 7.4). </li><li> 세포 부착 모드 (10)에 기존의 패치 클램프 실험을 실시한다. 상피 단층의 셀을 선택하고 혀끝 막에 피펫을 접근. 부드러운 흡입을 적용하여 피펫 및 세포막 사이에 고 저항 시일을 형성한다. 고 저항 기가 옴 시일이 형성되면, 유지 전위에서 갭이없는 프로토콜은 관심 채널의 모니터링 활동을 시작한다. </li><li> 기가의 저장 간격이없는 단일 채널 현재 데이터이후 분석을위한 옴 씰. 일반적으로 패치 - 클램프 (18)로 공급되는 셋업 소프트웨어 패키지를 사용하여 상기 채널 이벤트를 분석. 채널의 평균 열린 확률 N이 패치 P O 활성 채널의 개수를 의미 여기서 NPO 같은 채널 활성을 계산한다. 참고 : 30 분 동안 패치 클램프 실험에 고립 된 낭종 또는 세관을 사용합니다. </li></ol> 상피 세포에서 세포 내 칼슘 농도의 3 비례 표면 형광 측정 <ol><li> DMSO에 용해 5 밀리미터의 Fura - 오전 2시을 사용합니다. 각각 500 μL 원뿔 튜브로 나누어지는 원액 (약 10 μL). 최대 6 개월 -20 ℃에서 냉장고에 빛과 상점에서 보호합니다. </li><li> PSS에 30 ~ 40 분 동안 고립 된 낭종 및 분할 오픈 세관을 품어 (MM의 : (145)의 NaCl, 4.5의 KCl, 2의 MgCl 2, 2 염화칼슘 2의 pH 7.35에서 10 HEPES) 5 μM의 Fura-2 오전 염료 0.0을 포함5 % 플루로 닉 산은 아세 톡시 메틸 에스테르를 분산 도움이됩니다. 이를 위해, 로딩 칵테일을 함유하는 3.5 cm 접시 장소 조직, 빛으로부터 보호하고, 실온에서 천천히 진탕 배양한다. </li><li> 부화 후 PSS를 청소하고 더​​ 표면 형광 이미징을 수행하기 위해 현미경으로 조직을 배치하는 미디어를 포함하는의 Fura-2 오전 변경합니다. </li><li> CCD 카메라와 필터 휠을 갖추고 안정적​​인 광원 (단색화 장치)를 켜고 (각 필터의​​ 위치는 필터가 호출 될 때마다 선택된 자체 감쇠 레벨과 연관 될 수있다). </li><li> 밝은 분야에서 조직을 찾을 수 있습니다. 형광 신호의 검출에 전환 신호의 포화를 피하기 위해 감광 필터 및 램프 전력을 이용하여, 광원의 강도를 조정한다. </li><li> 0.125 Hz의 이상의 주파수 380분의 340 nm에서 비율 계량 여기에 조직 샘플에서의 Fura-2 오전 형광을 모니터링합니다. 적절한 resolu위한 40 × / NA 1.3 또는 유사한는 대물 렌즈를 사용하여기 이미지입니다. </li><li> 화상 처리 및 계산 이미지 시퀀스를 가져. 채널을 분할하고 hyperstack 그레이 스케일 모드를 사용하십시오. 여러 관심 지역 (단일 낭종 세포 또는 낭성 조직의 선택 영역)를 선택하고 원하는 데이터 분석 소프트웨어로 각 채널 (340 및 380 ㎚)에 대한 강도 값을 계산; 각 데이터 포인트에서 빼기 배경 강도 값. </li><li> 각 시점의 Fura-들어 오전 2시 340-380 채널의 세기의 비율을 계산한다. 플롯 분산 / 각 지역의 칼슘 과도의 라인 포인트 - 시간의 변화와 계산 평균 / SE 값. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 ARPKD의 쥐의 유전자 모델에서 파생 된 담낭 상피 단층 여기에 기존의 패치 클램프 기술과 표면 형광 칼슘 이미징의 응용 프로그램을 설명했다. 프로토콜은 가장 관심 낭종 (프로토콜 부의 단계 1.5)의 단리 및 전기 생리 학적 연구에 지불되어야하는 세 단계로 구성된다. 이러한 주요 절차는 광범위한 훈련과 인내를 필요로하고, 독자는 한 번에 좌절해서는 안됩니다. 우?...

이온 채널은 세포의 성장과 분화를 포함하여 많은 생리적 기능에 중요한 역할을한다. 상 염색체 우성과 열성 다낭성 신장 질환 (각각 ADPKD과 ARPKD는) 관 상피 세포 기원의 신 유체로 채워진 낭종의 개발에 의해 특징 유전 질환이다. ADPKD는 polycystins 1 세포 증식 및 분화의 조절에 관여 2, 막 단백질을 코딩 PKD1 또는 PKD2 유전자의 돌연변이에 의해 발생된다. 그 자체로 또는 PKD1과 복잡한 PKD2 또한 칼슘 -permeable 양이온 채널 1로 작동합니다. PKHD1 유전자 부호화 fibrocystin (세뇨관 및 / 또는 상피의 극성의 유지에 관여 섬모 수용체 - 관련 단백질과 같은)의 돌연변이는 ARPKD 2 유전 자극이다. 낭종의 성장은 복잡한 현상을 방해 확산 3,4, 혈관 신생 (5), 탈분화 및 극성의 손실을 동반한다관 모양의 세포 6-8의 성만. 담낭 상피 세포에 결함이 재 흡수와 분비 증강은 루멘과 낭종 확장 ​​9,10 유체 축적에 기여한다. 손상된 흐름 의존성 [Ca를 2+] I 시그널링도 PKD 11-15 중 cystogenesis 연결되었다. 여기서, 우리는 하나의 채널 활동 및 PCK 래트로부터 단리 낭성 상피 세포 단층의 칼슘 농도의 패치 클램프 측정하기에 적합한 방법을 설명한다. 이 방법은 성공적으로 상피 나 + 채널 (ENAC) 10의 활동의 특성을 우리가 적용하고 [칼슘 2 +] 나는 칼슘 -permeable TRPV4 및 퓨린 신호 캐스케이드 (13)에 의해 유도되는 과정을 의존성. 이러한 연구에서 우리는 PCK 래트, PKHD1 유전자의 자연 돌연변이에 의한 ARPKD의 모델을 사용 하였다. PCK 변형은 originall의했다스프 라그 - 돌리 (SD) 래트 16함으로써 SD 래트 PCK 균주와 비교를위한 적절한 제어로 사용되는 Y로부터 유도. 그 결과, 동일한 PCK 래트로부터 단리 SD 래트 네프론 세그먼트 및 비 팽창 된 포집 관 모두 낭성 상피 실험 두 가지 비교 군으로 사용할 수.

<table><tbody><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14185</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>AAT Bioquest</td><td>21091</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68&amp;nbsp;</td><td>solution</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Light source</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Lambda XL</td><td>with integrated shutter/filter wheel driver</td></tr><tr><td>Neutral density filters</td><td>Nikon</td><td></td><td>ND4, ND8</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>SFluo&amp;nbsp;</td><td>40/1.3 DIC WD 0.22&amp;nbsp;&amp;nbsp; oil</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor Technologies</td><td>Zyla sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon&amp;nbsp; microscope (inverted)</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Diamond pencil</td><td>Fisher Scientific</td><td>22268912</td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/</td><td>ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition System</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Low Pass Filter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 pole Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Motorized Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microvibration isolation table</td><td>TMC</td><td></td><td>equipped with Faraday cage</td></tr><tr><td>Multichannel valve perfusion system</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10 . 2</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controlled surgical table&amp;nbsp;</td><td>MCW core</td><td></td><td>for rodents</td></tr><tr><td>Binocular stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump-based perfusion system</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyethylene tubing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane anesthesia</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.vetequip.com/&quot;&gt;http://www.vetequip.com/&lt;/a&gt;</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

다낭성 신장 질환 중 낭종 개시 및 확장은 관 모양의 세포 증식, 내강 유체 축적과 세포 외 기질 형성에 이상을 특징으로하는 복잡한 과정이다. 이온 채널 및 세포 내 칼슘 신호 전달의 활성은 관상 상피의 기능을 결정하는 중요한 생리적 파라미터이다. 우리는 갓 신장 낭종 분리 상피 단층 세포 내 칼슘 수준의 패치 - 클램프 기법 및 등록이 이온 채널 활성을 실시간으로 관찰하기에 적합한 방법을 개발 하였다. PCK 래트, 염색체 열성 다낭성 신장 질환 (ARPKD)의 유전 적 모델은, 이온 채널 및 칼슘 플럭스의 생체 외 분석을 위해 여기에 사용 하였다. 여기에 설명하는 하나의 채널 활동 및 세포 내 칼슘 역학을 낭성 단일 층 및 PCK 또는 일반 스프 라그 돌리 (SD) 쥐에서 비 넓혀 세관을 분리하고 모니터링하도록 설계 자세한 단계별 절차입니다.이 방법은 효소 처리를 필요로 갓 격리 상피 단층의 기본 설정에서 분석이 가능하지 않습니다. 또한,이 기술은 세포 내 칼슘의 변화에​​ 매우 민감하고 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성한다. 마지막으로, 고립 된 낭성 상피 더 항체 또는 염료, 각종 생화학 적 분석을위한 차 문화의 준비 및 정제 염색에 사용할 수 있습니다.

cystogenesis 잠재적 ENAC 개입은 ARPKD 뮤린 모델 및 조직 배양 물에서 26-28 22-25 PKD 진행 비정상적인 나트륨 재 흡수에서 시그널링 중단 표피 성장 인자 (EGF)를 관찰 여러 연구에 의해 입증되었다. 예를 들어,은 등 Veizis. 아밀로 라이드 - 민감성 나트륨 + 흡수는 ARPKD (29)의 비 orthologous BPK 마우스 모델에서 CD 세포에서 감소되는 것으로 나타났다. 우리는 최근 낭종에 손상 나?...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.7K 조회수.  Medical College of Wisconsin.  신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다. 

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Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 라이브 영상

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

연구

신경과학

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

발생학

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

생체공학

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

생물학

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

진동 및 이미징 라이브, 진동 절제에 의해 마우스 신장 골반의 그대로 페이스 메이커 영역

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Optogenetic Electrophysiology Recording of Cells with Light-Dependent Ion Channels

Source: Grimm, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55497">Whole-cell patch-clamp recordings for electrophysiological determination of ion selectivity in channelrhodopsins.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, embryonic kidney cell cultures expressing light-dependent ion channel proteins fused with a fluorescent reporter demonstrate the effect of light on ion movement. Whole-cell patch clamp is used to monitor the movement of ions.

1. Setup Prior to Recordings

	Prepare the recording solutions with ion concentrations as indicated in Table 1.&#8203;
	
		Prepare 15 mL of 2 M stock ...