다음 프로토콜은 중간 산란 기능을 측정하고 용액에서 단백질의 역학을 조사하기 위해 중성자 스핀 에코 실험을 설정하는 방법을 제시합니다. Neutron Spin Echo Spectroscopy의 가장 큰 장점은 피코에서 나노초 시간 척도로 단백질 도메인과 하위 도메인의 재배열을 볼 수 있다는 것입니다.이 범위는 거의 자연 환경과 혼잡 한 단백질 용액에서 단백질의 슬로우 모션의 범위입니다. 중성자 스핀 에코는 또한 동위원소 구성에 민감하여 콘트라스트 매칭을 사용하여 매우 구체적이고 표적화 된 연구를 가능하게합니다.
단백질 도메인 역학에 대한 통찰력은 단백질의 도메인 움직임을 생물학적 기능과 함께 전달하는 진행중인 어려운 작업에서 생물 물리학 연구의 주요 부분입니다. 여기에 제시된 프로토콜은 일반적으로 SNS-NSE 분광계에서 수행되는 모든 중성자 스핀 에코 측정에 적용될 수 있으며, 샘플 선택에 관계없이 연질 물질 물질의 영역 내에 머무르는 경우 적용됩니다. 실험을 설정하려면 단백질 샘플의 농도, 측정에 필요한 온도 및 사용 가능한 용액의 양을 기준으로 로딩되는 세포 샘플의 두께를 선택하여 시작합니다.
인산염이없는 접시 세제, 탈 이온수 및 70 % 디에탄올로 세포를 청소하십시오. 대류 오븐에서 세포를 건조시킵니다. 네 밀리리터의 단백질 용액을 세포에 넣고 뚜껑으로 닫으십시오.
왁스 필름 또는 실란트를 사용하여 샘플 셀을 밀봉하십시오. 네 밀리리터의 투석 버퍼를 단백질 샘플 및 씰과 동일한 용기에 담으십시오. 샘플을 빔 라인으로 전송합니다.
셔터를 닫고 분광계 인클로저 동굴 영역으로 들어갑니다. 나사와 홀딩 플레이트를 조여서 알루미늄 샘플 홀더에 샘플 셀을 장착합니다. 흑연 샘플과 단백질 샘플과 동일한 용기에 로딩된 산화알루미늄 분말 샘플을 장착한다.
동일한 홀더를 온도 강제 시스템의 캔에 부드럽게 밀어 넣습니다. 온도 강제 시스템 뚜껑을 닫고 온도 강제 시스템의 대화식 화면에 액세스하여 온도를 원하는 값으로 설정하십시오. 샘플을 빔에 정렬하기 위해 중성자 카메라를 장착합니다.
중성자 스핀 에코 분광법 데이터를 수집하려면 중성자 카메라와 네 개의 독립적인 샘플 조리개를 사용하여 중성자 빔에 샘플을 정렬합니다. Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy 데이터 수집 소프트웨어를 열고 원하는 산란 각도 및 파장에 대한 굴절 스캔을 실행하여 샘플 통계를 수집합니다. 보조 계측기 과학자가 제공한 측정 매크로를 편집하여 각 샘플에 대해 수집된 통계를 기반으로 측정 파라미터를 설정합니다.
명령 프롬프트에서 프로토콜 이름을 입력하고 샘플에 대한 에코를 획득하여 스캔을 시작합니다. ORNL 사용자 자격 증명을 사용하여 Neutron Sciences 원격 분석 클러스터에 로그인하고 시작 세션 단추를 누릅니다. 사용자 디렉토리에서 터미널 창을 열고 소프트웨어 설정 명령을 입력하십시오.
그런 다음 환경 명령을 입력합니다. 홈 디렉터리에서 데이터 감소를 위한 폴더를 만들고 공유 디렉터리에서 제공된 스크립트와 매크로를 복사합니다. 그에 따라 제공된 축소 매크로를 편집, 이름 바꾸기 및 저장합니다.
명령 프롬프트에서 drspine"을 입력하고 Enter 키를 눌러 소프트웨어 축소 환경을 시작합니다. 소프트웨어 환경 내의 명령 프롬프트에 축소 매크로의 이름을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 보조 계측기 과학자가 제공한 Python 스크립트를 축소된 파일 데이터의 이름으로 편집합니다.
제공된 라이브러리에서 맞게 함수를 편집합니다. 명령 프롬프트에서 편집된 스크립트의 이름을 입력하고 Enter 키를 눌러 축소된 NSE 데이터를 읽고, 맞추고, 플롯합니다. IgG 및 MBP 단백질에 대해 NSE에 의해 측정된 중간 산란 기능은 짧은 사년 시간 척도에서 단순한 확산-유사 이완 과정으로부터의 명확한 편차를 보여주며, NSE에 의한 단백질 내부 역학의 접근성을 나타내고, 관찰된 동적 과정을 기술하기 위한 보다 복잡한 모델에 대한 필요성을 나타낸다.
에 의해 개발된 모델을 이용한 두 단백질의 원자 모델링에 의해 적합해진 중간 산란 함수 계산의 결과는 실험 NSE 데이터와 매우 일치하였다. 결과는 더 긴 furrier 시간에 관찰 된 느린 역학이 전반적인 번역 및 회전 확산 과정에 기인 할 수 있다는 것을 증명했으며, 짧은 시간 척도에서 관찰 된 역학은 단백질 도메인의 역학에 기인 할 수 있습니다. 기억해야 할 한 가지 중요한 점은 NSE 측정을 위해 잘 준비되고 깨끗한 샘플이 필요하다는 것입니다.
스핀 에코에 대한 좋은 샘플은 플립 비율이 세 개보다 높으며, 이는 샘플의 일관성과 일관성없는 산란 사이의 비율입니다. 또한 NSE 세포로 시료를 준비하고 시료를 로딩하는 동안 시료 용액은 안전하게 보관되어야 하며 화학적 또는 생물학적 교차 오염이 없어야 합니다. 안전상의 이유로 분광계 인클로저의 입구는 셔터가 닫힌 후에만 시도해야하며 인클로저의 방사선 냉각에 대해 추가 반 시간의 시간이 허용되었습니다.
소각 중성자 산란은 농축 용액에서 단백질의 모양과 구조를 평가하는 데 권장됩니다. NSE 실험 이전 또는 병행하여 수행 할 수 있습니다. 동적 광산란 및 점도 측정과 같은 추가 방법은 농축된 단백질 용액 내의 번역 확산 및 유체역학적 상호작용에 대한 정보를 제공하며, 또한 권장된다.
