The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.

1. 청소 전지 Sonifier 시스템 <ol><li> 혼 컨버터 사용하여 클로로포름과면의 면봉 사이의 결합을 청소합니다. 또한 금속 부스러기, 녹 또는 산화의 축적을 제거하기 위해 혼과 컨버터의 스레드 경유 또는 미네랄 오일을 적용합니다. </li><li> 기름 스레드를 닦은 다음 조합에서 오일 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 클로로포름을 사용합니다. </li></ol> 2. 셀 Sonifier 재 조립 및 시스템 설정 <ol><li> 컨버터에 혼을 다시 연결합니다. 제대로 시스템을 토크, 컵 (그림 2A)의 바닥에서 경적을 잡아 당겨 컵 어셈블리에서 조립 컨버터와 뿔을 제거합니다. 컨버터 (그림 2B)의 상단에있는 세 개의 작은 구멍 하나 내부 슬롯 렌치를 놓습니다. 그런 다음, 혼 (그림 2B)의 슬롯 부분에 1/2 인치 까마귀의 발 장착 된 토크 렌치를 배치합니다. 의에 조토크 미터는 54.23 N 표시 될 때까지 시계 방향을 tandard. M (그림 2C), 제조업 (16)가 권장하는 토크를. 강화 컨버터를 장착하고 다시 컵에 경적 및 수직 위치에 링 스탠드에 혼과 컨버터를 탑재합니다. 실험 펄스 투약을 위해 시스템을 설정하기 전에 전원을 다시 연결 변환기. </li><li> 펄스 사이의 1 초와 초음파의 1 초를 사용하여 펄스 투약에 대한 시스템을 설정합니다. 다른 투약 모델은 다른 실험 조건을 위해 사용될 수있다. 물 볼륨과 혼 직경과 같은 많은 변수는 잠재적으로이 투약을 변경해야합니다. 상기 세포 샘플 종류, 양 및 농도를 사용하여, 데이터 및 경험적 관찰이 용법의 제형 이끌어왔다. </li><li> 원하는 크기로 시스템을 조정합니다. 이 프로토콜에서, sonosensit의 효능을 렌더링 할 완전한 세포의 파괴를 막기 위해 33 % 및 50 %의 진폭을 사용하여어렵거나 불가능 izers을 측정한다. 참고 : 진폭을 비교 본 연구에서는. </li></ol> 3. 시스템의 강도와 기능을 평가 <ol><li> 샘플 초음파의 레벨 1.5 cm에서 캐비테이션 미터를 잡습니다. 시스템은 예상 된 강도로 실행되고 있는지 평가하는 수치를 참고. 현재 시스템 및 물 수준의 사용, 100-110 W / 33 %의 진폭과 115-125 W / 50 % 진폭 CM 2 cm 2 사이에 기대하고있다. 직접 / W CM 2 캐비테이션 에너지를 나타내는 미터 디스플레이에서 캐비테이션 미터 판독을합니다. 물의 표면에이 판독을 가지고, 그리고 기포가 미터 프로브의 표면에 존재하지 보장. 참고 :이 절차가 뿔 위의 액세스를위한 캡없이 수행되는 것이 중요합니다. 그들은 모든 초음파을 반복 할 필요가 없다. 오히려, 그들은 단지, 세정 재 조립 및 시스템 설정 이후에 수행되어야한다. </리&gt; <li> 완전히 하이드로 센서 몰입하기 위해 물 12.5 mL를 함유하는 샘플 유리 병에 청음기를 놓는다. 링 스탠드를 사용하여 수중 청음기를 일시 중단합니다. </li><li> 파형 특성을 평가하기 위해 오실로스코프의 입력 하이드로 첨부. 비정상적인 파도가 제조업체의 사양에서 시스템의 주파수를 변경할 수있는, 명확한 사인파의 오실로스코프를 검사합니다. 캐비테이션 미터와 오실로스코프 모두 결함이있는 시스템 또는 부적절한 조립을 가리킨다 비정상적인 파도가 표시됩니다 주파수 읽기, 만 오실로스코프를 제공합니다. </li></ol> 세포 및 중간 4. 준비 <ol><li> 240 ml의 Iscove 개변 Dubecco 배지 (IMDM), 50 ml의 소 태아 혈청을 사용하여 배지를 준비. 온도의 급격한 증가는 혈청 안정성을 손상시킬 수 있으므로, 온수 욕에서 소 태아 혈청을 해동하지 마십시오. μL 젠타 마이신 50 ㎎ / ㎖ (240) 및 5 ㎖ 페니실린 결합/ 표준 문화 플라스크에 100 배를 스트렙토 마이신, 및 매체에 추가 할 수 있습니다. 4 ° C에서 매체를 저장합니다. </li><li> 종자 U937 세포에서 ~ 4 × 10 준비된 매체를 이용하여 25cm이 플라스크에서 104 세포 / ㎖. TC20 세포 계수기를 사용하여 농도에 대한 세포 생존율을 평가하고, 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 및 15-20 μL의 트리 판 블루 15-20 μl를 배치하고 내용물을 혼합하여 트리 판 블루 배제. Pipette15-20 TC20 샘플링 슬라이드에이 혼합물의 μL, 그리고 TC20 셀 카운터에 슬라이드를 배치하여 카운트를 시작합니다. </li><li> 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 품어 및 트리 판 블루 배제하고 TC20 셀 카운터를 사용하여 세포 생존 확인합니다. 세포는 적절한 농도 및 / 또는 적당한 시간 프레임 sonosensitizers, 전사 20 ㎖ 유리 섬광 바이알로 배양 플라스크로부터 세포를 3 ㎖로 처리되었을 때. 이 프로토콜에서, 48 시간 동안 U937 세포를 성장 후 0.5, 1, 치료30 분 동안 5 mM의 MeβCD 충분히 초음파 이전에 세포의 콜레스테롤을 소모합니다. </li></ol> 5. 셀 초음파 처리 <ol><li> 드가는 탈 진공 흐너 플라스크를 사용하여 증류수. 컵 호른에 물을 전송하고, 호온의 맨 위 15mm의 레벨로 채운다. 초음파 처리는 몇 분의 기간 동안 물이 추가로 탈기를 발생시키고 시스템은 초음파를 샘플링하기 전에 실행하지 않는 경우의 실험 과정 동안의 불일치가 발생할 수있다. 따라서, 초음파를 샘플링하기 전에 ~ 7 분 동안 시스템을 실행. </li><li> 유지 장치에 세포를 포함하는 섬광 바이알 첨부. 그리고, 컵 호른의 상단에 유지 장치를 부착하고 (슬라이딩기구를 이용하여 물 표면에서) 호온의 상단에서 15mm의 상승으로 설정. </li><li> 세포는 통상적으로 1 초 다음 각 펄스 사이에서 간격으로 초음파 세 1 초 펄스들을 이용하여 초음파 처리된다. 이를 위해프로토콜, 전술 한 펄스 투여를 사용하여 33 %와 50 %의 진폭에 초음파 처리 세포. </li></ol> 6. 손상 후 초음파에 대한 세포 평가 <ol><li> 트리 판 블루와 TC20 셀 카운터를 사용하여 손상과 생존을위한 일시 중단 된 세포를 평가합니다. 또한, Z2 계수기를 사용하여 샘​​플을 분석한다. (1 200 비율) Z2 카운터 분석을 위해, 20 ml의 식염수로 100 ㎕의 세포 현탁액을 피펫. 분석 전에, 등장 성 식염수를 이용하여 적어도 두 Z2 입자 분석기의 개구를 플러시. 카운터 홀더에 Z2 샘플을 놓고 카운트를 시작하기 전에 조리개에 플랫폼을 올립니다. </li><li> 제조자에 의해 제공된 소프트웨어를 사용 TC20 및 Z2 카운터로부터 데이터를 획득. 세포 손상, 생존, 그리고 초음파에서 세포 파편의 창조에 대한 이러한 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 7. XTT 분석은 세포 생존을 결정하고 치료 U937과 THP1 세포의 미토콘드리아 활동에 <ol><li> 프리 오XTT 분석법에 R은 동일 조건에서 U937과 THP1 세포 성장. 종래의 초음파로 30 분간 MeβCD 동일한 농도 범위로 세포를 전처리. 세포는 이제 하나 1-3 초 펄스의 범위를 사용하여 초음파 처리 된 것을 제외하고 이전과 동일한 초음파 매개 변수를 사용하여 평가할 수는 XTT 키트 손상의 범위를 개발 한 초 이격. 참고 :이 단계의 대부분은 XTT 키트 설명서에서 직접 촬영에만 관심이 실험실의 편의를 위해 반복된다. </li><li> 10 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 성장 배지에 재현 탁 된 세포 펠렛은 전술. ~ 1 × 105 세포 / ml로 재현 탁 세포. 다음 (100) 중으로의 평탄한 바닥 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에 웰 당 μL 및 종자에서 U937 세포는 별도의 96 웰 플레이트를 이용 THP1 세포에 대해 반복. 전체 성장 매체 혼자 빈 흡광도 수치의 100 μl를 포함하는 3 제어 우물을 포함합니다. 이어서, 2 판을 배양 접종4 시간. </li><li> XTT 시약 및 사용 전에 37 ℃에서 활성화 시약의 두 분액 제상. 소용돌이 분취 량을 부드럽게 명확한 솔루션을 얻을 때까지. 하나의 96- 웰 미세 역가 플레이트 분석법을위한 충분한 활성화 XTT 용액을 형성 XTT 시약, 5.0 ml의 활성화 시약 0.1㎖를 추가. 다른 판의 과정을 반복합니다. </li><li> 각 웰에 활성화 된-XTT 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 세포 배양 CO 2 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 부드럽게 고르게 긍정적 인 우물에 오렌지 색을 배포 할 수있는 잠복기 다음 판을 흔들어. 마이크로 타이 터 플레이트 판독기를 사용하여 450-500 nm의 파장 사이의 파장에서 세포를 포함하는 분석 웰 및 빈 배경 대조군 웰의 흡광도를 측정한다. </li><li> 어느 블랭크 대조군 웰을 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 판독기 없거나 특정 결과로부터 그 평균값을 뺀다. waveleng 다시 모든 분석 우물의 흡광도를 측정한다제 630-690 nm의 사이에 얻은 450-500 nm의 값에서 값을 뺍니다. 주 :이 두 번째의 흡광도 측정 분석 결과로부터 비 특정 수치를 제거하는 데 도움이. XTT 분석은 두 세포주 네 번 반복 하였다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

최적의 결과를 달성하기 위해 특별한주의가 신중하게 샘플을 놓고 컨버터 혼 노조를 청소주의해야한다. 호온의 샘플 위치는 혼으로부터 거리를 변경하는 것은 샘플이 노출되는 에너지를 변경할 수 있으므로 탄성 초점을 변경 한 바와 같이, 일치 셀의 파괴를 얻기 위해 중요하다. 컵 호른 내의 음향 에너지는 최대 캐비테이션의 위치를​​ 찾기 위해 캐비​​테이션 미터를 사용하여 매핑 될 수있다. 또한, 오실로스코프와 함께 캐비테이션 m은, 세포에 노출되는 소리의 강도뿐만 아니라, 파형의 균질성을 결정하기에 매우 중요하다. 따라서 이러한 장비는 시스템에 문제를 감지하고 문제 해결에 시스템 불안정을 해결하기 위해 필요할 수있다을 결정하는 데 도움이되어야한다. 앞서 언급 한 바와 같이, 저주파 시스템에 대해 실행되지 않을 경우 상기 실험 내내 탈기 물 작용할 수도초음파를 샘플링하는 데 몇 분 전에. 이 초기 실행은 실험 기간 동안 상대적으로 탈기 초음파 매체 따라서 일관성있는 결과를 산출하기 위해 수행해야합니다. 감작의 진정한 범위는 평가하기 어렵다 같이 sonosensitizers의 효능을 평가하는 경우뿐만 아니라, 세포에서 또는 근처에서 최대 진폭 초음파 처리되어서는 안된다. 40 kHz의 시스템에서 33 %의 진폭을 사용하는 것은 주목할만한 손상을 생산하는 등의 이상적인 설정이지만, U937과 THP1 세포 (그림 7)에 대해 MeβCD으로 입증 된 바와 같이, 그 효능을 입증하는 sonosensitizers 충분한 공간을 제공합니다. 이러한 데이터는 또한 MeβCD이 용량 의존적으로 저주파 초음파 여러 백혈병 라인을 민감하게 확인합니다. 초음파 분해를 통해 생성되는 17-19 intramembrane 캐비테이션 기포의 증거를 나타내는 8 MHz의 0.75 MHz의 주파수 범위 내에서 더 높은 빈도로 수행 실험있어왔다. 그러나 questio여전히 초음파 - 유도 된 세포 용해 (18)의 정확한 메커니즘에 관해서 남아 NS. 우리는 저주파 초음파 (15), 다른 실험실 20 입증 현상을 이용하여 세포 골격 유동화 사이의 링크를 도시하고 소닉 감도를 증가하고있다 (21). 또, 이러한 사이토 B로서 미사 교란 에이전트가 여러 백혈병 초음파 감도를 강화시킬 수 있음을 발견 하였다 액틴의 중합 반응의 억제를 제안 라인,하지만 hHSCs 또는 22 백혈구, 특히 관심이 sonosensitizing 메커니즘 수있다. 또한 현저 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프 성 백혈병을 포함한 시험 관내 백혈병 다른 종류의 초음파의 감도를 증가시킨다, 즉 빈 크리스틴, 튜 불린 중합에 23, 24을 억제 미세 소관 붕괴 제를 관찰했다. 대조적으로, 세포 골격 성분을 안정화 골격 지시 제 (파클리탁셀D의 jasplakinolide)는 세포 용해 (22)의 낮은 가격으로 반영, 초음파에 세포를 방지하기 위해 나타납니다. 종합 해 보면, 이러한 데이터는 종양 세포의 세포 골격 성분을 유동화 가설 실제로 SDT (25)의 효능을 높이는 중요한 요소이다 지원한다. 본 연구는 또한 콜레스테롤 고갈 MeβCD 처리 된 U937 세포가 현저하게 40 kHz에서 초음파에 민감로 추가로, 종양 세포의 초음파 감도를 강화시킬 수있는 또 다른 방법이 될 수 있음을 보여줍니다. 우리의 초음파 프로토콜 체외에서 현저한 항 종양 활성을 증명하고 있지만, 현재의 방법은 초음파에 사용되는 유리 병에 맞게 할 수있는 문화와 작은 척추 동물 모델에서 작동하도록 제한된다. 우리는 안전하게 펄스 저주파 초음파 (20 kHz에서)를 사용하여 초음파 처리 할 수​​있는 제브라 피쉬를 보여 주었다, 및 화학 요법 제에 자신의 허용 오차를 정량적으로 비교입니다그 담암 제브라 제안 뮤린 모델 (26)에 의해 허용 투여 량은 이들 프로토콜의 생체 내 항 종양 활성을 평가하기위한 예비 조사에 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 종래 포유 동물 모델의 초음파로 화학 요법 제를 투여하는 것은 MHz의 범위 (1)에보고되어 있으며, 이러한 프로토콜은 예상 저주파 초음파뿐만 아니라 콜레스테롤 파괴 및 세포 골격 - 지향 제를 포함하도록 확장 될 수있다. SDT 이런 형태의 잠재적 인 임상 응용 프로그램은 항 종양 제를 정맥 투여 (IV) 혈액에 앞서이 초음파 (25) 제거되고있는 혈액의 체외 초음파를 포함 할 수있다. 이 방법은 인체 해부학로 인한 잠재적 인 사운드 장벽을 제거하고, 고형 종양에서 백혈병 모세포뿐만 아니라 전이를 손상시킬 수있는 효과적인 방법 일 수있다. 그것은 그 콜레스테롤 파괴 및 세포 골격 지시 에이전트가 할 수 있었던 것도 가능하다이미이 치료 방법의 효능을 개선하기위한 시도는 병원에서 시험되고 HIFU 프로토콜에서 사용될. 본 연구에 기재된 방법이 유틸리티를 향상시킬 수있는 잠재력 sonosensitizers의 값 및 상기 시스템을 평가 정제 할 수있다. 그러나, 전원의 품질, 탄성 초점 및 컨버터 중 개인차 포함한 초음파 심지를 사용할 때 고려 될 수있는 많은 변수가있다. 따라서, 향후 연구는 음파를 시각화하고 결과에 미치는 영향을 이해에 초점을 맞출 것이다. SDT는 체외에서 세포 용해를 향상시키기 위해 표시하고 취득 포유 동물 모델에서 생체 데이터에 더 많은 경우 임상 적으로 가능한 것을 입증 할 수있다. 여러 에이전트와 초음파를 포함하는 악성 세포의 다른 잠재적으로 악용 특성뿐만 아니라 다양한 결합 된 양상을 조사 실험은 우리 실험실에서 계속합니다.

초음파는 인간의 청각 능력의 상한보다 큰 주파수 (~ 20 kHz에서) 한 어떠한 진동 음압 파를 말한다. 20-60 kHz의 범위에서 저주파 초음파는 조직 파쇄, 핵산 추출을 위해 세포 시료를 조제 에멀젼을 생성하는 수단으로 실험실에서 이용하​​고, 다른 시험 다양한되었다. 저주파 초음파의 유틸리티는 다양한 재료를 청소, 용접 산업 설정을 확장하고, 재료 처리되었습니다. 시판 초음파 발생기는 100-1,200 W.에서 램프 전력을 18-60 kHz의 범위의 주파수에 와서 본격적인 초음파가 긴 진단 이미징을위한 임상에 사용 하였지만, 그것은 단지 최근 중요한 요법으로서 적용되었다. 초음파 ≥1 MHz의 일에 안전하게 요로 결석 (신장 결석) 및 담도 결석을 방해 (돌 수있다환자의 전자 담낭이나 간에서)의 증상 2,3를 줄일 수 있습니다. 체외 충격파 쇄석술 (ESWL)로 알려진이 방법은 널리 병원 (백만 명 이상의 환자가 혼자 미국에서 ESWL으로 매년 4 처리)에 적용하고, 양상을 제공을하는 비 침습적으로 결석을 분해한다 외부 적으로 적용, 집중, 높은 강도 음향 펄스 2-4의 사용을 통해 최소한의 부수적 인 피해. 때문에 높은 강도의 초음파에 의해 생성 된 고유 직접 전단력뿐만 아니라, 캐비테이션 버블에, 이들 방법론이 고강도로 알려진 접근법에서 거세 저항 전립선 암 및 췌장 선암의 치료를위한 암 치료에서 조사 된 집속 초음파 (HIFU ) 5-8. ESWL 매우 유사한 방식으로, 여러 HIFU 초음파 빔을 사용하고, 60 ° C 또는 HIG의 온도를 생성하도록 선택된 초점 영역에 초점을 맞추고 그들을그녀 표적 조직 5 응고 괴사를 유도하는 음향 에너지의 사용을 통해. 열 제거의 다른 양식은 (고주파 열 치료 및 마이크로 웨이브 절제) 존재하지만, HIFU는 유일한 비 침습적 온열 양상 5 인 것을 이러한 방법에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. HIFU는 병원에서 혼합 된 결과를 달성하고 현재 임상 시험 8-11에서만 사용할 수있다. 그럼에도 불구하고,이 달성 제한된 성공 및 전임상 포유 동물 모델에서 얻은 생체 데이터는 매우 유망한 암 치료 초음파의 가능성을 증명 하였다. HIFU를 개선하기 위해, 연구자 sonochemotherapy의 형태를 생성하는 데 적합한 항신 생물 제와 초음파를 결합하려고 시도했다. Sonodynamic 치료 (SDT)는 체외에서 모두 인상적인 항 종양 활성을 보여 주었다 유망한 새로운 치료 방법입니다 <em&gt; 생체 연구 1. 그것은 손해를 우선적으로 이러한 세포와 정상 조직 학적 1,5의 그 사이의 크기 차이를 기반으로 악성 세포를 그 초음파를 보였다. SDT는 종양 세포에 의해 가해진 초음파 우선적 손상 정도를 증가 sonosensitizers 알려진 전문 에이전트를 포함한다. SDT의 치료 프로그램이 이전 검토되었지만, 사용되는 초음파 시스템은 일반적으로 높은 주파수의 초음파 (메가 헤르츠 ≥1)을 사용하고, 낮은 주파수 kHz의 초음파의 영향은 아직 완전히 탐구한다. 초음파의 낮은 주파수에 의한 물리 화학적 손상 12-14을 유도 마이크로 버블의 급격한 붕괴에 자주 관성 캐비테이션, 세포의 파괴를 초래하는 현상을 생산에 더 능숙하다. MHz 및 저 kHz의 초음파 간의 관성 캐비테이션의 발생의 차이가 낮은 전파는 주파수 미세 기포를 사용한다는 사실에 기인 한다음 압축 하프 사이클 12 동안에 따라서 더 강력한 붕괴 제조, 팽창 하프 사이클에서 정류 된 확산에 의해 성장하는 데 더 많은 시간이야. 우리는 이전에 U937 인간 단핵구 백혈병 세포가 저주파 초음파 (23.5 kHz에서)에 민감한 것으로 나타났습니다, 그리고이 감도는 크게 세포 골격 (15)를 교란 항 종양 제의 적용을 통해 증가시킬 수있다. 또한, 우리는 세포가 우선적으로 더 높은 초음파 감도를 나타내는 큰 세포, 크기에 따라 손상된 것을 증명하고있다. 또한, 비교 셀 크기에 정상적인 인간 조혈 줄기 세포 (hHSCs)과 백혈구 잠정적 저주파 초음파 우선적 정상 조직의 존재하에 종양 세포를 손상하는 데 사용될 수 있음을 시사 그들의 생물 대응 15보다 초음파 처리에 더 내성이다. 더 독특한 소품을 검사하려면잠재적 인 치료 용도를위한 저주파 초음파 erties, 우리는 우리의 현재 초음파 시스템 중 하나의 효능 및 안정성을 증가시키기 위해 세정 및 안정화 과정을 개발, 20mm 혼 구비 브랜슨 모델 SLPe 150 W, 40 kHz의 셀 교란이 끼워 7.62 CM 컵에. 또, 하이드로와 캐비테이션 미터 및 오실로스코프를 사용하여 40 kHz의 범위 내에서 정확한 샘플 캐비테이션 에너지뿐만 아니라 일관성 파형과 진폭을 결정할 수 있었다. 정제 및 우리의 프로토콜을 체계화함으로써, 우리는 우리가 정량적으로 다른 histogenetic 계통의 종양과 정상 세포의 음향 감도를 비교 할 수 있도록, 우리의 실험 sonications의 일관성을 확립 할 수 있었다. 40 kHz의 시스템에 대한 우리의 프로토콜은 관심이 실험실의 순서를 비교 실험을 수행 할 수 있어야하고,에 의해 유발 항 종양 효과의 우리의 연구 결과를 평가하기 위해 광범위한 상세하게 제시저주파 초음파. (도 1 MeβCD), 콜레스테롤 파괴 제, U937의 초음파 감도와 THP1 인간 단핵구 백혈병 세포의 증가에 더하여, 우리는 메틸 - β - 시클로 덱스트린의 농도 의존적 효과를 검토한다.

<table><tbody><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium w/ NaHCO3 &amp;amp; 25mM Hepes&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B Solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x Solution&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12105</td><td></td></tr><tr><td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3&quot; (25mm) Cuphorn</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>101-063-726</td><td>sonication device</td></tr><tr><td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater</td><td>Brisk Heat</td><td>SDCJF1A-GBH1000-1</td><td>heater used for temperature control</td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&amp;reg; Software</td><td>Beckman-Coulter</td><td>6605700</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml &amp;amp; 25 ml Vented Culture Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl</td><td>Lonza</td><td>17-605C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps</td><td>Beckman-Coulter</td><td>&amp;nbsp;A35473</td><td></td></tr><tr><td>AccuJet Pro Auto Pipet&amp;nbsp;</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26330</td><td></td></tr><tr><td>USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets</td><td>USA Scientific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Tip One 100 &amp;#956;l and 1,000 &amp;#956;l Filter Tips</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840, 1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;#956;l Micropipette&amp;nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>851164</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;l Micropipette</td><td>Wheaton</td><td>851168</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Dual Chamber Counting Slides</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0015</td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3131</td><td></td></tr><tr><td>Tektronix&amp;nbsp; DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>DPO2002B</td><td>used to measure the ultrasonic waveform</td></tr><tr><td>PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter</td><td>PPB Megasonics</td><td>PB-500&amp;nbsp;</td><td>used to assess the sound intensity in W/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone</td><td>Teledyne</td><td>TC4013-1&amp;nbsp;</td><td>connects to the oscilloscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wheaton 250 ml Flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z364827</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Glass Scintillation Vials&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution&amp;nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>N/A</td><td>diluent for Z2 counter</td></tr><tr><td>Chloroform 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof Anhydrous&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>ATCC</td><td>30-1011K</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Microplate Reader</td><td>Cole-Palmer</td><td>&amp;nbsp;EW-13055-54</td><td></td></tr><tr><td>U937 Human Monocytic Leukemia Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL&amp;shy;1593.2</td><td></td></tr><tr><td>THP1 Human Monocytic Leukemia Cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and quantitative analysis of pulsed low frequency ultrasound to determine the sonic sensitivity of untreated and treated neoplastic cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

시스템 안정성이 반복 가능하고 신뢰성있는 결과를 얻는데 가장 중요하다. 54.23 N. m의 적절한 토크 사양도 3b는 시료 바이알 내부 측정을 도시한다. 파형의 일관성은 오실로스코프 청음기 (도 3a)의 사용을 통해 평가되면서, 변환기 및 sonotrode (2)의 적절한 결합을 달성하고, 그림 3c는 컵 혼 내에서 안정성을 평가한다. 예상대로 일부 에너지에 유리에 흡수되는 때문에, 진폭은 약간 감소 하였다. 그러나, 파형은 교란 또는 샘플에 음향 에너지의 안정적인 배달에 필요한 두 패널 B 또는 C, 왜곡되지 않았습니다. 명확한 단일 사인파로 표시하지 않는 파형은 결함이 변환기 또는 부적절한 설정을 나타냅니다. 이것은 여러 비정상적인 파를 나타내고도 3d, 사인파 명확한 부재로 표현되고, 주파수 판독 값T는 제대로 작동 시스템으로 기대했다. 캐비테이션 에너지 생성 (도 4)를 측정하기 위해 사용 캐비테이션 미터 100-110 W / 33 % 진폭 cm 2, 125-130 W / 50 % 진폭에서 2 cm으로 소리 세기를 발견했다. 40 kHz의 시스템이 적절하게 교정과 전체 (그림 5)에서 조립 된 후 모두 TC20 및 Z2 카운터 (그림 6)에 의해 결정되는, 신뢰할 수있는 세포 파괴 쉽게, 달성했다. 예상대로, 더 광범위한 세포 손상 오히려 33 % 진폭에서보다 50 % 초음파 세포 집단에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 33 % 진폭은 눈에 띄는 손상 발생으로 투여 제제의 잠재적 소닉 증감 효과를 검출하기위한 시작점으로서 유용하지만, 에이전트 초음파 감도들의 상승 작용을 평가하기 위해 적용될 때 더 손상 탐지 할 여지를 남긴다. 이 그림 7A에 입증되는 경우U937 세포의 초음파 감도를 증강에 MeβCD의 농도 의존적​​ 효과가되게됩니다. 비 초음파 MeβCD 처리 된 세포는 비 초음파, 치료 세포 생존에 매우 유사했지만, 가능성은 현저하게 적용되었다 1 초 40 kHz에서 초음파의 세 가지 펄스 후 떨어졌다. 또한, 초음파 처리 후 생존 능력의 감소는 5 mM의 MeβCD 최대 1 mM의 다음 세포 수의 감소, 다음 0.5 mM의 MeβCD 생산으로, 따라 투여 량 인 것처럼 보인다. 세포 생존 및 미토콘드리아 활성에 대한 유사한 효과가 XTT 키트 (도 7b)으로 평가 된대로, 종래의 초음파에 MeβCD의 다양한 농도로 처리 한 두 U937과 THP1 세포에서 관찰되었다. THP1 세포가 U937 세포보다 내성이 약간 더 소닉 것으로 보인다 있지만, 모두 인간의 백혈병 라인은 용량 의존적으로 손상 될 수 있습니다. MeβCD의 높은 농도와 초음파 자극의 더 펄스세포 생존과 미토콘드리아의 활동을 낮출 대응, U937과 THP1 세포 모두에 대한 가용성, 밝은 색상의 오렌지 유도체 XTT의 가장 낮은 감소를 uced. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> 메틸 β - 시클로 덱스트린의 그림 1. 분자 구조. (A) 메틸 - β - 사이클로 덱스트린 (MeβCD)의 전체 구조. (B) MeβCD는 H 또는 CH 3 중 하나의 R 기와 일곱 반복 단위의 중합체이다. 분자식 : C 56 H 98 O (35). 분자량 = 1331.36. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> 그림 2. 제대로 40 kHz에서 초음파 시스템을 torqueing. (A) 혼과 컨버터 컵 PRI에서 제거또는 torqueing합니다. (B) 각각의 위치에서 슬롯 렌치와 토크 렌치를 배치합니다. (C) 컵에 혼과 컨버터를 다시 연결하기 전에 시계 방향으로 토크의 54.23 N. M을 적용합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> 초음파 시스템의 파형을 특징 오실로스코프 3. 그림. (A)와 하이드로 오실로스코프 파형 진폭 및 일관성을 평가할 수있다. (B)의 기록은 1.5 cm에 직접 뿔 위의 컵으로 촬영하고 33 % 진폭 설정. (C) 여기에 사진 파형은 수중 청음기는 20 ㎖ 유리 섬광 유리 병 내에 배치 될 때 획득 한 독서에서입니다. 바이알을 상기 혼 1.5 cm에 위치 된 후 다시 33 % 진폭으로 설정된다. (D) 오실로스코프 스크린 샷 오결함이있는 시스템이나 혼 컨버터 조합의 부적절한 커플 링 예상되는 바와 같이 비정상적인 주파수와 FA 시스템. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> 캐비테이션 미터의 사용도 4는 초음파 시스템의 소리 세기를 특성화한다. 여기에 본 캐비테이션 m은 W / cm 2에서 캐비테이션 에너지를 나타내는 데 사용된다. 이 샘플에 대하여 에너지의 일관성을 평가하기위한 중요한 도구이다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> 40 kHz에서 초음파 시스템의 그림 5. 주요 구성 요소. 초음파 시스템은 컵 경적 완료 표시됩니다 ( <stroNG&gt; A), 가열 장치 (B), 컨버터 (C), 및 샘플 위치 결정기구 (D). 이 디자인은 혼 (F) 위의 예제 (E)의 쉬운 위치 수 있습니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> TC20 및 Z2 카운터를 이용하여 U937 세포의 초음파 분해에 진폭의 다른 수준의 효과도 6. 세포는 각각의 사이에서 1 초 간격으로, 초음파 세 1 초 펄스들을 이용하여 33 %의 진폭 40㎑, 셀 dismembrator (100-110 W / cm 2) 또는 50 %의 진폭 (125-130 W / cm 2)로 초음파 처리 하였다 이러한 펄스. (A) Z2 카운터 소프트웨어로부터의 스크린 샷은 U937 세포에 초음파의 효과를 보여준다. TC20 카운터로부터 (B) 데이터는 결과의 재현성을 입증 그래프로 컴파일 된의. 이러한 데이터는 전체 및 생균뿐만 트리 판 블루로 평가 된 세포 생존 능력을 포함한다. 바 4 독립적 인 세포 집단에 대한 평균 (SEM)의 표준 오차를 반영합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> U937 및 THP1 세포의 초음파 감도를 증강에 메틸 β-덱스트린도 7 효과. (A) U937 세포는 종래 40 kHz의 초음파 (105 W / cm로 초음파 처리되고, 30 분 MeβCD 다양한 농도로 처리 한 두 ) 세 1 초 펄스를 사용하여 1 초 간격으로 이격. 세포 집단은 ≥12 μm의 ≥17 μm의로 분류되었다. (B) U937 또는 THP1 세포는 다시 다양한 승낙 처리 하였다30 분 전 1 초 초음파의 1-3 펄스를 사용하여 40 kHz의 시스템과 초음파되기 MeβCD의 식량은 1 초 간격을두고. 세포 생존과 미토콘드리아의 활동은 XTT 키트와 함께 평가 하였다. 세포를 100 ㎕은 편평한 바닥 96- 웰 마이크로 타이 터 플레이트에 웰 당 시딩 하였다. 플레이트는 종래 XTT 용액의 첨가로 24 시간 동안 인큐베이션 하였다. 파장이 판독되기 전에 세포는 추가로 2 시간 동안 배양 하였다. 바 4 독립적 인 세포 집단에 대한 SEM을 반영한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

생성 및 펄스 저주파 초음파의 정량 분석​​은 종 양성 세포를 치료하지의 소닉 감도를 결정하고 치료합니다

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

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비디오: Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

연구

생체공학

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from regulation of cell migration and proliferation, to secretion and even differentiation. The signals underlying each of these complex processes arise from the molecular interactions of extracellular matrix receptors on the surface of the cell. Integrins are the prototypic receptors and provide a mechanical link between extracellular matrix and the cytoskeleton, as well as initiating some of the adhesion-dependent signaling cascades. However, it is becoming increasingly apparent that additional transmembrane receptors function alongside the integrins to regulate both the integrin itself and signals downstream. The most elegant of these examples is the transmembrane proteoglycan, syndecan-4, which cooperates with &alpha;5&beta;1-integrin during adhesion to fibronectin. In vivo models demonstrate the importance of syndecan-4 signaling, as syndecan-4-knockout mice exhibit healing retardation due to inefficient fibroblast migration1,2. In wild-type animals, migration of fibroblasts toward a wound is triggered by the appearance of fibronectin that leaks from damaged capillaries and is deposited by macrophages in injured tissue. Therefore there is great interest in discovering strategies that enhance fibronectin-dependent signaling and could accelerate repair processes.
The integrin-mediated and syndecan-4-mediated components of fibronectin-dependent signaling can be separated by stimulating cells with recombinant fibronectin fragments. Although integrin engagement is essential for cell adhesion, certain fibronectin-dependent signals are regulated by syndecan-4. Syndecan-4 activates the Rac1 protrusive signal3, causes integrin redistribution1, triggers recruitment of cytoskeletal molecules, such as vinculin, to focal adhesions4, and thereby induces directional migration3. We have looked for alternative strategies for activating such signals and found that low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) can mimic the effects of syndecan-4 engagement5. In this protocol we describe the method by which 30 mW/cm2, 1.5 MHz ultrasound, pulsed at 1 kHz (Fig. 1) can be applied to fibroblasts in culture (Fig. 2) to induce Rac1 activation and focal adhesion formation. Ultrasound stimulation is applied for a maximum of 20 minutes, as this combination of parameters has been found to be most efficacious for acceleration of clinical fracture repair6. The method uses recombinant fibronectin fragments to engage &alpha;5&beta;1-integrin, without engagement of syndecan-4, and requires inhibition of protein synthesis by cycloheximide to block deposition of additional matrix by the fibroblasts., The positive effect of ultrasound on repair mechanisms is well documented7,8, and by understanding the molecular effect of ultrasound in culture we should be able to refine the therapeutic technique to improve clinical outcomes.

This protocol describes the stimulation of cultured fibroblasts with low-intensity pulsed ultrasound, which drives focal adhesion formation and Rac1 activation by mimicking engagement of the transmembrane matrix receptor, syndecan-4. This approach allows investigation of a successful clinical technique at the cellular level, thereby providing opportunities for refinement of the therapy.

낮은 강도의 초음파를 사용하여 접착 종속 신호의 유도

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

초음파 화상 진찰에 의하여 마우스에 있는 폐 종양 진행의 탐지

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

암 연구학

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) for the controllable nucleation of cavitation in tissue-mimicking gel phantoms. This in vitro protocol was developed to demonstrate the feasibility of this approach, for both enhancement of imaging and therapeutic applications for cancer. The same apparatus can be used for both imaging and therapeutic applications by varying the exposure duration of the HIFU system. For short duration exposures (10 &#181;s), broadband acoustic emissions were generated through the controlled nucleation of inertial cavitation around the gold nanoparticles. These emissions provide direct localization of nanoparticles. For future applications, these particles may be functionalized with molecular-targeting antibodies (e.g. anti-HER2 for breast cancer) and can provide precise localization of cancerous regions, complementing routine diagnostic ultrasound imaging. For continuous wave (CW) exposures, the cavitation activity was used to increase the localized heating from the HIFU exposures resulting in larger thermal damage in the gel phantoms. The acoustic emissions generated from inertial cavitation activity during these CW exposures was monitored using a passive cavitation detection (PCD) system to provide feedback of cavitation activity. Increased localized heating was only achieved through the unique combination of nanoparticles, laser light and HIFU. Further validation of this technique in pre-clinical models of cancer is necessary.

This protocol demonstrates the controllable nucleation of cavitation in gel phantoms, through simultaneous exposure to both near-infrared pulsed laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU). The cavitation activity can then be used for enhancing imaging and/or therapeutic uses of HIFU.

고 강도 향상을 위한 Plasmonic 금 나노 입자에서 현상의 제어 Nucleation 집중 초음파 응용 프로그램

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...

공학

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely manipulate neural firing, hormonal secretion and genetically-reprogrammed cells. However, the translation of this technology for medical applications is currently hampered by a lack of biophysical mechanisms by which targeted tissues sense and respond to LIPUS. A suitable approach to identify these mechanisms would be to use optical biosensors in combination with LIPUS to determine underlying signaling pathways. However, implementing LIPUS to a fluorescence microscope may introduce undesired mechanical artefacts due to the presence of physical interfaces that reflect, absorb and refract acoustic waves. This article presents a step-by-step procedure to incorporate LIPUS to commercially-available upright epi-fluorescence microscopes while minimizing the influence of physical interfaces along the acoustic path. A simple procedure is described to operate a single-element ultrasound transducer and to bring the focal zone of the transducer into the objective focal point. The use of LIPUS is illustrated with an example of LIPUS-induced calcium transients in cultured human glioblastoma cells measured using calcium imaging.

Low-Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation (LIPUS) is a modality for non-invasive mechanical stimulation of endogenous or engineered cells with high spatial and temporal resolution. This article describes how to implement LIPUS to an epi-fluorescence microscope and how to minimize acoustic impedance mismatch along the ultrasound path to prevent unwanted mechanical artefacts.

형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

비보에 태아 및 태 반 개발의 분석에 대 한 높은 주파수 초음파

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

발생학

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to assessing pathology post-mortem in animals euthanized at multiple time points in different cohorts, which increases the number of mice needed for a study. Imaging mice in longitudinal studies can track the progression of disease in individual animals, reducing the number of mice needed. Advances in ultrasound technology have allowed for the detection of micrometer-level changes in tissues. Ultrasound has been used to study follicle maturation in ovaries and xenograft growth but has not been applied to morphological changes in the mouse uterus. This protocol examines the juxtaposition of pathology with in vivo imaging comparisons in an induced endometrial cancer mouse model. The features observed by ultrasound were consistent with the degree of change seen by gross pathology and histology. Ultrasound was found to be highly predictive of the observed pathology, supporting the incorporation of ultrasonography into longitudinal studies of uterine diseases such as cancer in mice.

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

This protocol describes a method for monitoring the progression of morphological changes over time in the uterus in an inducible mouse model of endometrial cancer using ultrasound imaging with correlation to gross and histological changes.

마우스에서 종양 억제인자 Arid1a 및 Pten 의 Pax8 지시 결실에서 자궁내막암 진행의 비침습적 초음파 평가

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

마우스 경부 림프절의 고주파 초음파 이미징

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

의학

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic toxicity and increases circulation time of the drugs. In a novel approach to microbubble-assisted drug delivery, nanoparticles are incorporated in or on microbubble shells, enabling local and triggered release of the nanoparticle payload with ultrasound. A thorough understanding of the release mechanisms within the vast ultrasound parameter space is crucial for efficient and controlled release. This set of presented protocols is applicable to microbubbles with a shell containing a fluorescent label. Here, the focus is on microbubbles loaded with poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylate) polymeric nanoparticles, doped with a modified Nile Red dye. The particles are fixed within a denatured casein shell. The microbubbles are produced by vigorous stirring, forming a dispersion of perfluoropropane gas in the liquid phase containing casein and nanoparticles, after which the microbubble shell self-assembles. A variety of microscopy techniques are needed to characterize the nanoparticle-stabilized microbubbles at all relevant timescales of the nanoparticle release process. Fluorescence of the nanoparticles enables confocal imaging of single microbubbles, revealing the particle distribution within the shell. In vitro ultra-high-speed imaging using bright-field microscopy at 10 million frames per second provides insight into the bubble dynamics in response to ultrasound insonation. Finally, nanoparticle release from the bubble shell is best visualized by means of fluorescence microscopy, performed at 500,000 frames per second. To characterize drug delivery in vivo, the triggered release of nanoparticles within the vasculature and their extravasation beyond the endothelial layer is studied using intravital microscopy in tumors implanted in dorsal skinfold window chambers, over a timescale of several minutes. The combination of these complementary characterization techniques provides unique insight into the behavior of microbubbles and their payload release at a range of time and length scales, both in vitro and in vivo.

The presented protocols can be used to characterize the response of fluorescently-labeled microbubbles designed for ultrasound-triggered drug delivery applications, including their activation mechanisms as well as their bioeffects. This paper covers a range of in vitro and in vivo microscopy techniques performed to capture the relevant length and timescales.

초음파 트리거 약물 방출을 위한 형광 표지 마이크로 버블의 특성화를 위한 다중 시간 척도 현미경 검사법

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

설치류의 혈액 뇌 장벽 개방을 위한 고처리량 이미지 유도 입체 신경 탐색 및 집중 초음파 시스템

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

생성 및 펄스 저주파 초음파의 정량 분석은 종 양성 세포를 치료하지의 소닉 감도를 결정하고 치료합니다

요약

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명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

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초음파 화상 진찰에 의하여 마우스에 있는 폐 종양 진행의 탐지

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