The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.

(1)에 실리 컴퓨터 모델링 <ol><li> 단백질 데이터 은행 (PDB)에서 관심의 단백질의 PDB 구조를 다운로드합니다. 과량의 서브 유닛을 분리 한 후 &quot;셀 중화 및 P K 예측&quot;YASARA 16의 실험을 사용하여 누락 된 수소 원자는 명시하고 용매를 첨가함으로써 구조체를 준비한다. 막 결합 된 트리 테르펜 cyclases 들어, 워터 박스의 적합한 사이즈 91x67x77 Å이다. 수동으로 촉매 활성 아미노산의 양성자 상태를 조정합니다. 참고 : PDB 파일의 기판 아날로그 &quot;편집 | 교환 | 아톰&quot;을 사용하여 실제 기판에 수정 될 수 있습니다 필요한 경우 명령을. </li><li> 황색 포스 필드 스위트 (17)를 사용하여 &quot;에너지 최소화&quot;명령에 의해 구조를 최소화합니다. 장거리 정전 기적 ​​상호 작용을 고려하여 입자 메시에 발트 방식 (PME) (18)를 사용합니다. 따라서 반 데르 발스 상호 작용에 대한 차단을 설정표준 설정. 주 : 수렴에 도달 할 때까지 &quot;에너지 최소화&quot;명령 다음 짧은 최대 경사 최소화, 시뮬레이트 어닐링에 의해 구조적 응력 제거 (시간 단계 2 FSEC 0.9 매 10 번째 단계에서 축소 원자 속도)이 수행된다 (즉, 에너지의 향상 ) (200) 단계에서 원자 미만 0.012 킬로 칼로리 / 몰. </li></ol> 활성 부위 매화와 물 접근 2. 모델 <ol><li> 모의 어닐링 후, 20 NSEC 분자 역학 (MD) 궤도를 실행하고 &quot;파일 | 저장 | 시뮬레이션 스냅 샷&quot;적어도 10 스냅 샷을 생성 &quot;시뮬레이션&quot;다음 명령을 실행합니다. 정규 앙상블에서주기적인 경계 조건으로 표준 컴퓨터 시뮬레이션을 실행합니다. Berendsen의 온도 조절기를 사용하여 298 K의 온도를 유지한다. </li><li> 모든 물 분자와 최종 리간드 / 기판을 사용하여 삭제하여 2.1에서 얻은 스냅 샷을 준비4; 수정 | 삭제 | 중첩 잔류 &quot;에 의해 원래의 PDB 구조에 개별적으로 명령 중첩 각각의 스냅 샷.&quot;| 개체 &quot;명령은 모든 구조가 동일한 공간 위치를 공유 할 수 있도록 새로운 PDB로이 방법으로 제조 된 각각의 스냅 샷을 저장합니다. - 파일 (사용 &quot;파일 | 다른 이름으로 저장 | PDB&quot;명령). 경험 모델러의 경우 : 참고 : 보조 코드 파일 1에 주어진 템플릿에 따라이 프로세스를 자동화하는 스크립트를 작성합니다. </li><li> 소프트웨어 동굴 탐험가 3.0 (19)에 입력으로 3D 공간에 정렬 된 2.2에서 준비된 스냅 샷 (PDB)를 사용합니다. 스냅 샷의 제한된 수의 분석을 위해, 표준 컴퓨터를 실행 동굴 탐험가. 물 분자의 수송에 특이 터널의 검출을 보장하기 위해 0.7 Å (19)의 반경 프로브를 사용한다. </li><li> 분자 그래픽 소프트웨어에 의해 생성 된 동굴 탐험가 3.0 터널을 시각화. 터널의 쉬운 시각화를위한, 보충 코드 필에 표시된 매크로를 사용전자 2. </li></ol> 실리 효소 공학 3. 물 패턴 및 물 역학을 수정하는 방법 <ol><li> 동굴 탐험가 3.0 소프트웨어에서 생성 된 출력 파일 &quot;있는 Summary.txt&quot;에 나열된 헤더 &quot;ID&quot;에 따라 가장 높은 순위 터널을 식별합니다. </li><li> 가장 높은 순위 터널 (3.1)과 그 디스플레이 (2.4에서 얻은 모델을 사용) 육안 검사로 채널 내부를 가리키는 작은 사이드 체인을 감 아미노산을 확인합니다. &quot;스왑 잔류&quot;명령을 사용하여 증가 입체 장애에 의한 터널을 차단 하나의 아미노산 치환을 확인합니다. 터널이 단계 프로토콜의 1.2-3.1를 반복하여 다음 육안 검사에 의해 차단되고 있는지 확인합니다. </li></ol> 변이 유전자의 4 식 <ol><li> 겹치지 20 프라이머를 사용하여 PCR 돌연변이 유발 야생형 유전자에 돌연변이를 도입. </li><li> 튜브 관심 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 추가적합한 클로닝 균주의 적격 세포와의 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 42 ° C로 설정 온도와 수조에서 45 초 동안 열 쇼크 형질 전환을 수행한다. 신선한 풍부한 매체의 500 μl를 추가 (2YT는, 16g / L의 트립 톤, 10g / L 효모 추출물, 5g / L의 NaCl)과는 37 ° C에서 부화, 45 분 동안 200 rpm으로. 적절한 항생제로 보충 한천 접시에 형질 전환 된 세포를 도금을 선택합니다. </li><li> 돌연변이 유전자의 DNA 서열을 확인한 후, 전술 한 바와 같이 열 쇼크를 사용하는 발현 균주에 플라스미드 DNA를 변형. 막 결합 트리 테르펜 cyclases의 발현을 위해, BL21 (DE3)를 사용합니다. </li><li> 적절한 항생제로 보충 2YT 미디어에서 발현 균주의 37 ℃에서 5 ML의 O / N 문화를 시작합니다. </li><li> 0.05-0.09의 최종 OD에, 적절한 항생제로 보충 300 ml의 2YT 미디어를 포함, 2 L 당황 쉐이크 플라스크에 접종 (600 nm에서 측정). 0.6-0의 외경에서 유도 한 후.도 8 및 단백질 발현, -80 ° C에서 세포 펠렛을 동결 및 저장. <ol><li> pD861 벡터에 막 결합 트리 테르펜 cyclases 들면, 단백질 (21)의 높은 수율을 달성하기 위해, 37 ℃에서 0.5 mM의 발현 시간이 람 노스 2 및 4로 유도한다. </li></ol></li></ol> 일반 원심 분리기 및 단백질 정제를 사용하여 5 막 추출 <ol><li> 다음의 버퍼를 준비한다 재현 탁 완충액 (100 mM의 인산 칼륨을, 프로테아제 억제제 정제로 보충 된 pH를 7.5), 세제 완충액 (1 % (v / v) 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5) 및 반응 완충액 (0.2 % 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5). <ol><li> 스쿠알렌 hopene의 cyclases 또는 낮은 pH 최적 다른 막 결합 효소, 시트르산 완충액에 재현 탁 인산 칼륨을 대체. 세제 완충액 (1 % 트리톤 X-100 : 효소에 대해 다음 버퍼를 사용60 mM의 시트 레이트, 산도 6.0)과 반응 버퍼 (0.2 % 트리톤-X 100, 60 mM의 시트 레이트, pH를 6.0). 주의 : 그 태그는 정제를 위해 사용되는 경우, 20 mM의 이미 다졸 (최종 농도)로 재현 탁 버퍼를 보충. </li></ol></li><li> 유리 비커에서 냉동 된 세포 펠렛의 무게. / ㎖ 0.3 g 세포의 최종 농도로 재현 탁하여 균질화 완충액에 세포를 재현 탁. 80 %의 진폭에 1 초 1 초 오프 펄스 초음파로를 Lyse은 재현 탁 세포. 50 초 각의 세 가지 반복주기를 사용합니다. </li><li> 0.2 % (v / v)의 세제의 최종 농도 세제 버퍼를 추가한다. 1 시간 동안 4 ℃에서 혼합 엔드 오버 엔드에 의해 평형. 4 ° C에서 50 분 동안 39,000 XG에 하나의 원심 분리 단계 후에 뜨는을 저장하여 막 단백질 부분을 복구 할 수 있습니다. 참고 : 그의 태그 정제를 사용하는 경우, 아가로 오스 / g 세포를 1.5 ml의 니켈 NTA를 추가로 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 첫 번째 정화를 수행이온 교환 또는 그의 태그 정화 (21) 중 하나에 의해 단계. 0.2 % 트리톤 X-100 평형 및 용출 버퍼를 보충합니다. 정제 된 단백질 10 kDa의의 차단과 원심 필터 유닛을 사용하여 다섯 번 집중. 주 : 세제 농도 트리톤 X-100 미셀 결과의 크기를 약 1 %의 최종 농도. </li><li> . (2) 106 × 10 × 4 -8의 구상 단백질 분획 범위와 호환 농축 단백질 및 매트릭스를 사용하는 겔 여과에 의해 정제 연마 공정을 마무리 버퍼를 실행하는 것과 반응 완충액을 사용한다. 제조사의 프로토콜에 따라 브래드 울트라 키트를 사용하여 정제 된 단백질의 양을 측정한다. </li></ol> 6. 속도론 <ol><li> 반응 버퍼에 기판의 신선한 5 밀리미터 주식 솔루션을 확인하십시오. 2-5 분 동안 30 %의 진폭에 초음파에 의한 균일 한 에멀젼을 얻습니다. </li><li> 써모 평형원하는 반응 온도. 외부 온도계로 유리 바이알 함유 물 내부의 온도를 확인한다. </li><li> 단일 기판 속도론을 위해, 동일한 최종 기질 농도에 적어도 다섯 유리 바이알에 유화 기판 희석. <ol><li> 여러 기판 한 냄비 상대적으로 반응 속도, 각 유리 병에있는 모든 기판을 혼합하여 적어도 5 개의 동일한 유리 병을 준비합니다. 소수성 트리 테르펜를 들어, 10 내지 200 μM의 범위의 최종 기질 농도를 사용한다. </li></ol></li><li> 10 분 동안 써모 유리 바이알을 Preinc​​ubate. 효소를 첨가하여 반응을 개시. 1 ml의 총 반응 부피가 적합하다. 적어도 1,200 rpm의 진동 속도를 사용합니다. </li><li> 500 ㎕의 에틸 아세테이트를 첨가하여 서로 다른 시점에서 반응을 정지 통합 표준 100 μM의 데칸으로 스파이크. </li></ol> 7. 추출 및 열역학적 분석 <ol><li> 에 의해 반응 혼합물을 추출텍싱 수동으로 1 분 동안 격렬하게 유리 병을 흔들어. 실온에서 10 분 동안 테이블 상단 원심 분리기에서 9,600 XG에 유리 튜브를 원심 분리기. 빈 튜브 상단 층 (유기상)를 전송합니다. 반응 튜브에 추출 용매의 추가의 500 μl를 첨가하고 추출 과정을 반복한다. </li><li> 나 2 SO 4와 추출 된 반응 혼합물을 건조. 5 초 동안 소용돌이 및 튜브 10 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 실온에서 1 분 동안 9,600 XG에서 최종 원심 분리 단계를 수행합니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 바이알로 추출한 샘플을 전송. </li><li> (단일 기판 역학에 대한) 기판의 적어도 네 가지 초기 농도 (단일 기판과 경쟁력 역학 모두) 네 개의 서로 다른 온도를 사용하여, 관심있는 각각의 효소 변형에 대한 6.1-7.2 아래의 단계를 반복합니다. </li><li> 이전에 3 설명한 바와 같이 GC 분석을 수행합니다. hydrophob의 분석 비극성 열을 사용IC 펜타 제품. 제품 및 열에 따라, 120 ℃로 오븐 초기 온도를 5 ℃ / 분의 온도 구배를 사용한다. </li><li> 생성물 (들)의 피크 면적을 통합하여 (100 μM에 상당)의 통합 표준의 영역을 이용하여 해당 제품 농도 제품에 피크 면적을 변화. 반응 시간 (t) 대 각 제품 ([P])의 농도를 플롯. 10 % 미만의 전환에 대응하는 데이터 포인트의 선형 회귀 분석을 수행한다. 초기 반응 속도 (0 V)에 따라 장착 직선의 기울기에 의해 주어진다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" /> 참고 : 여러 개의 기판을 하나의 냄비 상대적으로 반응 속도를 들어, V 0는 다른 기판의 영향으로 특정 기판의 초기 속도입니다. </li><li> 단일 기판 속도론, 플롯 V 0 </su해당 기질 농도에 대한 B&gt; / [E]. 겉보기 K 고양이 / K M 값에 따라 그래프의 직선 부분의 기울기에 의해 주어진다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" /> [S]는 기질과의 농도는 [E] 변태. K 고양이에 사용되는 효소의 농도 / K M은 미카엘 상수 위에 촉매 상수 동일시. 각각의 온도와 각 효소 변형에 대한 분석을 반복합니다. </li><li> 단일 기판 속도론 들어, 전이 상태 (22)의 이론에 따라 열역학적 분석을 수행 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" /> K B는 볼츠만 상수, H 플랑크 상수, T 켈빈 온도이며, 기체 상수를 R. K ((LN의 플롯의 선형 회귀 분석을 수행 <sUB&gt; 고양이 / K M) / ((K B 형 *의 T) / H))) 1 / T 대. 활성화 엔탈피 (Δ H ‡) (-slope가) * R 및 활성화 엔트로피 (Δ S ‡)을 (차단) * R에 의해 주어진다에 의해 주어진다. 주 : 마찬가지로, 포화 기질 농도 하에서 분석 수학 식 3에서 일정한 속도로 K 고양이를 사용하여 수행 될 수있다. </li><li> 복수의 기판을 하나의 냄비 상대 동력학 들어 상대적인 겉보기을 구하는 K 고양이 / 23에서 K M 값 : (K 고양이 / K M) / (K 고양이 / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4) 이는 V 0,는 기판과 경쟁 B. 기판에 대한 초기 레이트를 의미 </li><li> 한 냄비 상대 기의 경우다수의 기판과 동력학은 비선형 회귀 분석에 의해, 같은 기준에 비해, B의 활성화의 상대적 열역학적 파라미터를 구하십시오 <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" /></li><li> 활성화 엔탈피 및 참조 화합물의 엔트로피로부터 기판 B에 대한 절대 기동 파라미터를 계산 : <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" /></li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+work:+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations.">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

야생형 막 효소 및 터널 변형 고품질의 실험 열역학 데이터를 달성하는 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 컴퓨터 모델의 1) 발생; 2) 균일하게 정제 된 단백질; 3) 유화 기판 주식; 4) 반응 속도 동안 온도 제어; 내부 표준 물질을 사용하여 반응 혼합물의 5) 추출. 컴퓨터 모델의 생성은 매우 다양한 플랫폼을 지원하는 사용자 친화적 인 인터페이스와 소프트웨어의 사용에 의해 용이하게된다. 따라서,이 프로토콜은 심지어 비 전문가를 모델링에 대한 우리의 전략에 액세스 할 수 있도록하기 위해 YASARA 모델링 스위트 (16)과 같다. 물 터널 식별을위한 컴퓨터 모델은 이상적으로 관심 (24)의 효소의 결정 구조에 기초한다. 이 목적을 위해, 단백질 데이터 뱅크에서 사용할 결정 구조의 부 매우 유익하다. 우리의 경험, TEM의 성공적인 준비의 핵심 측면에서터널 식별 판은 결정 물을 유지하는 것입니다. 그것은 보통 컴퓨터에서 실행될 수있는 분자 동력학 시뮬레이션을 수행 할 때 용해 효소 상자를 사용하여 동일한 중요하다. Alicyclobacillus의 acidocaldarius에서 트리 테르펜 시클 라제는 MD 시뮬레이션 3 중 물에 안정적이다. 그러나, 결정 세제를 유지 및 / 또는 세포막을 이용하여 모방 아마도 확장 MD 시뮬레이션을 허용 할 가능성이 불안정 효소 요구 될 것이다. 이것이 터널 조직의 역학적 특징을 포착하지 않을지라도 매우 어려운 대상 최소화 결정 구조, 프로토콜을 사용하는 중요한 기계적 통찰력을 제공 할 수있는 것이 구상된다. 단일 또는 입력으로 스냅 제한된 수의 기본 모드의 동굴 탐험가 (19)는, 표준 노트북, 비전문가에 의해 사용될 수있다. 경험 3 병목 반경 터널 (즉, 반경에 기초가장 좁은 지점에서)보다 작은 1은 결정 물 분자가 왼쪽 가운데), 예측 터널 (그림 1 내에 상주 특히, 물에 매우 관련이있을 수 있습니다. 한편, 큰 병목 반경과 활성 부위 (10)의 밖으로 상기 기판의 반송을위한 터널을 의미 할 수있다. 보충 공전 스크립트 2 예측 터널 시각화 비전문가에 의해 사용될 수있는 파일. 미래의 실험은 동성 모델은 물 네트워크 및 역학의 원자 론적 연구 할 수 있도록 충분히 높은 해상도 수 있는지 여부를 발표 할 예정. 와 활성 부위에 존재하는 리간드없이, 분자 동력학 시뮬레이션을 수행하는 방법에 빛을 발산, 터널 식별 과정도 중요한 영향을 미치는 것이다. 막 단백질의 속도론은 만만치 않은 도전 (25)를 구성 할 수 있습니다. 프로토콜은 본원 단순한 멤브레인 추출 프로토콜에 기반초 원심 분리기 등으로 고가 장비를 사용하지 않고 막 효소를 얻었다. 마감 연마 스텝과 같은 겔 여과의 사용은 잠재적 잔류 막의 입자를 제거하고, 적합한 세제 환경 (25)을 형성 가능하다. 운동 프로토콜에서 재현 결과를 달성하는 중요한 양태는 초음파에 의해 기판 ​​스톡 용액을 유화이다. 반응 버퍼에 희석 소수성 기판의 간단한 볼텍스 불균일 한 기판 세제 혼합물을 제공합니다. 비 유화 기판 솔루션의 피펫 팅 초기 속도의 정확한 결정을 방지 (정량 GC에 의해 확인) 재생 불가능한 농도에 이르게. 대조적으로, 적절하게 유화 스톡 용액은 피펫 0.98에서 0.99 사이의 범위에있는 R 2 초기 속도의 선형 회귀 분석을 초래한다. 소수성 기판의 또 다른 중요한 측면은 명백하다 기판 용해도및 기판 세제 혼합물 가능. 실제로, 기준 기판과 스쿠알렌 사이 클라 트리 테르펜을 포화시킬 수 없었다. 이러한 이유로 명백한 K 고양이를 들어 / K M 값이 모두 결합 화학의 기여를 포함 할 수있는 여기에 표시됩니다. 그러나, 화학 K 고양이에 대한 속도 제한이 있음을 보여왔다 / 트리 테르펜 cyclases 3 실시한 polycyclization 캐스케이드에 대한 K M. 이것은 외부 온도계 반응 유리관 내부 실제 온도를 확인하기 위해 높은 중요하다. 그럼에도 불구하고, 선형 맞는 서로 다른 온도에서 필수적인 상수 명백한 K 고양이 / K M 값이 변형에 대한 가난한 될 수 있습니다. 이 제로 (그림 2B 및 2C)에 가까운 활성화 엔탈피와 S168F 변종 여기에 (그림 2A)에 대해 강조한다. 매우에 작은명백한 K 고양이의 L 온도에 의존 변경 / K M은 관찰 활성화 엔트로피의 불확실성을 유도 할 수 Δ S ‡ (즉,도 2b에서 선형 그래프의 절편). 원칙적으로, 관측 활성화 엔트로피는 단백질 농도를 측정하여 검출되지 않을 다른 변종 활성 효소의 다른 풍부에 의해 영향을받을 수있다. 이는 한 포트에 여러 기질을 혼합 할 때의 실험 오차가 감소되는 것으로 기대된다. 모든 다른 기판들이 이러한 상황에서 효소의 동일한 양 (수학 식 4)와 상호 작용하기 때문이다. 추출 용매의 사용은 내부 표준 추출 및 / 또는 주입 동안에 GC의 차이를 고려하는 것이 중요하다 타서. 전이 상태 이론 성공적 효소 학 (26)에 사용되어왔다. 이 중요한 이론적 프레임 워크는 원래 해제되었습니다기상에 단 분자 반응에 이미 개발. 그러나, 효소가 주로 고전적 활성화 에너지 장벽 (26)을 낮춤으로써 작업 것으로 밝혀졌다. 하나 본원로 가정 투과 계수는 측정 된 활성화 엔탈피 및 / 또는 엔트로피 영향을 미칠 수있다. 터널링의 기여, 및 전이 상태의 다시 교차와 같은 다른 비 전통적인 효과는 대략 에너지의 약 4 킬로 칼로리 / 몰에 해당하는 촉매 (26)에 1,000 배에 기여할 수있다. 그것은 (328 K,도 2c에서 16 킬로 칼로리 / 몰) 야생형 효소에 의해 표시 활성화 엔트로피 불균일 투과 계수에 의한 이러한 비 - 고전적인 효과보다 훨씬 큰 것을 알 수있다. 프로토콜을 이용하여 야생형 및 변이체 터널 용 활성화 열역학적 파라미터를 비교할 때 전달 계수의 영향은 감소한다. 활성화의 깁스 자유 에너지 (Δ G ‡)는 COMPO입니다enthalpic (Δ H ‡) 및 엔트로피 모두의 SED (- T의 * Δ의 S의 ‡) 용어. 촉매 동안 효소 용매 재구성은 두 매개 변수에 영향을 미칠 수있다. 본 프로토콜은 필요한 생물 물리학 실험 프레임 워크와 관련과 실리에서 사용자 친화적 인 계산 도구의 도구 상자를 조립하여 이러한 현상의 연구를 촉진 할 것으로 예상된다. 방법은 막 결합 효소에 의해 촉매를 포함한 효소 공정의 과다를 연구하는데 유용 할 것으로 예상된다.

물은 생명 1의 화학에 대한 초석을 구성한다. 물 패턴 및 효소 활성 부위의 매화는 엔탈피 및 소수성 효과 2,3- 넘어 연장되는 매우 복잡한 형태로 촉매 1, 2 및 3을 리간드 결합 엔트로피 모두에 영향을 미친다. NMR (4)는도 2 및 열량 용해 단백질의 분자 모델링은 리간드 연관 5-8, 특이 활성 2,9,10위한 구동력을 제공하는 명시적인 물 분자의 역할을 밝혀하는데 사용되어왔다. 여기서 우리는 효소 촉매 반응에 용매 변위 열역학적 영향 (도 1)의 실험적인 평가에 고유 방법론을 제시한다. 우리의 결합 된 전략은 효소 공학, 열역학 분석 (그림 1)과 협력하여 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 기반으로합니다. 이 CATA에 용매 역학의 영향에 대한 추가 빛을 발산 수 있습니다현재 제대로 이해되고 용해,. 용해 효소 활성 부위에 물 매개 수소 결합에 의해 제공 enthalpic 상호 작용을 안정화 엔트로피 처벌 1만큼 오프셋 될 수있다. 5 부피의 물에 비하여 비용이 엔트로피 단백질 캐비티 내에 갇힌 물 분자에 의해 표시 자유도의 감소와 연관된다. 정렬 된 물 분자의 분리 따라서 리간드 연관 (1)과 (3) 촉매에 대한 엔트로피 구동력을 제공 할 수있다. 용매 역학의 핵심은 단백질의 내부와 외부 사이의 용제 4 물 분자의 변위이다. 활성화 에너지, 엔탈피, 엔트로피 (11)에 첨부 변화는 완전히 분자 수준에서 이해되지 않습니다. 활성 효소에 물 수송, 용매 역학의 중요성과 기여도에 대한 책임 개별 터널을 방해함으로써에너지는 (그림 1) 평가 될 수있다. 또한, 상이한 온도에서 한 냄비 동역학 실험을 수행하여, 몇 개의 기판들의 상대적인 열역학적 활성 파라미터 실험 감소 된 수 (도 1, 오른쪽)에서 추출 될 수있다. 우리의 학제 방법은 생활 (12)에 대해 높은 중요도의 다환 테르펜을 생성 복잡한 막 결합 트리 테르펜 시클 라제 효소에 대한 검증됩니다. 프로토콜은 표준 원심 분리기를 이용하여 세포막 단백질의 높은 양 (10 내지 20 ㎎ / ℓ)의 회복을 허용한다. 효소를 물에 전개되지만, 촉매 작용을 촉진하는 용매의 역할은 일반적으로 무시한다. 형상은 전이 상태 (15)와 정전기 상보성 활성 부위를 미리 편성 역학 13,14 단백질 외에도, 물 역학 효율적인 효소 촉매 높은 중요 할 수있다. 여러 학제 기술을 단조하여, 우리의목표는 물 역학과 열역학의 매우 복잡한 연구를 촉진하는 것입니다. 과학계에이 도구는 더 접근 할 수 있도록하는 것은 변경된 활동과 특이성에 대한 효소 공학 및 단백질 설계에 새로운 전략의 발전으로 이어질 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">YASARA</td>
			<td style="width:148px;">YASARA Biosciences</td>
			<td style="width:173px;">http://www.yasara.org/</td>
			<td style="width:479px;">Molecular modeling and simulation program&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">CAVER&#160;</td>
			<td style="width:148px;">CaverSoft</td>
			<td style="width:173px;">http://caver.cz/</td>
			<td>Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bradford Ultra</td>
			<td style="width:148px;">Expedeon</td>
			<td>BFU1L, BFU05L</td>
			<td>Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potter-Elvehjem homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td>432-0205, 432-0217</td>
			<td>Homogenization of frozen cell pellet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer for sample incubation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

효소 촉매 polycyclization 물 역학의 중요성은 실리코 분석 및 검출 터널 후속 시각화 (2 파일에 부가 코드 스크립트를 사용)하여 내포된다. 프로토콜 부 (3) 다음, S168은 Alicyclobacillus acidocaldarius에서의 트리 테르펜 시클 라제 효소의 하나의 터널 라이닝 &quot;핫 스폿&quot;아미노산 잔기 (도 1, 좌측 중간)로 발견된다. 육안 검사 (그림 1, 왼쪽 아래)에서와 같이 실리에 돌연변이 S168F를 도입함으로써, 터널이 막혔습니다. 트리 테르펜 시클 라제 효소에 의해 표시되는 환식 제품의 형성을위한 반응 속도는 온도 (도 2A)에 매우 민감하다. 프로토콜 (섹션 4-7)에 이어, 그것은 발견되는 명백한 K 고양이 / K 그 <su온도가 25 ° C (도 2A)에서 발생할 때, B&gt; 펜타 제품의 형성 야생형 효소에 의해 표시된 M은 fiftyfold을 증가시킨다. 단일 점 돌연변이를 도입하여 개별 터널 블로킹 실험적으로 결정된 절대 겉보기 K 고양이 / K M 값에 큰 영향을 가지며,뿐만 아니라 온도 의존성 (도 2A)에. 실험적으로 결정 운동 매개 변수에서, 선형 열역학 플롯은 식 (3)에 의해 단일 기판 반응 속도 (그림 2B)을위한 프로토콜의 섹션 6-7에 따라 생성됩니다. 차단 된 터널을 품고 변형 관찰 활성화 엔트로피와 엔탈피에 매우 큰 변화는 (그림 2B를 기반으로 그림 2C, 계산) 키 polycyclization 캐스케이드를 촉진 물 역학에 대한 역할을 의미한다. 그 위에변경된 물 터널 활성화의 변경 깁스 자유 에너지를 표시와 함께, 변형 (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, 그림 2B-C). 예를 들어, 303 K에서 S168F 터널 변형 야생 형 효소 16 킬로 칼로리 / 몰에 비해 14 킬로 칼로리 / 몰의 활성화 깁스 자유 에너지를 표시합니다. 제 7의 프로토콜에 따라, 식 (4)는 하나의 냄비 운동 실험에서 추가 기판 (그림 3A)에 대한 명백한 K 고양이 / K M 값의 계산이 가능합니다. 또한, 열역학적 선형 플롯 (도 3b)는 다른 온도 (식 5)에서 경쟁 에세이를 실행하여 구성 될 수있다. 단일 기판 속도론과 유사하게, 기준 화합물에 비해 추가의 기판에 대한 상대적인 활성화 엔탈피 및 엔트로피 readil 아르직선의 절편과 기울기에서 액세스 할 수 y는 실험 데이터에 적합합니다. 활성화의 열역학적 파라미터의 절대 값은 기준 화합물 (식 6)과 관련된 열역학 데이터를 이용하여 산술 가산에서 평가 될 수있다. 본원 프로토콜을 사용하여, 결과를 명확하게 차단 물 터널 크기가 다른 (도 3c)의 기판들에 대한 활성화를 근본적으로 다른 열역학적 파라미터를 디스플레이 막 효소 변종 생성 된 것을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜 개요 :. 실험 단백질 설계 및 열역학적 분석 콘서트에 실리 컴퓨터 모델링에서 효소 촉매 반응에 용매 역학의 영향의 향상된 이해를 할 수 있습니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오</a>여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> 단일 기판 동역학에서 야생형과 터널 변이체의 활성화도 2 열역학적 파라미터. (A) 겉보기 K 고양이 / 실험 데이터로부터 전이 상태 이론을 이용하여 수학 식 1 및 2 (B) 열역학적 분석을 이용하여 얻어진 K M 값 및 실험 데이터의 선형 피팅의 (b)에서의 플롯으로부터 계산 활성화 3. (C) 열역학적 파라미터 방정식. prefolded 스쿠알렌 기판은 채권으로 표시됩니다 형성 / 점선으로 깨진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 다른 기판에 대한 야생형 및 터널 변이체의 활성화도 3 열역학적 파라미터. (A) 상대 K 고양이 / 식 4 (B)를 이용하여 원 - 포트 (one-pot) 반응 속도로부터 수득 K M 값이 다른에서 속도 데이타 열역학적 플롯 5. 수식 (C) 및 식 (6)에 의해 기준으로서도 2에 기재 스쿠알렌을 이용하여 산출 활성화의 절대 열역학적 파라미터를 이용하여 온도. 형성 / 기판 깨진 채권이 점선으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

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8.9K 조회수.  KTH Royal Institute of Technology.  효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다. 

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

연구

화학

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

속도 종속 엘립 소메 트리 측정 냉각 얇은 유리 필름의 역학을 확인하는

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

전기 화학 임피던스 분 광 전기 화학 속도 상수 추정을 위한 도구로

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

구형 및 벌레 모양의 Micellar 나노 자기 조립, 분무, 결합 하 여 용 매 기반 구조 제어의 제조

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

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Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital structural and protective role in the development and life of higher plants. Although the intricate mechanisms regulating lignification processes in vivo strongly impact the industrial valorization of many plant-derived products, the scientific community still has a long way to go to decipher them. In a simple three-step workflow, the dual labeling protocol presented herein enables bioimaging studies of actively lignifying zones of plant tissues. The first step consists in the metabolic incorporation of two independent chemical reporters, surrogates of the two native monolignols that give rise to lignin H- and G-units. After incorporation into growing lignin polymers, each reporter is then specifically labeled with its own fluorescent probe via a sequential combination of bioorthogonal SPAAC/CuAAC click reactions. Combined with lignin autofluorescence, this approach leads to the generation of three-color localization maps of lignin within plant cell walls by confocal fluorescence microscopy and provides precise spatial information on the presence or absence of active lignification machinery at the scale of plant tissues, cells and different cell wall layers.

BLISS, a dual labeling protocol for studying lignification dynamics, was developed. Using synthetic monolignol reporters and a sequential combination of SPAAC and CuAAC bioorthogonal click reactions, this methodology paves the way to in-depth analysis of the factors that regulate the biogenesis of lignins in planta.

Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

F− 의 310 Nm 분리에 의해 설명 하는 음이온의 광전자 이미징

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...