이 프로토콜은 신장 골반의 그대로 심장 박동기 영역을 산출, 요관과 방광으로 소변을 펌프 신장 내에서 부드러운 근육 기관. 신장 골반에서 세포를 격리하는 것과는 달리,이 방법은 신장 골반 맥박 조정기 영역의 시상 환경과 신장 골반 페이스 메이킹을 연구하기위한 보다 생리적 인 준비를 제공합니다. 이 기술을 수행 한 적이없는 개인은 균일 한 섹션을 잘라 투쟁 할 수 있습니다.
처음 사용자는 신장이 진동 단계의 수준이며 절단 과정을 가속화하지 않도록해야합니다. 내부 조직 집게와 내부 해부 가위를 사용하여 내장을 꼬집어 복부 벽에서 들어 올립니다. 동시에 신장을 포함하는 레트로 복막 공간에 접근하기 위해 근위 십이지장과 말단 결장에서 몸에서 무료로 장의 밑면을 잘라.
요관의 말단을 조직 집게로 부드럽게 꼬집고 들어 올립니다. 해부 가위를 사용하여, 주변 결합 조직에서 해방 될 때까지 신장쪽으로 꼬집어 진 요관 아래를 잘라. 일단 신장이 드러나면 개별적으로 추출하십시오.
실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 얼음 차가운 KRB 용액을 채웁니다. 신장을 해부 접시에 옮기고 완전히 침수되었는지 확인합니다. 미세한 스프링 가위와 내부 집게를 사용하여 신장 기저에서 지방 조직을 제거하여 탈구 신장 골반 또는 RP 및 근위 요관을 노출시하십시오.
미세 한 스프링 가위와 집게를 사용하여 기지에서 근위 우초및 탈실 RP의 일부를 제거합니다. 미세 한 팁 집게와 외부 신장 캡슐을 관통, 신장 몸에서 멀리 팁을 앵글링. 각 손으로 집게를 사용하여 캡슐의 느슨한 끝을 꼬집어 나머지 신장 캡슐 멤브레인이 완전히 제거 될 때까지 따로 벗깁니다.
진동 악기의 블레이드 홀더에 면도날을 삽입하고 블레이드 클리어런스 각도를 약 18도로 조정합니다. 텍스트 원고에서 언급한 블레이드 매개 변수를 조정하여 신장 단면 두께가 150 마이크로미터를 초과하지 않도록 하여 칼슘 이온 이미징 실험에 부정적인 영향을 미칩니다. 무딘 끝의 집게를 사용하여 얼음 차가운 KRB 용액에서 준비된 신장을 부드럽게 잡고 제거하십시오.
즉시 신장을 흡수성 용지에 약 2~4초 동안 배치하여 과도한 외부 수분을 제거합니다. 흡수성 종이를 통해 신장을 부드럽게 굴려, 완충종의 모든 면이 건조되어 신장이 진동 단계에 최적의 접착력을 갖도록 합니다. 즉시 진동편 시편 플레이트의 베이스에 청색 화과접착제의 얇은 층을 적용하고 무딘 단조 포셉을 사용하여 신장 요관 쪽을 접착제로 덮인 부위에 내려 놓습니다.
약 10~20초 동안 집게의 평평한 가장자리로 신장 상단에 하향 압력을 부드럽게 적용하여 접착제를 건조시다. 완충용지의 바닥에 표본판을 단단히 고정하고 신장의 상부가 완전히 침지되도록 KRB 용액의 수준을 조정한다. 자동 진동 절개의 경우 신장의 0.5~ 1cm 클리어의 진동칼 블레이드 절단 사이클의 시작 및 끝 위치를 선택하여 전체 신장 평면이 단면화되도록 하십시오.
블레이드가 신장과 접촉하는지 확인하여 자동 절단 과정을 시작합니다. 집게를 사용하여 신장에서 해방되는 섹션을 수집하고 즉시 개별 우물로 옮으려합니다. 단면 프로토콜을 계속하고 PKJ 영역이 더 명백해질 때까지 신장 조각의 PKJ 영역을 식별하기 위해 가벼운 현미경을 사용합니다.
실리콘 엘라스토머 코팅 이미징 접시에 얼음 차가운 KRB 용액을 채웁니다. 개별 신장 슬라이스를 접시에 옮기습니다. 신장 조각 의 주변에 Minutien 핀을 삽입하여 이미징 접시의 바닥에 섹션을 고정하십시오.
이미징 접시를 똑바로 회전하는 디스크 공초점 현미경의 무대에 놓고 즉시 KRB 솔루션으로 침투하기 시작합니다. 낮은 배율 침수 목표 렌즈를 사용하여 신장 슬라이스를 찾습니다. PKJ가 랜드마크를 사용하여 존재하는 슬라이스 의 영역에 이미징 필드를 집중합니다.
PKJ가 위치한 후에는 더 높은 배율 침수 목표 렌즈를 사용하여 관심 영역을 확대합니다. PKJ 벽에서 칼슘 이온 과도 지속 시간의 다른 유형에 관심의 다른 세포를 구별. 관심 있는 세포가 확인되면 레이저 강도를 조정하여 좋은 신호 대 잡음 비율을 산출하고 16~32Hertz 사이의 시간적 샘플링 주파수에서 이미지를 기록합니다.
전체 신장 섹션의 가벼운 현미경 이미지는 단일 PKJ 지역의 별표 색을 보여줍니다. 다중 PKJ 지역은 내부 수질및 탈신장에 가깝게 존재한다. PKJ 신장 동맥 및 PKJ 경계의 위치는 여기에 표시됩니다.
PDGFR 알파 양성 세포에서 GCaMP를 발현하는 마우스로부터의 PKJ 섹션이 여기에 나와 있다. 빈약한 조직 사이 정지된 얇은 PKJ 벽은 신장 동맥과 같은 랜드마크를 사용하여 구별될 수 있습니다. 이 특정 형질 전환 조직에서 GCaMP6f의 발현은 근육과 모험 층 모두에 걸쳐 PKJ의 전체 폭에 걸쳐 확산된다.
PDGFR 알파 GCaMP6f 양성 신장 조각에서, 전형적으로 PKJ 벽의 폭을 통해 확장하는 세포의 네트워크는 형광이며 다양한 기간 및 주파수의 진동 칼슘 이온 과도를 표시합니다. SMC GCaMP3 양성 신장 조각에서, GCaMP3 양성 세포의 층은 근육 층에 존재한다. Spatiotemporal지도는 PKJ 모험에 있는 PDGFR 알파 양성 세포가 장시간 저주파 칼슘 이온 과도를 유도한다는 것을 보여줍니다, SMC는 더 짧은 기간 칼슘 이온 과도를 발사하는 반면.
유사하게, SMC에서 형광 칼슘 이온 신호의 배열은 또한 SMC에서 덕트를 수집하고 진동 칼슘 이온 과도 내 및 주변의 배열을 관찰했다. 이 절차를 시도할 때, 신장은 균일한 신장 조각이 블록에서 해방되는 것을 확인하기 위하여 진동 편면 도중 가능한 한 수준인 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 단세포 격리와 같은 그밖 방법, 면역 히스토화학 및 분자 연구 결과는 신장 골반에 있는 심박동기 기계장치의 우리의 이해를 증가시키기 위하여 수행될 수 있습니다.
