이 프로토콜은 생물학적 기능과 지질 막의 실용적인 응용에 대한 관련성의 집단 막 변동에 대한 성공적인 중성자 스핀 에코 연구에 필요한 샘플 준비 및 데이터 감소를 설명합니다. NSE는 다른 기술로는 접근할 수 없는 선택적 멤브레인 특징을 조사하기 위한 동위원소 감도의 독특한 이점을 통해 주요 멤브레인 기능의 나노초 타임스케일에 직접 멤브레인 역학에 접근합니다. 나노 스케일에 막 역학의 연구는 분자 메커니즘의 기본 막 속성 및 다양 한 세포 병리에 연루 된 막 단백질 상호 작용을 이해 하는 데 필수적이다.
이 방법은 성공적인 실험 및 후속 데이터 감소 분석 및 해석을 위해 지질 소포를 설계, 준비 및 특성화하는 방법에 대한 상세한 지침을 NSE에 새로운 연구원에게 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 테샤니 쿠마리지와 줄리 응우옌, 대학원생 및 실험실에서 학부 생입니다. 후드 내부에서 작업하면 수동 믹싱으로 용매 의 1 밀리리터에 정확하게 계량 된 지질을 용해하여 지질 현탁액을 준비합니다.
유리병에 불활성 가스를 부드럽게 스트리밍하면서 천천히 비스듬히 회전하여 지질 용액을 건조시다. 잔류 용매를 철저히 제거하려면 바이알을 진공 오븐에 35도의 진공 오븐에 밤새 놓습니다. 다음 날, 지질 필름에 2밀리리터의 중수로 수분을 공급하여 밀리리터당 50밀리그램의 지질 농도를 얻고 지질 필름이 완전히 용해될 때까지 수화 지질 현탁액을 소용돌이시킵니다.
다음으로, 동결 될 때까지 영하 80도에서 수화 지질 현탁액의 유리병을 저장하여 5 개의 동결 해동 주기를 수행하십시오. 그리고 지질 현탁액을 해동하기 위해 섭씨 35도의 수조로 옮김합니다. 다음 주기로 진행하기 전에 균일 할 때까지 해동 된 서스펜션을 소용돌이.
실험을 시작하기 전에 두 멤브레인 지지대 사이에 폴리 중탄산염 멤브레인을 사용하여 압출기 설정을 조립하고 각 측면에 두 개의 종이 필터를 추가하여 추가 지원을 제공합니다. 밀폐 유리 주사기를 사용하여 막 조립을 통해 0.3 밀리리터의 중수를 여러 번 전달하여 폴리카보네이트 멤브레인에 수분을 공급합니다. 멤브레인을 수화한 후, 준비된 유백색 지질 용액을 한쪽 끝에 넣고 압출기 장치의 반대쪽 끝에 빈 주사기를 삽입합니다.
주사기가 연결되면 어셈블리를 압출기 블록에 넣습니다. 속도 버튼을 누르고 압출 속도를 입력하고 직경 버튼을 눌러 주사기 직경을 입력하여 펌프를 프로그래밍합니다. 그런 다음 빛이 켜집니다 때까지 철회를 누릅니다.
시동을 누르고 샘플이 빈 주사기에 분배되기 시작할 때까지 기다립니다. 샘플 주사기가 완전히 비어 있기 직전에 정지 버튼을 누르십시오. 디스펜싱 된 볼륨을 기록한 다음 위상 1이 화면에 나타날 때까지 속도 버튼을 누를 수 있습니다.
인출 표시등을 끄고 볼륨 버튼을 눌러 이전에 기록된 분배 된 볼륨을 입력합니다. 속도 버튼을 다시 누르고 오른쪽 최대 화살표를 사용하여 2단계에 액세스합니다. 볼륨을 눌러 이전에 기록된 분배 된 볼륨의 동일한 값을 입력합니다.
이 단계에서는 인출 표시등이 켜집니다때까지 인출 버튼을 누릅니다. LP:SE가 화면에 나타날 때까지 볼륨 버튼을 눌러 3단계의 주기를 반복하고 20으로 설정합니다. 마지막으로, 속도 버튼을 누르고, 4단계에 액세스하고, 볼륨 버튼을 눌러 정지 기능을 클릭하여 펌프 설정을 완료합니다.
펌프가 프로그래밍된 후 시작을 눌러 압출 주기를 시작합니다. 측정을 위한 깨끗한 유리병에 투명한 오팔 블루 압출 지질 현탁액을 수집하기 전에 15~20회 압출 주기를 수행합니다. DAVE 소프트웨어를 열고 데이터 감소 메뉴에서 NSE 데이터 감소를 선택합니다.
파일 메뉴에서 열린 에코 파일을 사용하여 다른 Q 값위에 데이터 파일을 업로드합니다. 업로드된 파일은 사용 가능한 데이터 집합 아래에 표시됩니다. 선택한 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 샘플, 셀 또는 해상도와 같은 측정에 따라 레이블을 지정합니다.
데이터 집합 탭을 사용하여 검출기 픽셀을 2 X 2로 그룹화하여 신호 대 노이즈 비율을 개선합니다. 해상도, 셀 및 샘플의 모든 파일에 동일한 비닝을 적용합니다. 모든 픽셀 그룹에서 데이터를 검사하고 키보드의 끝 키를 눌러 신호가 좋지 않은 데이터를 마스크합니다.
Enter를 눌러 팝업 창에 액세스하여 네 번 모두에 동일한 마스크를 적용합니다. 마스크된 픽셀은 녹색으로 바뀝니다. 수집된 데이터가 에코 신호의 형태로 되어 있는지 확인합니다.
업로드된 파일 목록에서 원하는 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 맞춤 작업을 선택하여 해결 방법 파일을 피팅하기 시작합니다. 에코 신호의 적합이 합리적인 피팅 매개 변수를 생성하도록 합니다. 전체 검출기에서 각 피팅 매개 변수와 관련된 오류를 검사하려면 이미지 옵션을 선택한 다음 관심 있는 피팅 매개 변수를 선택합니다.
그런 다음 감지기 이미지를 마우스 오른쪽으로 클릭하여 오류 표시줄 맵을 표시하는 팝업 창에 액세스합니다. 특정 픽셀에 대한 적합성이 만족스럽지 않은 경우 신호를 선택하고 피팅 탭을 누른 다음 Fit Pixel을 눌러 해당 픽셀 위에 신호를 다시 맞춥시게 합니다. 피팅 탭에서 위상 및 기간에 대한 새 시작 매개 변수를 입력합니다.
업로드되고 레이블이 표시된 파일 목록에서 해당 파일을 선택하여 샘플 파일을 줄입니다. 위에서 설명한 대로 모든 픽셀을 검사하고 불량 픽셀을 마스크합니다. 그런 다음 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 맞춤 작업, 가져오기 단계를 선택합니다.
해상도 파일의 경우 해상도에서 가져온 기간값과 에코 위상점의 값이 변경되지 않은 에코 신호를 미리 설명한 대로 맞춥시게 합니다. 일반 탭에 액세스하고 실험에서 기록된 X 및 Y 빔 센터 값을 입력하여 모든 데이터 파일에 대한 빔 센터를 입력합니다. 피트가 완료되면, 장착 된 파일 목록에서 원하는 샘플 파일을 오른쪽으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 Q의 I 계산을 선택하여 정규화 된 중간 산란 함수를 계산합니다.
해상도 및 셀 파일 및 팝업 창의 Q-arc 수에 필요한 정보를 입력한 다음 확인을 눌러 결과를 봅니다. 시안의 데이터는 검출기 가장자리 효과로 인해 신호가 좋지 않으며 다른 Q 데이터 세트를 컴파일할 때 제거해야 합니다. 마지막으로 감소된 데이터 집합을 ASCII 파일로 저장하고 전체 세션을 원하는 폴더에 DAVE 프로젝트로 저장합니다.
이 연구에서는, 다른 중음 계획으로 제조된 리포소말 견본의 NSE 측정이 수행되었습니다. 멤브레인 굽힘 변동의 NSE 측정은 완전히 대조된 리포솜에서 수행됩니다. 이 중음 제표는 멤브레인 코어와 중음 유체 환경 사이의 큰 산란 길이 차이를 초래하여 리포소말 멤브레인의 산란 신호를 크게 향상시키고 굽힘 역학의 측정 통계를 향상시킵니다.
한편, 리포솜의 멤브레인 두께 변동의 NSE 측정은 Q에 비해 편차를 벤딩 변동의 세 번째 의존도에 나타낸다. 두께 변동 신호를 격리하기 위해, 얻어진 신호는 Q로 3분의 1로 나뉘고, 초과 역학은 Q.이 방법은 고농도 및 강한 산란 신호의 샘플로 더 달성 가능한 양질의 데이터에 우발적이다. NSE가 조사한 역학은 중수소 NMR 이완과 분자 동적 시뮬레이션을 통해 시너지 효과를 통해 분자 지질 구조와 패킹 모티프가 멤브레인 기능에 미치는 영향을 보여줍니다.
지질 막에 대한 NSE 연구는 막 생물 물리학, 막 구조 및 역학의 복잡한 관계, 막 기능 및 막 단백질 상호 작용에 미치는 영향에 대한 새로운 빛을 발산합니다.
