체외 배양과 3D 조직과 같은 환경의 단순화된 2D의 차이는 살아있는 조직의 공간및 화학적 복잡성을 나타내는 3D 시스템에 대한 관심을 증가시켰습니다. 제조 공정에는 시설 또는 포토리소그래피 기술이 필요하지 않습니다. 그러나, 3D PDMS 장치는 3D 생리환경 적용을 위해 필요한 벡터를 포함한다.
중유체 장치 제조를 위해 적절한 3차원 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 장치에 대한 금형 의 마스크를 설계하고 열저항성 수지로 스테레오 리소그래피 장비를 사용하여 금형을 인쇄합니다. 금형이 준비되면 금형당 PDMS 단조근 용액 3밀리리터를 경화제와 10 대 1 비율로 혼합하고 진공을 사용하여 진공 건조기에서 1시간 동안 분해합니다. 탈수의 끝에서 접착제 테이프를 사용하여 금형 표면에서 먼지를 제거하고 탈기 PDMS 용액으로 금형을 조심스럽게 채웁니다.
다음으로 실온에서 금형이 냉각되기 전에 2시간 동안 PDMS를 섭씨 80도에서 치료합니다. 금형이 터치로 냉각되면 블레이드를 사용하여 금형과 PDMS 사이의 경계를 절단하고 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗깁니다. PDMS를 22mm 22mm 커버슬립에 맞게 다듬고 입구에 구멍을 뚫습니다.
낮은 보풀 티슈와 70%에탄올을 사용하여 장치를 닦고 덮개 슬립을 닦고 새로운 접착제 테이프로 장치를 두드려 큰 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 PDMS 장치와 커버슬립을 121°C에서 121도의 건조하고 15분 동안 건조하고 PDMS 부품의 바닥 표면을 염색하고 코로나 방전 총으로 5분 동안 코로나 배출총으로 커버슬립을 처리한 후 조각을 결합합니다. 장치를 로드하려면 먼저 1%페니실린 및 연쇄상 구균 및 1%인슐린 전달-셀레늄-x로 보충된 적절한 성장 배지에 대한 관심 있는 세포를 다시 중단합니다.
다음으로 매머진 세포 현탁액 의 50 마이크로리터를 425 마이크로리터의 갓 준비된 중화 콜라겐 용액과 혼합하고 콜라겐 세포 현탁액으로 200 마이크로리터 파이펫을 채웁니다. 전체 챔버가 채워질 때까지 입구를 통해 액수들을 PDMS 장치에 주입하고 1시간 동안 5%의 이산화탄소로 인큐베이터에 장치를 배치하여 성장 배지로 양쪽의 저수지를 채우고 공초점 이미징이 될 때까지 인큐베이터로 장치를 반환한다. 3D 이미징 및 정량화를 위해, 살아있는 세포 이미징 배양 챔버를 공초점 현미경에 설치하고 온도와 이산화탄소를 각각 섭씨 37도 및 5%로 미리 설정합니다.
이미징 챔버 저장소에 물을 추가하여 챔버를 가습하고 필요에 따라 젖은 물티슈를 챔버에 넣고 PDMS 장치를 챔버에 배치합니다. 그라데이션 형성의 요인의 원천으로서 저장소 중 하나에 표피 성장 인자를 추가하여 다른 저수지를 떠나 공간적으로 등급이 매겨진 표피 성장 인자 분포의 개발을 위한 싱크로 작용한다. 그런 다음 관심있는 오르가노이드의 양을 포함하는 Z 스택의 범위를 설정하고 이미징을 시작합니다.
실험의 끝에서, 적절한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 오르가노이드 또는 개별 세포의 이동에서 확장되는 분기의 길이와 각도를 측정합니다. 실리코와 체외 검사 모두에서 공급원 또는 싱크 저장소의 보충 없이 약 2일 동안 지속되는 세포 배양 영역을 가로지르는 안정적인 선형 표피 성장 인자 그라데이션의 형성을 밝혀내고, 6.4킬로달톤의 단백질인 표피 성장 인자는 상대적으로 짧은 기간 동안 입증된 콜라겐 겔 내에서 안정적인 확산 기반 그라데이션을 형성할 수 있음을 시사한다. 유방 오르가노이드는 밀리리터당 0.5 나노몰러를 갖는 선형 그라데이션에 표피 성장 인자가 추가될 경우 3일 동안 방향 편향이 없는 공간적으로 균일한 2.5 나노몰어 표피 성장 인자의 존재에서 여러 가지를 형성한다.
그러나 분기 형성은 상당한 방향 편향을 표시합니다. 참고로, 갭 접합 억제제를 첨가하면 그라데이션에 반응하는 오르가노이드의 능력을 억제합니다. 콜라겐 용액의 pH는 겔화 및 세포 생존가능성에 매우 중요합니다.
콜라겐이 혼합하기 전에 중화되지 않으면 세포 생존가능성이 낮습니다. 이 방법은 보다 현실적인 조직 모델링을 수용하기 위하여 확장될 수 있고 젤 내의 개별 적인 세포에서 혈관 네트워크 대형을 수용할 수 있었습니다.
