Name: unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.

(1)에 실리 컴퓨터 모델링 <ol><li> 단백질 데이터 은행 (PDB)에서 관심의 단백질의 PDB 구조를 다운로드합니다. 과량의 서브 유닛을 분리 한 후 &quot;셀 중화 및 P K 예측&quot;YASARA 16의 실험을 사용하여 누락 된 수소 원자는 명시하고 용매를 첨가함으로써 구조체를 준비한다. 막 결합 된 트리 테르펜 cyclases 들어, 워터 박스의 적합한 사이즈 91x67x77 Å이다. 수동으로 촉매 활성 아미노산의 양성자 상태를 조정합니다. 참고 : PDB 파일의 기판 아날로그 &quot;편집 | 교환 | 아톰&quot;을 사용하여 실제 기판에 수정 될 수 있습니다 필요한 경우 명령을. </li><li> 황색 포스 필드 스위트 (17)를 사용하여 &quot;에너지 최소화&quot;명령에 의해 구조를 최소화합니다. 장거리 정전 기적 ​​상호 작용을 고려하여 입자 메시에 발트 방식 (PME) (18)를 사용합니다. 따라서 반 데르 발스 상호 작용에 대한 차단을 설정표준 설정. 주 : 수렴에 도달 할 때까지 &quot;에너지 최소화&quot;명령 다음 짧은 최대 경사 최소화, 시뮬레이트 어닐링에 의해 구조적 응력 제거 (시간 단계 2 FSEC 0.9 매 10 번째 단계에서 축소 원자 속도)이 수행된다 (즉, 에너지의 향상 ) (200) 단계에서 원자 미만 0.012 킬로 칼로리 / 몰. </li></ol> 활성 부위 매화와 물 접근 2. 모델 <ol><li> 모의 어닐링 후, 20 NSEC 분자 역학 (MD) 궤도를 실행하고 &quot;파일 | 저장 | 시뮬레이션 스냅 샷&quot;적어도 10 스냅 샷을 생성 &quot;시뮬레이션&quot;다음 명령을 실행합니다. 정규 앙상블에서주기적인 경계 조건으로 표준 컴퓨터 시뮬레이션을 실행합니다. Berendsen의 온도 조절기를 사용하여 298 K의 온도를 유지한다. </li><li> 모든 물 분자와 최종 리간드 / 기판을 사용하여 삭제하여 2.1에서 얻은 스냅 샷을 준비4; 수정 | 삭제 | 중첩 잔류 &quot;에 의해 원래의 PDB 구조에 개별적으로 명령 중첩 각각의 스냅 샷.&quot;| 개체 &quot;명령은 모든 구조가 동일한 공간 위치를 공유 할 수 있도록 새로운 PDB로이 방법으로 제조 된 각각의 스냅 샷을 저장합니다. - 파일 (사용 &quot;파일 | 다른 이름으로 저장 | PDB&quot;명령). 경험 모델러의 경우 : 참고 : 보조 코드 파일 1에 주어진 템플릿에 따라이 프로세스를 자동화하는 스크립트를 작성합니다. </li><li> 소프트웨어 동굴 탐험가 3.0 (19)에 입력으로 3D 공간에 정렬 된 2.2에서 준비된 스냅 샷 (PDB)를 사용합니다. 스냅 샷의 제한된 수의 분석을 위해, 표준 컴퓨터를 실행 동굴 탐험가. 물 분자의 수송에 특이 터널의 검출을 보장하기 위해 0.7 Å (19)의 반경 프로브를 사용한다. </li><li> 분자 그래픽 소프트웨어에 의해 생성 된 동굴 탐험가 3.0 터널을 시각화. 터널의 쉬운 시각화를위한, 보충 코드 필에 표시된 매크로를 사용전자 2. </li></ol> 실리 효소 공학 3. 물 패턴 및 물 역학을 수정하는 방법 <ol><li> 동굴 탐험가 3.0 소프트웨어에서 생성 된 출력 파일 &quot;있는 Summary.txt&quot;에 나열된 헤더 &quot;ID&quot;에 따라 가장 높은 순위 터널을 식별합니다. </li><li> 가장 높은 순위 터널 (3.1)과 그 디스플레이 (2.4에서 얻은 모델을 사용) 육안 검사로 채널 내부를 가리키는 작은 사이드 체인을 감 아미노산을 확인합니다. &quot;스왑 잔류&quot;명령을 사용하여 증가 입체 장애에 의한 터널을 차단 하나의 아미노산 치환을 확인합니다. 터널이 단계 프로토콜의 1.2-3.1를 반복하여 다음 육안 검사에 의해 차단되고 있는지 확인합니다. </li></ol> 변이 유전자의 4 식 <ol><li> 겹치지 20 프라이머를 사용하여 PCR 돌연변이 유발 야생형 유전자에 돌연변이를 도입. </li><li> 튜브 관심 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 추가적합한 클로닝 균주의 적격 세포와의 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 42 ° C로 설정 온도와 수조에서 45 초 동안 열 쇼크 형질 전환을 수행한다. 신선한 풍부한 매체의 500 μl를 추가 (2YT는, 16g / L의 트립 톤, 10g / L 효모 추출물, 5g / L의 NaCl)과는 37 ° C에서 부화, 45 분 동안 200 rpm으로. 적절한 항생제로 보충 한천 접시에 형질 전환 된 세포를 도금을 선택합니다. </li><li> 돌연변이 유전자의 DNA 서열을 확인한 후, 전술 한 바와 같이 열 쇼크를 사용하는 발현 균주에 플라스미드 DNA를 변형. 막 결합 트리 테르펜 cyclases의 발현을 위해, BL21 (DE3)를 사용합니다. </li><li> 적절한 항생제로 보충 2YT 미디어에서 발현 균주의 37 ℃에서 5 ML의 O / N 문화를 시작합니다. </li><li> 0.05-0.09의 최종 OD에, 적절한 항생제로 보충 300 ml의 2YT 미디어를 포함, 2 L 당황 쉐이크 플라스크에 접종 (600 nm에서 측정). 0.6-0의 외경에서 유도 한 후.도 8 및 단백질 발현, -80 ° C에서 세포 펠렛을 동결 및 저장. <ol><li> pD861 벡터에 막 결합 트리 테르펜 cyclases 들면, 단백질 (21)의 높은 수율을 달성하기 위해, 37 ℃에서 0.5 mM의 발현 시간이 람 노스 2 및 4로 유도한다. </li></ol></li></ol> 일반 원심 분리기 및 단백질 정제를 사용하여 5 막 추출 <ol><li> 다음의 버퍼를 준비한다 재현 탁 완충액 (100 mM의 인산 칼륨을, 프로테아제 억제제 정제로 보충 된 pH를 7.5), 세제 완충액 (1 % (v / v) 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5) 및 반응 완충액 (0.2 % 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5). <ol><li> 스쿠알렌 hopene의 cyclases 또는 낮은 pH 최적 다른 막 결합 효소, 시트르산 완충액에 재현 탁 인산 칼륨을 대체. 세제 완충액 (1 % 트리톤 X-100 : 효소에 대해 다음 버퍼를 사용60 mM의 시트 레이트, 산도 6.0)과 반응 버퍼 (0.2 % 트리톤-X 100, 60 mM의 시트 레이트, pH를 6.0). 주의 : 그 태그는 정제를 위해 사용되는 경우, 20 mM의 이미 다졸 (최종 농도)로 재현 탁 버퍼를 보충. </li></ol></li><li> 유리 비커에서 냉동 된 세포 펠렛의 무게. / ㎖ 0.3 g 세포의 최종 농도로 재현 탁하여 균질화 완충액에 세포를 재현 탁. 80 %의 진폭에 1 초 1 초 오프 펄스 초음파로를 Lyse은 재현 탁 세포. 50 초 각의 세 가지 반복주기를 사용합니다. </li><li> 0.2 % (v / v)의 세제의 최종 농도 세제 버퍼를 추가한다. 1 시간 동안 4 ℃에서 혼합 엔드 오버 엔드에 의해 평형. 4 ° C에서 50 분 동안 39,000 XG에 하나의 원심 분리 단계 후에 뜨는을 저장하여 막 단백질 부분을 복구 할 수 있습니다. 참고 : 그의 태그 정제를 사용하는 경우, 아가로 오스 / g 세포를 1.5 ml의 니켈 NTA를 추가로 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 첫 번째 정화를 수행이온 교환 또는 그의 태그 정화 (21) 중 하나에 의해 단계. 0.2 % 트리톤 X-100 평형 및 용출 버퍼를 보충합니다. 정제 된 단백질 10 kDa의의 차단과 원심 필터 유닛을 사용하여 다섯 번 집중. 주 : 세제 농도 트리톤 X-100 미셀 결과의 크기를 약 1 %의 최종 농도. </li><li> . (2) 106 × 10 × 4 -8의 구상 단백질 분획 범위와 호환 농축 단백질 및 매트릭스를 사용하는 겔 여과에 의해 정제 연마 공정을 마무리 버퍼를 실행하는 것과 반응 완충액을 사용한다. 제조사의 프로토콜에 따라 브래드 울트라 키트를 사용하여 정제 된 단백질의 양을 측정한다. </li></ol> 6. 속도론 <ol><li> 반응 버퍼에 기판의 신선한 5 밀리미터 주식 솔루션을 확인하십시오. 2-5 분 동안 30 %의 진폭에 초음파에 의한 균일 한 에멀젼을 얻습니다. </li><li> 써모 평형원하는 반응 온도. 외부 온도계로 유리 바이알 함유 물 내부의 온도를 확인한다. </li><li> 단일 기판 속도론을 위해, 동일한 최종 기질 농도에 적어도 다섯 유리 바이알에 유화 기판 희석. <ol><li> 여러 기판 한 냄비 상대적으로 반응 속도, 각 유리 병에있는 모든 기판을 혼합하여 적어도 5 개의 동일한 유리 병을 준비합니다. 소수성 트리 테르펜를 들어, 10 내지 200 μM의 범위의 최종 기질 농도를 사용한다. </li></ol></li><li> 10 분 동안 써모 유리 바이알을 Preinc​​ubate. 효소를 첨가하여 반응을 개시. 1 ml의 총 반응 부피가 적합하다. 적어도 1,200 rpm의 진동 속도를 사용합니다. </li><li> 500 ㎕의 에틸 아세테이트를 첨가하여 서로 다른 시점에서 반응을 정지 통합 표준 100 μM의 데칸으로 스파이크. </li></ol> 7. 추출 및 열역학적 분석 <ol><li> 에 의해 반응 혼합물을 추출텍싱 수동으로 1 분 동안 격렬하게 유리 병을 흔들어. 실온에서 10 분 동안 테이블 상단 원심 분리기에서 9,600 XG에 유리 튜브를 원심 분리기. 빈 튜브 상단 층 (유기상)를 전송합니다. 반응 튜브에 추출 용매의 추가의 500 μl를 첨가하고 추출 과정을 반복한다. </li><li> 나 2 SO 4와 추출 된 반응 혼합물을 건조. 5 초 동안 소용돌이 및 튜브 10 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 실온에서 1 분 동안 9,600 XG에서 최종 원심 분리 단계를 수행합니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 바이알로 추출한 샘플을 전송. </li><li> (단일 기판 역학에 대한) 기판의 적어도 네 가지 초기 농도 (단일 기판과 경쟁력 역학 모두) 네 개의 서로 다른 온도를 사용하여, 관심있는 각각의 효소 변형에 대한 6.1-7.2 아래의 단계를 반복합니다. </li><li> 이전에 3 설명한 바와 같이 GC 분석을 수행합니다. hydrophob의 분석 비극성 열을 사용IC 펜타 제품. 제품 및 열에 따라, 120 ℃로 오븐 초기 온도를 5 ℃ / 분의 온도 구배를 사용한다. </li><li> 생성물 (들)의 피크 면적을 통합하여 (100 μM에 상당)의 통합 표준의 영역을 이용하여 해당 제품 농도 제품에 피크 면적을 변화. 반응 시간 (t) 대 각 제품 ([P])의 농도를 플롯. 10 % 미만의 전환에 대응하는 데이터 포인트의 선형 회귀 분석을 수행한다. 초기 반응 속도 (0 V)에 따라 장착 직선의 기울기에 의해 주어진다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" /> 참고 : 여러 개의 기판을 하나의 냄비 상대적으로 반응 속도를 들어, V 0는 다른 기판의 영향으로 특정 기판의 초기 속도입니다. </li><li> 단일 기판 속도론, 플롯 V 0 </su해당 기질 농도에 대한 B&gt; / [E]. 겉보기 K 고양이 / K M 값에 따라 그래프의 직선 부분의 기울기에 의해 주어진다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" /> [S]는 기질과의 농도는 [E] 변태. K 고양이에 사용되는 효소의 농도 / K M은 미카엘 상수 위에 촉매 상수 동일시. 각각의 온도와 각 효소 변형에 대한 분석을 반복합니다. </li><li> 단일 기판 속도론 들어, 전이 상태 (22)의 이론에 따라 열역학적 분석을 수행 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" /> K B는 볼츠만 상수, H 플랑크 상수, T 켈빈 온도이며, 기체 상수를 R. K ((LN의 플롯의 선형 회귀 분석을 수행 <sUB&gt; 고양이 / K M) / ((K B 형 *의 T) / H))) 1 / T 대. 활성화 엔탈피 (Δ H ‡) (-slope가) * R 및 활성화 엔트로피 (Δ S ‡)을 (차단) * R에 의해 주어진다에 의해 주어진다. 주 : 마찬가지로, 포화 기질 농도 하에서 분석 수학 식 3에서 일정한 속도로 K 고양이를 사용하여 수행 될 수있다. </li><li> 복수의 기판을 하나의 냄비 상대 동력학 들어 상대적인 겉보기을 구하는 K 고양이 / 23에서 K M 값 : (K 고양이 / K M) / (K 고양이 / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4) 이는 V 0,는 기판과 경쟁 B. 기판에 대한 초기 레이트를 의미 </li><li> 한 냄비 상대 기의 경우다수의 기판과 동력학은 비선형 회귀 분석에 의해, 같은 기준에 비해, B의 활성화의 상대적 열역학적 파라미터를 구하십시오 <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" /></li><li> 활성화 엔탈피 및 참조 화합물의 엔트로피로부터 기판 B에 대한 절대 기동 파라미터를 계산 : <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" /></li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+work:+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations.">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

야생형 막 효소 및 터널 변형 고품질의 실험 열역학 데이터를 달성하는 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 컴퓨터 모델의 1) 발생; 2) 균일하게 정제 된 단백질; 3) 유화 기판 주식; 4) 반응 속도 동안 온도 제어; 내부 표준 물질을 사용하여 반응 혼합물의 5) 추출. 컴퓨터 모델의 생성은 매우 다양한 플랫폼을 지원하는 사용자 친화적 인 인터페이스와 소프트웨어의 사용에 의해 용이하게된다. 따라서,이 프로토콜은 심지어 비 전문가를 모델링에 대한 우리의 전략에 액세스 할 수 있도록하기 위해 YASARA 모델링 스위트 (16)과 같다. 물 터널 식별을위한 컴퓨터 모델은 이상적으로 관심 (24)의 효소의 결정 구조에 기초한다. 이 목적을 위해, 단백질 데이터 뱅크에서 사용할 결정 구조의 부 매우 유익하다. 우리의 경험, TEM의 성공적인 준비의 핵심 측면에서터널 식별 판은 결정 물을 유지하는 것입니다. 그것은 보통 컴퓨터에서 실행될 수있는 분자 동력학 시뮬레이션을 수행 할 때 용해 효소 상자를 사용하여 동일한 중요하다. Alicyclobacillus의 acidocaldarius에서 트리 테르펜 시클 라제는 MD 시뮬레이션 3 중 물에 안정적이다. 그러나, 결정 세제를 유지 및 / 또는 세포막을 이용하여 모방 아마도 확장 MD 시뮬레이션을 허용 할 가능성이 불안정 효소 요구 될 것이다. 이것이 터널 조직의 역학적 특징을 포착하지 않을지라도 매우 어려운 대상 최소화 결정 구조, 프로토콜을 사용하는 중요한 기계적 통찰력을 제공 할 수있는 것이 구상된다. 단일 또는 입력으로 스냅 제한된 수의 기본 모드의 동굴 탐험가 (19)는, 표준 노트북, 비전문가에 의해 사용될 수있다. 경험 3 병목 반경 터널 (즉, 반경에 기초가장 좁은 지점에서)보다 작은 1은 결정 물 분자가 왼쪽 가운데), 예측 터널 (그림 1 내에 상주 특히, 물에 매우 관련이있을 수 있습니다. 한편, 큰 병목 반경과 활성 부위 (10)의 밖으로 상기 기판의 반송을위한 터널을 의미 할 수있다. 보충 공전 스크립트 2 예측 터널 시각화 비전문가에 의해 사용될 수있는 파일. 미래의 실험은 동성 모델은 물 네트워크 및 역학의 원자 론적 연구 할 수 있도록 충분히 높은 해상도 수 있는지 여부를 발표 할 예정. 와 활성 부위에 존재하는 리간드없이, 분자 동력학 시뮬레이션을 수행하는 방법에 빛을 발산, 터널 식별 과정도 중요한 영향을 미치는 것이다. 막 단백질의 속도론은 만만치 않은 도전 (25)를 구성 할 수 있습니다. 프로토콜은 본원 단순한 멤브레인 추출 프로토콜에 기반초 원심 분리기 등으로 고가 장비를 사용하지 않고 막 효소를 얻었다. 마감 연마 스텝과 같은 겔 여과의 사용은 잠재적 잔류 막의 입자를 제거하고, 적합한 세제 환경 (25)을 형성 가능하다. 운동 프로토콜에서 재현 결과를 달성하는 중요한 양태는 초음파에 의해 기판 ​​스톡 용액을 유화이다. 반응 버퍼에 희석 소수성 기판의 간단한 볼텍스 불균일 한 기판 세제 혼합물을 제공합니다. 비 유화 기판 솔루션의 피펫 팅 초기 속도의 정확한 결정을 방지 (정량 GC에 의해 확인) 재생 불가능한 농도에 이르게. 대조적으로, 적절하게 유화 스톡 용액은 피펫 0.98에서 0.99 사이의 범위에있는 R 2 초기 속도의 선형 회귀 분석을 초래한다. 소수성 기판의 또 다른 중요한 측면은 명백하다 기판 용해도및 기판 세제 혼합물 가능. 실제로, 기준 기판과 스쿠알렌 사이 클라 트리 테르펜을 포화시킬 수 없었다. 이러한 이유로 명백한 K 고양이를 들어 / K M 값이 모두 결합 화학의 기여를 포함 할 수있는 여기에 표시됩니다. 그러나, 화학 K 고양이에 대한 속도 제한이 있음을 보여왔다 / 트리 테르펜 cyclases 3 실시한 polycyclization 캐스케이드에 대한 K M. 이것은 외부 온도계 반응 유리관 내부 실제 온도를 확인하기 위해 높은 중요하다. 그럼에도 불구하고, 선형 맞는 서로 다른 온도에서 필수적인 상수 명백한 K 고양이 / K M 값이 변형에 대한 가난한 될 수 있습니다. 이 제로 (그림 2B 및 2C)에 가까운 활성화 엔탈피와 S168F 변종 여기에 (그림 2A)에 대해 강조한다. 매우에 작은명백한 K 고양이의 L 온도에 의존 변경 / K M은 관찰 활성화 엔트로피의 불확실성을 유도 할 수 Δ S ‡ (즉,도 2b에서 선형 그래프의 절편). 원칙적으로, 관측 활성화 엔트로피는 단백질 농도를 측정하여 검출되지 않을 다른 변종 활성 효소의 다른 풍부에 의해 영향을받을 수있다. 이는 한 포트에 여러 기질을 혼합 할 때의 실험 오차가 감소되는 것으로 기대된다. 모든 다른 기판들이 이러한 상황에서 효소의 동일한 양 (수학 식 4)와 상호 작용하기 때문이다. 추출 용매의 사용은 내부 표준 추출 및 / 또는 주입 동안에 GC의 차이를 고려하는 것이 중요하다 타서. 전이 상태 이론 성공적 효소 학 (26)에 사용되어왔다. 이 중요한 이론적 프레임 워크는 원래 해제되었습니다기상에 단 분자 반응에 이미 개발. 그러나, 효소가 주로 고전적 활성화 에너지 장벽 (26)을 낮춤으로써 작업 것으로 밝혀졌다. 하나 본원로 가정 투과 계수는 측정 된 활성화 엔탈피 및 / 또는 엔트로피 영향을 미칠 수있다. 터널링의 기여, 및 전이 상태의 다시 교차와 같은 다른 비 전통적인 효과는 대략 에너지의 약 4 킬로 칼로리 / 몰에 해당하는 촉매 (26)에 1,000 배에 기여할 수있다. 그것은 (328 K,도 2c에서 16 킬로 칼로리 / 몰) 야생형 효소에 의해 표시 활성화 엔트로피 불균일 투과 계수에 의한 이러한 비 - 고전적인 효과보다 훨씬 큰 것을 알 수있다. 프로토콜을 이용하여 야생형 및 변이체 터널 용 활성화 열역학적 파라미터를 비교할 때 전달 계수의 영향은 감소한다. 활성화의 깁스 자유 에너지 (Δ G ‡)는 COMPO입니다enthalpic (Δ H ‡) 및 엔트로피 모두의 SED (- T의 * Δ의 S의 ‡) 용어. 촉매 동안 효소 용매 재구성은 두 매개 변수에 영향을 미칠 수있다. 본 프로토콜은 필요한 생물 물리학 실험 프레임 워크와 관련과 실리에서 사용자 친화적 인 계산 도구의 도구 상자를 조립하여 이러한 현상의 연구를 촉진 할 것으로 예상된다. 방법은 막 결합 효소에 의해 촉매를 포함한 효소 공정의 과다를 연구하는데 유용 할 것으로 예상된다.

물은 생명 1의 화학에 대한 초석을 구성한다. 물 패턴 및 효소 활성 부위의 매화는 엔탈피 및 소수성 효과 2,3- 넘어 연장되는 매우 복잡한 형태로 촉매 1, 2 및 3을 리간드 결합 엔트로피 모두에 영향을 미친다. NMR (4)는도 2 및 열량 용해 단백질의 분자 모델링은 리간드 연관 5-8, 특이 활성 2,9,10위한 구동력을 제공하는 명시적인 물 분자의 역할을 밝혀하는데 사용되어왔다. 여기서 우리는 효소 촉매 반응에 용매 변위 열역학적 영향 (도 1)의 실험적인 평가에 고유 방법론을 제시한다. 우리의 결합 된 전략은 효소 공학, 열역학 분석 (그림 1)과 협력하여 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 기반으로합니다. 이 CATA에 용매 역학의 영향에 대한 추가 빛을 발산 수 있습니다현재 제대로 이해되고 용해,. 용해 효소 활성 부위에 물 매개 수소 결합에 의해 제공 enthalpic 상호 작용을 안정화 엔트로피 처벌 1만큼 오프셋 될 수있다. 5 부피의 물에 비하여 비용이 엔트로피 단백질 캐비티 내에 갇힌 물 분자에 의해 표시 자유도의 감소와 연관된다. 정렬 된 물 분자의 분리 따라서 리간드 연관 (1)과 (3) 촉매에 대한 엔트로피 구동력을 제공 할 수있다. 용매 역학의 핵심은 단백질의 내부와 외부 사이의 용제 4 물 분자의 변위이다. 활성화 에너지, 엔탈피, 엔트로피 (11)에 첨부 변화는 완전히 분자 수준에서 이해되지 않습니다. 활성 효소에 물 수송, 용매 역학의 중요성과 기여도에 대한 책임 개별 터널을 방해함으로써에너지는 (그림 1) 평가 될 수있다. 또한, 상이한 온도에서 한 냄비 동역학 실험을 수행하여, 몇 개의 기판들의 상대적인 열역학적 활성 파라미터 실험 감소 된 수 (도 1, 오른쪽)에서 추출 될 수있다. 우리의 학제 방법은 생활 (12)에 대해 높은 중요도의 다환 테르펜을 생성 복잡한 막 결합 트리 테르펜 시클 라제 효소에 대한 검증됩니다. 프로토콜은 표준 원심 분리기를 이용하여 세포막 단백질의 높은 양 (10 내지 20 ㎎ / ℓ)의 회복을 허용한다. 효소를 물에 전개되지만, 촉매 작용을 촉진하는 용매의 역할은 일반적으로 무시한다. 형상은 전이 상태 (15)와 정전기 상보성 활성 부위를 미리 편성 역학 13,14 단백질 외에도, 물 역학 효율적인 효소 촉매 높은 중요 할 수있다. 여러 학제 기술을 단조하여, 우리의목표는 물 역학과 열역학의 매우 복잡한 연구를 촉진하는 것입니다. 과학계에이 도구는 더 접근 할 수 있도록하는 것은 변경된 활동과 특이성에 대한 효소 공학 및 단백질 설계에 새로운 전략의 발전으로 이어질 것입니다.

<table><tbody><tr><td>YASARA</td><td>YASARA Biosciences</td><td>http://www.yasara.org/</td><td>Molecular modeling and simulation program&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CAVER&amp;nbsp;</td><td>CaverSoft</td><td>http://caver.cz/</td><td>Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use</td></tr><tr><td>Bradford Ultra</td><td>Expedeon</td><td>BFU1L, BFU05L</td><td>Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem homogenizer</td><td>VWR</td><td>432-0205, 432-0217</td><td>Homogenization of frozen cell pellet</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Units</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td>Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa</td></tr><tr><td>Thermomixer&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer for sample incubation</td></tr></tbody></table>

unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

효소 촉매 polycyclization 물 역학의 중요성은 실리코 분석 및 검출 터널 후속 시각화 (2 파일에 부가 코드 스크립트를 사용)하여 내포된다. 프로토콜 부 (3) 다음, S168은 Alicyclobacillus acidocaldarius에서의 트리 테르펜 시클 라제 효소의 하나의 터널 라이닝 &quot;핫 스폿&quot;아미노산 잔기 (도 1, 좌측 중간)로 발견된다. 육안 검사 (그림 1, 왼쪽 아래)에서와 같이 실리에 돌연변이 S168F를 도입함으로써, 터널이 막혔습니다. 트리 테르펜 시클 라제 효소에 의해 표시되는 환식 제품의 형성을위한 반응 속도는 온도 (도 2A)에 매우 민감하다. 프로토콜 (섹션 4-7)에 이어, 그것은 발견되는 명백한 K 고양이 / K 그 <su온도가 25 ° C (도 2A)에서 발생할 때, B&gt; 펜타 제품의 형성 야생형 효소에 의해 표시된 M은 fiftyfold을 증가시킨다. 단일 점 돌연변이를 도입하여 개별 터널 블로킹 실험적으로 결정된 절대 겉보기 K 고양이 / K M 값에 큰 영향을 가지며,뿐만 아니라 온도 의존성 (도 2A)에. 실험적으로 결정 운동 매개 변수에서, 선형 열역학 플롯은 식 (3)에 의해 단일 기판 반응 속도 (그림 2B)을위한 프로토콜의 섹션 6-7에 따라 생성됩니다. 차단 된 터널을 품고 변형 관찰 활성화 엔트로피와 엔탈피에 매우 큰 변화는 (그림 2B를 기반으로 그림 2C, 계산) 키 polycyclization 캐스케이드를 촉진 물 역학에 대한 역할을 의미한다. 그 위에변경된 물 터널 활성화의 변경 깁스 자유 에너지를 표시와 함께, 변형 (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, 그림 2B-C). 예를 들어, 303 K에서 S168F 터널 변형 야생 형 효소 16 킬로 칼로리 / 몰에 비해 14 킬로 칼로리 / 몰의 활성화 깁스 자유 에너지를 표시합니다. 제 7의 프로토콜에 따라, 식 (4)는 하나의 냄비 운동 실험에서 추가 기판 (그림 3A)에 대한 명백한 K 고양이 / K M 값의 계산이 가능합니다. 또한, 열역학적 선형 플롯 (도 3b)는 다른 온도 (식 5)에서 경쟁 에세이를 실행하여 구성 될 수있다. 단일 기판 속도론과 유사하게, 기준 화합물에 비해 추가의 기판에 대한 상대적인 활성화 엔탈피 및 엔트로피 readil 아르직선의 절편과 기울기에서 액세스 할 수 y는 실험 데이터에 적합합니다. 활성화의 열역학적 파라미터의 절대 값은 기준 화합물 (식 6)과 관련된 열역학 데이터를 이용하여 산술 가산에서 평가 될 수있다. 본원 프로토콜을 사용하여, 결과를 명확하게 차단 물 터널 크기가 다른 (도 3c)의 기판들에 대한 활성화를 근본적으로 다른 열역학적 파라미터를 디스플레이 막 효소 변종 생성 된 것을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜 개요 :. 실험 단백질 설계 및 열역학적 분석 콘서트에 실리 컴퓨터 모델링에서 효소 촉매 반응에 용매 역학의 영향의 향상된 이해를 할 수 있습니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오</a>여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> 단일 기판 동역학에서 야생형과 터널 변이체의 활성화도 2 열역학적 파라미터. (A) 겉보기 K 고양이 / 실험 데이터로부터 전이 상태 이론을 이용하여 수학 식 1 및 2 (B) 열역학적 분석을 이용하여 얻어진 K M 값 및 실험 데이터의 선형 피팅의 (b)에서의 플롯으로부터 계산 활성화 3. (C) 열역학적 파라미터 방정식. prefolded 스쿠알렌 기판은 채권으로 표시됩니다 형성 / 점선으로 깨진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 다른 기판에 대한 야생형 및 터널 변이체의 활성화도 3 열역학적 파라미터. (A) 상대 K 고양이 / 식 4 (B)를 이용하여 원 - 포트 (one-pot) 반응 속도로부터 수득 K M 값이 다른에서 속도 데이타 열역학적 플롯 5. 수식 (C) 및 식 (6)에 의해 기준으로서도 2에 기재 스쿠알렌을 이용하여 산출 활성화의 절대 열역학적 파라미터를 이용하여 온도. 형성 / 기판 깨진 채권이 점선으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

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8.9K 조회수.  KTH Royal Institute of Technology.  효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다. 

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Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

연구

생체공학

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

작은 올리고머 형성 막 단백질의 침전 평형 : 펜타 머 안정성에 히스티딘 양성자의 효과

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

화학

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

생화학

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The crystal structures build the basis for any calculation that describes the structure or dynamics of a protein, most of the time with strong geometrical restrictions. However, these restrictions from the crystal structure are not present in the solution. The structure of the proteins in the solution may differ from the crystal due to rearrangements of loops or subdomains on the pico to nanosecond time scale (i.e., the internal protein dynamics time regime). The present work describes how slow motions on timescales of several tens of nanoseconds can be accessed using neutron scattering. In particular, the dynamical characterization of two major human proteins, an intrinsically disordered protein that lacks a well-defined secondary structure and a classical antibody protein, is addressed by neutron spin echo spectroscopy (NSE) combined with a wide range of laboratory characterization methods. Further insights into protein domain dynamics were achieved using mathematical modeling to describe the experimental neutron data and determine the crossover between combined diffusive and internal protein motions. The extraction of the internal dynamic contribution to the intermediate scattering function obtained from NSE, including the timescale of the various movements, allows further vision into the mechanical properties of single proteins and the softness of proteins in their nearly natural environment in the crowded protein solution.

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

The present protocol describes methods for investigating the structure and dynamics of two model proteins that have an important role in human health. The technique combines bench-top biophysical characterization with neutron spin echo spectroscopy to access the dynamics at time and length scales relevant for protein interdomain motions.

중성자 스핀 에코 분광법을 통한 단백질 역학 연구

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

공학

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This feature is attributed to the mechanical and dynamic properties of the cell cytoskeleton, notably, the actomyosin cytoskeleton, which is an active gel of polar actin filaments, myosin motors, and accessory proteins that exhibit intrinsic contraction properties. The usually accepted view is that the cytoskeleton behaves as a viscoelastic material. However, this model cannot always explain the experimental results, which are more consistent with a picture describing the cytoskeleton as a poroelastic active material-an elastic network embedded with cytosol. Contractility gradients generated by the myosin motors drive the flow of the cytosol across the gel pores, which infers that the mechanics of the cytoskeleton and the cytosol are tightly coupled. One main feature of poroelasticity is the diffusive relaxation of stresses in the network, characterized by an effective diffusion constant that depends on the gel elastic modulus, porosity, and cytosol (solvent) viscosity. As cells have many ways to regulate their structure and material properties, our current understanding of how cytoskeleton mechanics and cytosol flow dynamics are coupled remains poorly understood. Here, an in vitro reconstitution approach is employed to characterize the material properties of poroelastic actomyosin gels as a model system for the cell cytoskeleton. Gel contraction is driven by myosin motor contractility, which leads to the emergence of a flow of the penetrating solvent. The paper describes how to prepare these gels and run experiments. We also discuss how to measure and analyze the solvent flow and gel contraction both at the local and global scales. The various scaling relations used for data quantification are given. Finally, the experimental challenges and common pitfalls are discussed, including their relevance to cell cytoskeleton mechanics.

The Mechanics of Poro-Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

In this work, an in vitro reconstitution approach is employed to study the poroelasticity of actomyosin gels under controlled conditions. The dynamics of the actomyosin gel and the embedded solvent are quantified, through which the network poroelasticity is demonstrated. We also discuss the experimental challenges, common pitfalls, and relevance to cell cytoskeleton mechanics.

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral budding, among other vital cellular processes. For efficient biological activity, cell membranes should be rigid enough to maintain the integrity of the cell and its compartments yet fluid enough to allow membrane components, such as proteins and functional domains, to diffuse and interact. This delicate balance of elastic and fluid membrane properties, and their impact on biological function, necessitate a better understanding of collective membrane dynamics over mesoscopic length and time scales of key biological processes, e.g., membrane deformations and protein binding events. Among the techniques that can effectively probe this dynamic range is neutron spin echo (NSE) spectroscopy. Combined with deuterium labeling, NSE can be used to directly access bending and thickness fluctuations as well as mesoscopic dynamics of select membrane features. This paper provides a brief description of the NSE technique and outlines the procedures for performing NSE experiments on liposomal membranes, including details of sample preparation and deuteration schemes, along with instructions for data collection and reduction. The paper also introduces data analysis methods used to extract key membrane parameters, such as the bending rigidity modulus, area compressibility modulus, and in-plane viscosity. To illustrate the biological importance of NSE studies, select examples of membrane phenomena probed by NSE are discussed, namely, the effect of additives on membrane bending rigidity, the impact of domain formation on membrane fluctuations, and the dynamic signature of membrane-protein interactions.

This paper describes the protocols for sample preparation, data reduction, and data analysis in neutron spin echo (NSE) studies of lipid membranes. Judicious deuterium labeling of lipids enables access to different membrane dynamics on mesoscopic length and time scales, over which vital biological processes occur.

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...