이 작품은 의료 시스템 공학 연구소 (iMSE) GIST에서 GIST-Caltech의 공동 기금 (K04592)에서 부여에 의해 과학, ICT와 미래 기획의 교육부에 의해 투자 한국의 NRF을 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다 (NRF-2013R1A2A2A01067890).

모든 절차는 과학 기술 (GIST) 광주 연구소의 제도적 지침에 따라 수행되었다, 모든 절차는 GIST에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 사전의 lesioning 단계 <ol><li> 내부 캡슐의 앞다리 지역의 식별 AAV-GFP를 사용하여 <ol><li> 기관 및 국가 가이드 라인을 준수 - (13주 ~ 400g, 11) 하우스 스프 라그 돌리 쥐를 처리합니다. </li><li> 적절한 살균 (스팀 또는 플라즈마 살균기)를 사용하여 모든 수술 도구와 전극을 소독. 살균 30 분, 건조 30 분 설정으로 121 ° C에서 증기 멸균기를 사용합니다. </li><li> 근육 주사로 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 동물을 마취. 발 끼에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 가열 패드 아래로 37.5 ± 0.5 ° C의 체온 유지동물의 몸. </li><li> 귀 바, 입 홀더를 사용하여 정위 프레임에 동물을 배치합니다. </li><li> 면도하고 70 % 알코올, 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위를 소독. 수술 중 통증을 감소시키기 위해 의도 된 두개골 절개 영역 두피 하에서 2 %의 리도카인 염산염을 침투. </li><li> 눈의 건조를 방지하기 위해 수의사 안과 연고를 적용합니다. 수술 사이트 동물을 통해 멸균 드레이프를 놓습니다. 무균 조건에서 모든 절차를 유지한다. </li><li> 메스를 사용하여 2cm의 정중선 두개골 절개를 수행하고 와이어 견인기와 양자 피부를 철회. 면봉 30 % 과산화수소와 두개골을 건조. </li><li> 운동 피질의 앞다리 영역을 통해 핸드 피스 드릴 사용하여 구멍 확인하고 바이러스 주입을위한 마이크로 currette와 기관을 취소 (AP를 : +2.5을 브레 그마에서, ML을 중간 선에서 2.5 ±). </li><li> 얼음의 부하 1 μL의 AAV-GFP (2 × 12 바이러스 분자 / ㎖)을 해동10 μL 주사기에 바이러스. 정위 프레임에 주사기를 놓습니다. </li><li> 미리 만들어진 구멍에 바늘을 이동하고 경질에 깊은 바늘 1mm를 내립니다. </li><li> 바이러스 서서히 (0.1 μL / 분) 고정밀 마이크로 펌프를 사용하여 주입하고 바이러스 밖으로 확산 될 수 있도록 추가로 10 분 동안 위치에 바늘을 떠난다. </li><li> 식염수 관개와 수술 부위를 청소 한 후, 3-0 나일론 봉합사로 상처를 보호; 정위 프레임으로부터 래트를 분리 및 회수 챔버로 옮긴다. 수술 후 통증 조절을위한 근육 주사를 통해 케토 프로 펜 (2 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 가열 패드와 신체 온도 (37 ° C)를 유지하고 필요에 피하 주사를 통해 근육 주사하고 2 % 리도카인 염산염을 통해 (0.1 %, 1 ㎖) 두 번째 세대 cephems 수준의 항생제를 관리 할 수​​ 있습니다. 그것을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오흉골 드러 누움. 싱글 하우스 전체 복구 될 때까지 동물. </li><li> 2 다음 - 삼주 복구, 깊이 후드에 근육 주사를 통해 케타민 하이드로 클로라이드 (300 ㎎ / ㎏)의 과다 복용과 함께 쥐를 마취. 발가락 곤란 응답, 맥박, 호흡의 부족으로 동물의 죽음을 확인합니다. 후드의 쥐 부정사를 놓습니다. </li><li> 흉강을 엽니 다 &#39;&#39;추정치 모양의 절개를 통해 복강을 엽니 다. 단단히 지혈과 하행 대동맥 클램프 및 혈액 배수의 쥐 심장의 우심방 파열. 30 분 (10 ml / 분)에 대한 4 % 파라 포름 알데히드 다음 5 분 (10 ml / 분)에 대한 차가운 1 % 파라 포름 알데히드와 심장의 좌심실로 관류를 시작합니다. </li><li> 가위를 사용하여 시체에서 쥐 머리를 제거합니다. 코에 목에서 중간 선 절개를하고 두개골이 노출되도록 가위 또는 rongeur를 사용하여 목 근육을 제거합니다. 조심스럽게 뇌에서 두개골 뼈와 DURAS을 해부하다. </li><li>뇌를 추출하고 밤새 4 % 파라 포름 알데히드로 가득 찬 50ml의 원뿔 관에서 쥐의 뇌를 놓습니다. 다음 날, 1X PBS 3 회 뇌를 씻고 30 % 자당 용액에 넣습니다. </li><li> 뇌 완전히 30 % 자당 용액의 바닥에 가라 후 cryotome에서 -20 ° C에서의 OCT 화합물과 cryomold 뇌를 배치했다. 40 ㎛ 두께 200 μm의 간격으로 관상면에서 뇌 조각입니다. </li><li> 슬라이드 방식 (14)를 사용하여 GFP의 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 차 항체 적용 (1 : 안티 - 녹색 형광 단백질, 토끼 IgG의 분율 200) 뇌 조각에 밤새 4 ° C에서. 2 번째 날에, 트윈 20 (PBST) 용액으로 1 % 인산염 완충 식염수로 3 회 세척 및 이차 항체 (1 : 염소 항 - 토끼 IgG를 500 (H + 1))를 적용, 1 시간 동안. 1 % PBST 3 회와 슬라이드를 씻어. 뇌 조각의 커버 유리를 놓습니다. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 (여기 파장470 nm의 발광 파장 525 nm의, 배율 5 배), 캡슐 내부에있는 AAV-GFP 형질 축삭을 관찰. 형질 도입 축삭의 정위 좌표를 확인하기 위해 쥐 뇌 아틀라스 (15)와 형질 축색 돌기의 위치를 비교 </li></ol></li><li> 캡슐 경색 모델링에 적합 빛 강도의 조정 사전의 lesioning <ol><li> 광학 신경 인터페이스의 건설 <ol><li> 절단 드릴을 사용하여 내부 탐침으로 27 게이지 척추 바늘의 적절한 길이 (4cm)을 잘라. 참고 : 절단 압축 및 척추 바늘 끝을 분쇄 할 수있다; 탐침을 분리하고 척추 바늘의 파쇄 부를 분리하고 척추 바늘의 내부 직경을 유지하기 위해 척추 바늘 끝을 연마. </li><li> 일 측면 패치 코드의 (a 62.5 μm의 코어 125 μm의) 광섬유의 재킷의 적당한 길이 (10cm)를 벗긴다. </li><li> unjacked 광 파이를 삽입BER 금속 튜브 (외부 직경 17mm : 3.8 mm, 내경 : 3.3 mm 길이)로 한 후, 섬유 주위에 클램프된다. 금속관은 광섬유 척추 바늘 허브 사이의 공간을 채우기 위해 유용하다. 회 누름으로 금속관의 1/2 하부 클램프. </li><li> 광파이버에 열경화성 에폭시를 적용하고 척추 바늘에 광섬유를 삽입한다. 허브의 빈 공간에 추가 에폭시를 적용합니다. 안정적인 고정 100 ℃에서 20 분 동안 에폭시 경화. </li><li> 척추 바늘로부터 돌출 된 광섬유를 절단 및 다이아몬드 래핑 (연마) 시트를 사용하여 척추 바늘 끝에 광섬유 연마. </li><li> 그린 레이저 시스템의 커플러 패치 코드의 FC / PC 커넥터 부분을 연결하고 디지털 광 전력 및 에너지 측정기를 이용하여 광파이버의 선단에서의 광 강도를 측정한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Photothrom내부 캡슐에 botic 경색의 lesioning <ol><li> 적절한 살균 (스팀 또는 플라즈마 살균기)를 사용하여 모든 수술 도구와 전극을 소독. 살균 30 분, 건조 30 분 설정으로 121 ° C에서 증기 멸균기를 사용합니다. </li><li> 동물을 마취 (~ 400g, 11-13주)를 근육 내 주사를 통해 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏)의 혼합물. 발 끼에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 동물의 신체 하에서 가열 패드를 통해 37.5 ± 0.5 ° C의 체온을 유지한다. </li><li> 귀 바, 입 홀더를 사용하여 정위 프레임에 동물을 배치합니다. </li><li> 면도하고 70 % 알코올, 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위를 소독. 수술 중 통증을 감소시키기 위해 의도 된 두개골 절개 영역 두피 하에서 2 %의 리도카인 염산염을 침투. 눈의 건조를 방지하기 위해 수의사 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 은 An 통해 멸균 드레이프를 적용imal 및 수술 부위를 노출합니다. 무균 조건에서 모든 절차를 유지한다. </li><li> 2cm의 정중선 두개골 절개를 수행하고 와이어 견인기와 양자 피부를 철회. 면화 스왑 및 과산화수소와 두개골을 건조. </li><li> 브레 그마 및 람다는 동일한 수준으로 정렬 될 때까지 코 클램프의 높이를 조정한다. CRITICAL STEP이 올바르게 정렬 같은 메인 실험 내부 캡슐 경색 병변을 수행 같이 깊은 구조에 접근하는 것이 중요하다. </li><li> 구멍 만들기 (직경 : 2mm, AP : 브레 그마에서 -2.04; ML을 : 중간 선에서 3.0 ±) photothrombosis을 유도하기 위해 드릴을 사용. </li><li> 폴란드와 광학 인터페이스의 광섬유 팁 청소. 굽​​힘없이 정위 프레임에 ONI을 수정합니다. ONI의 끝을 확인하기 전에 광학 인터페이스의 삽입 후 명확하게 그것을 닦아냅니다. </li><li> 하기 Optica의 삽입 전에 광파이버의 선단으로부터 레이저의 세기를 측정래트 뇌의 표적 부위 L 인터페이스. 광섬유의 선단에, 수술 전 단계에서 확인한 결과, 3.5 mW의 레이저로 농도를 조정. </li><li> 내부 캡슐의 대상 영역에 드릴 구멍을 통해 (전 수술 단계에서 확인 -7.8 mm을)를 ONI를 삽입합니다. </li><li> photothrombosis 동안 37.5 ± 0.5 ° C의 체온을 유지한다. 낮은 체온은 경색의 예상 범위를 생산하지 않을 수 있습니다. 꼬리 정맥을 통해 장미 벵골 (2 ㎖ / kg)을 주입한다. </li><li> 로즈 벵갈 주입 후 90 초 1 분 동안 532 nm의 녹색 레이저를 켭니다. 조사 후, 부드럽게 뇌에서 ONI를 제거합니다. 수술 부위를 청소 한 후, 상처는 3-0 나일론 봉합사로 상처를 고정 확보; 정위 프레임으로부터 래트를 분리 및 회수 챔버로 옮긴다. </li><li> 가짜 운영 그룹 (SOG)의 경우, 대신 로즈 벵갈 식염수의 주입 (0.2 ㎖ / 100g)을 제외하고, 동일한 병변 결정 절차를 수행합니다. </li><li>수술 후 가열 패드, 체온 (37 ℃)을 유지하고, 근육 내 주사를 통해 항생제 (2 세대 세 팔로 스포린, 0.1 %, 1 ml)에 투여. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물에 의해 점유 된 케이지에 수술 후 동물을 반환하지 않습니다. 주 : 예비 실험이 5 mW의 1 mW의 최적의 광 강도를 찾기 위해 동일한 과정을 수행하고, 절차는 다른 상태 병변의 양호 정도를 얻기 위해 요구 될 수있다. </li></ol> 캡슐 경색의 lesioning 3. 평가 <ol><li> 행동 테스트 및 동물 그룹화 <ol><li> Whishaw 등의 알에 의해 설명 된대로 작업에 도달 한 펠릿을 수행합니다. 14 스트로크 모델링 후 1 주간 매일 앞다리의 모터 적자를 평가하기 위해. 하나의 펠렛에 도달 작업을 수행1 폭 cm 슬릿 전벽의 중앙의 정면에있어서의 식품 진열 맑은 플렉시 글라스 (30 X 15 X 35cm 높이)를 이용하여 음식 제한 동물 (SPRT) (대조군 체중의 90 %). </li><li> 바람직한 앞다리에 비스듬히 반대편 음식 선반에 펠렛을 놓습니다. 삼주에 대한 세션 당 20 알약을 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 : SPRTs의 성공 수는 동물이 음식 펠렛을 파악하고 그것을 포기하지 않고 입으로 그것을두고있는 범위로 정의된다. </li><li> 다음의 식에 의해 정의된다 성공에 도달의 비율로 점수를 계산한다 : <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53281/53281equation1.jpg" /> 참고 : 우리는 3 그룹으로 동물을 분할 : 가짜 운영 그룹 (SOG), 중간 복구 그룹 (MRG), 가난한 복구 그룹 (PRG). 만약 뇌졸중 후 SPRT 점수&gt; 50 %, 우리는 상당한 병변의 존재를 나타내는 MRG 같은 쥐를 분류하지만, 타 아닌 완전한 파괴rget. 포스트 행정 SPRT 점수가 사전 행정 SPRT 점수에 비해 50 % &lt;있다면, 우리는 대상에서 전체의 lesioning을 나타냅니다 PRG으로 그룹을 분류합니다. </li></ol></li><li> 경색의 lesioning의 Neurohistological 확인 <ol><li> 전술 한 바와 같이 4 % 파라 포름 알데히드와 심장 관류를 수행합니다. 뇌 완전히 30 % 자당 용액 싱크 후, 10 ㎛의 두께 및 마이크로톰 cryotome 또는 4를 사용하여 200 ㎛의 간격으로 관상 절편을 수행한다. </li><li> H &amp; E, Nissl, 룩솔 빠른 블루 PAS, 신경 미세 섬유 단백질-L 또는 폐해 섬유 성 산 단백질 염색 및 조직 학적 소견을 관찰와 얼룩은 염색을 관찰 할 수있는 대상 영역의 내부 캡슐의 전체 폭을 커버 할 수있는 최적의 빛의 강도를 결정하는 4,17. </li><li> ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 뇌 슬라이드 내부 캡슐 photothrombotic 경색 부분의 체적을 측정한다.<ol><li> 경색 부분의 부피를 측정하기 위해, &#39;ImageJ에의 소프트웨어를 실행. 파일을 열려면 선택 &#39;스택에 이미지&#39;( &#39;이미지&#39;→ &#39;스택&#39;→ &#39;스택에 이미지&#39;)를 적층한다. 편집 파일 이름을 선택합니다 규모를 편집 (→ &#39;축척을 설정합니다&#39; &#39;분석&#39;) &#39;축척을 설정합니다&#39;. </li><li> &#39;플러그인&#39;에서 [이미지의 볼륨 또는 면적을 계산하는 &#39;스택을 측정합니다&#39;. &#39;슬라이스 간격&#39;에이 이미지의 거리 간격을 삽입합니다. 모든 이미지의 ROI의 도면 (가볼만한 지역)을 확인하고 &#39;측정&#39;을 클릭합니다. 참고 : 소프트웨어 &#39;ImageJ에&#39;자동 지역과 각 이미지의 볼륨과 그 총량을 계산합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 캡슐 경색 모델은 앞다리의 기능에 현저한 및 영구 모터의 손상과 목표 병변을 보여줍니다. 피질 캡슐 스트로크의 이전 모델은 모터의 손상 및 빠른 복구 프로세스 6,8,9의 부족 정도를 증명하고있다. 이런 의미에서,이 모델은 장기 작용 성 손상을 나타내는 임상 캡슐 경색 케이스를 닮았다. 외접 캡슐 경색 모델의 개발에 가장 중요한 단계는 다음과 같?...

최근까지 &quot;회백질 스트로크 (GMS) 모델은&quot;배타적 스트로크 기전을 이해하고, 새로운 치료법의 개발을 유도하기 위해 사용되어왔다. 모든 스트로크 1, 2의 25 % - 그러나, (15)를 구성하는 노인 개인에 피질 하 백질에 영향을 미치는 뇌졸중의 증가 보급되고있다. 많은 연구는 백질 스트로크 (WMS) 모델을 사용하고 몇 가지 연구가있는 반면, GMS 모델을 사용에 관한 스트로크를 실시하고있다. 설치류에 흰색 물질은 사람이나 영장류에 흰색 물질보다 훨씬 작다. 따라서, 선택적 백질 3 목표 영역을 액세스하고 파괴하는 것이 더 어렵다. 게다가, 더 효율적인 툴을 선택적으로 타겟팅 백질의 계획된 범위를 파괴하는 최신 개발되지 않았다. 따라서, 백질 스트로크의 연구에 적합한 모델의 부족이 있었다. 동물 일roke 모델은 종종 새로운 재활 및 치료 방법의 개발을위한 모터 회복의 진행을 모니터하기 위해 사용된다. 인간의 행정 4,5에서 보여준 해부학 적 변화와 조화 된 장기적인 신경 학적 결손을 나타내는 동물 모델을 활용하는 것이 이상적이다. 이와 관련하여, 모터 적자 및 뇌 다음 경색의 lesioning의 폭 넓은 참여의 신속한 복구 뇌졸중 연구의 추구 현실적인하지 않을 수 있습니다. 이전 캡슐 경색 모델 내부 캡슐 6-9으로 엔도 텔린 -1 (ET-1)의 내부 경동맥 또는 전방 맥락막 혈관 및 확산에 의해 폐색되었다. 그럼에도 불구하고, 동맥 폐쇄 동맥 절개주의를 필요로하지만, 영구 행동 결손없이 내부 캡슐 포함 경색 병변의 넓은 영역을 생성한다. 또한 ET-1을 완전히 캡슐 내부의 후방 다리를 파괴 확산하고, 따라서 적은 표시되거나 BEH을 지속하지 않았다avioral 적자. photothrombotic 경색 모델 널리 피질 경색 병변 및 피질 하 구조 (10)의 다양한 형태를 생성하는 데 사용되어왔다. 이 기술은 경색 병변 (10)의 혈소판 작은 혈관에서 응집 및 생성에 이르게 초점 조명, 다음 정맥 내 투여를 포함한다. 거의 WMS 병변 5,11 생성에 사용되지 않은 반면 Photothrombotic 기술은 광범위 GMS 병변을 만드는 데 사용되고있다. 이 기술의 경우, 로즈 벵갈 염료 및 광 조사의 조합 기능 결핍을 유발 해당 대상 구조의 파괴에 유용한 것으로 입증되었다. 이 경색 병변의 크기를 결정하므로 photothrombotic 기술의 핵심 요소는 광 조사한다. 회색질과 백색질의 다른 효과에 광 조사 결과, 빛의 산란이 흰색 mA 이상 4 배 높기 때문에회색 물질 (12)와 비교 라 자세 히; 빛의 세기가 충분히 낮은 조도 (&lt;1140 mW의 / mm 2)이있는 경우 따라서, 하나는 photothrombotic 병변이 백질에 어느 정도 영향을 미칠하는 확장을 제한 할 수 있습니다 (예. 내부 캡슐). 예를 들어, 높은 에너지의 빛이 모두 회색과 흰색 문제에 경색을 유도 할 수있다, 그러나 낮은 에너지의 빛은 흰색 만에 photothrombosis을 유도 할 수있다. 또한, 광 에너지의 침투가 매우 제한적이었다. 빛 에너지의 약 99 %는 빛 (13)의 소스에서 1mm 이상 끊어졌습니다. 따라서, 정확하게 대상 것으로 예상된다, 낮은 에너지의 빛은 이웃 회색 물질의 최소 침해와 흰색 문제에 photothrombosis을 유도한다. 여기서는 설치류 내부 캡슐의 앞다리 영역 경색 병변을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 우리는 내부 CA의 앞다리 영역의 동정 방법을 서술psule, 조정 및 빛의 전달 및 경색 병변의 발생을 포함하여 광 조사의 기술. 또한 캡슐 모델링의 완전성을 평가하는 행동 시험을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>DC Temperature controller</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.</td><td>ATC1000</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stereotaxic Instruments</td><td>STOELTING CO.</td><td>51900</td><td></td></tr><tr><td>Electrical Stimulator</td><td>CyberMedic Corp.</td><td>EMGFES 2000</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy&amp;nbsp;</td><td>Precision Fiber Products, INC.</td><td>PFP-353ND1</td><td>Mix Ratio:&lt;br/&gt; 10(A):1(B-hardener) by weight&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Curing Schedule:&lt;br/&gt; 1 min @150 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 2 ~ 5 min @120 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 5 ~ 10 min @100 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 15 ~ 30 min @80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fiber Optic Scribe&amp;nbsp;</td><td>THORLABS, INC</td><td>S90R</td><td></td></tr><tr><td>Fiber patch cable</td><td>KOREA OPTRON Corp.</td><td></td><td>Outer diameter: 3 mm&lt;br/&gt; &amp;Oslash;200 &amp;micro;m&lt;br/&gt; 0.39 NA&lt;br/&gt; FC/PC-FC/PC&lt;br/&gt; 1 m</td></tr><tr><td>Laser Power Supply</td><td>CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.</td><td>MGL-FN-532nm-200mW-14010196</td><td></td></tr><tr><td>Crimp ring&amp;nbsp;</td><td>DAWOOTECH CO.,LTD.</td><td></td><td>Length: 19 mm&lt;br/&gt; Inner diameter: 3 mm&lt;br/&gt; Outer diameter: 3.8 mm&lt;br/&gt; Material: SUS</td></tr><tr><td>Micro4-micro syringe pump controller</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>95100</td><td></td></tr><tr><td>Optical Power Meter</td><td>THOLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Diamond lapping (polishing) sheet</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF3D</td><td>Grit : 3 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Diamond lapping (polishing) sheet</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF6D</td><td>Grit : 6 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>SIGMA-ALDRICH CO. LLC.</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle)&amp;nbsp;</td><td>B.BRAUN MELSUNGEN AG&amp;nbsp;</td><td>4502027</td><td>Size: 27 G&lt;br/&gt; Length: 88 mm&lt;br/&gt; Needle: 0.40 mm</td></tr><tr><td>Waterproof sandpaper&amp;nbsp;</td><td>DEERFOS CO.,LTD</td><td>CC261</td><td>Grit : 1,000 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Nanofil 10&amp;nbsp;&amp;micro;l syringe</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33&amp;nbsp;G BVLD needle</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV-GFP virus</td><td>UNC Vector Core</td><td>AAV2-CamKIIa-eYFP</td><td>2 x 10&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt; virus molecules/ml</td></tr><tr><td>Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11122</td><td>primary antibody (1:200)</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11034</td><td>secondary antibody (1:500)</td></tr><tr><td>Ceftezole</td><td>GUJU Pharma CO.,LTD.</td><td>A27802741</td><td>0.1%, 1 ml</td></tr><tr><td>Lidocain hydrochloride injection</td><td>JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD.</td><td>A04900271</td><td>2%, 1 ml</td></tr><tr><td>Hand Piece Drill</td><td>Seshin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital optical power and energy meter</td><td>THORLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>UNIBIOTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

circumscribed capsular infarct modeling using a photothrombotic technique

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for white matter stroke has hampered research investigations. Here, we describe a novel method for creating a circumscribed capsular infarct that minimizes damage to neighboring gray matter structures. We used pre-surgery neural tracing with adeno-associated virus-green fluorescent protein (AAV-GFP) to identify somatotopic organization of the forelimb area within the internal capsule. The adjustment of light intensity based on different optical properties of gray and white matter contributes to selective destruction of white matter with relative preservation of gray matter. Accurate positioning of optical-neural interface enables destruction of entire forelimb area in the internal capsule, which leads to a marked and persistent motor deficit. Thus, this technique produces highly replicable capsular infarct lesions with a persistent motor deficit. The model will be helpful not only to study white matter stroke (WMS) at the behavioral, circuit, and cellular levels, but also to assess its usefulness for development of new therapeutic and rehabilitative interventions.

여기에 제시된 방법은 영구 모터 적자와 외접 캡슐 경색을 만들 것입니다. 따라서, 정확하게 예비 수술 단계에서 내부 캡슐 내에 타겟을 결정하는데 중요하다. 내부 캡슐의 피라미드 섬유의 somatotopic 매핑은 현재까지 해결되지 않았습니다. 제대로 내부 캡슐 내에서 대상을 식별하기 위해, 앞다리 영역을 묘사해야합니다. 운동 피질의 앞다리 영역으로 AAV-GFP의 주입 내부 캡...

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Circumscribed Capsular Infarct Modeling Using a Photothrombotic Technique

이 원고는 캡슐 경색의 모델링 기법에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 미리 수술 대상 매핑​​ 후 빛의 낮은 강도와​​ 변형 photothrombotic 기술을 이용했다. 이 기술을 사용하여, 우리는 지속적인 운동 장애 외접 캡슐 경색 모델을 만들었습니다.

Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

7.8K 조회수.  Gwangju Institute of Science and Technology.  이 원고는 캡슐 경색의 모델링 기법에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 미리 수술 대상 매핑​​ 후 빛의 낮은 강도와​​ 변형 photothrombotic 기술을 이용했다. 이 기술을 사용하여, 우리는 지속적인 운동 장애 외접 캡슐 경색 모델을 만들었습니다. 

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Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected light-sensitive dye. Following illumination, the dye is activated and produces singlet oxygen that damages components of endothelial cell membranes, with subsequent platelet aggregation and thrombi formation, which eventually determines the interruption of local blood flow. This approach, initially proposed by Rosenblum and El-Sabban in 1977, was later improved by Watson in 1985 in rat brain and set the basis of the current model. Also, the increased availability of transgenic mouse lines further contributed to raise the interest on the photothrombosis model. Briefly, a photosensitive dye (Rose Bengal) is injected intraperitoneally and enters the blood stream. When illuminated by a cold light source, the dye becomes activated and induces endothelial damage with platelet activation and thrombosis, resulting in local blood flow interruption. The light source can be applied on the intact skull with no need of craniotomy, which allows targeting of any cortical area of interest in a reproducible and non-invasive way. The mouse is then sutured and allowed to wake up. The evaluation of ischemic damage can be quickly accomplished by triphenyl-tetrazolium chloride or cresyl violet staining. This technique produces infarction of small size and well-delimited boundaries, which is highly advantageous for precise cell characterization or functional studies. Furthermore, it is particularly suitable for studying cellular and molecular responses underlying brain plasticity in transgenic mice.

Photothrombosis is a quick, minimally-invasive technique for inducing small and well-delimited infarction in areas of interest in highly reproducible manner. It is particularly suitable for studying cellular and molecular responses underlying brain plasticity in transgenic mice.

Photothrombotic 국소 빈혈 : 마우스 스트로크 연구를위한 최소 침습 및 재현성 광화학 대뇌 피질의 병변 모델

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected ...

연구

의학

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

영구적 인 뇌 혈관 폐색<em&gt;를 통해</em&gt; 더블 합자 및 절개

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Brain Infarct Segmentation and Registration on MRI or CT for Lesion-symptom Mapping

In lesion-symptom mapping (LSM), brain function is inferred by relating the location of acquired brain lesions to behavioral or cognitive symptoms in a group of patients. With recent advances in brain imaging and image processing, LSM has become a popular tool in cognitive neuroscience. LSM can provide fundamental insights into the functional architecture of the human brain for a variety of cognitive and non-cognitive functions. A crucial step in performing LSM studies is the segmentation of lesions on brains scans of a large group of patients and registration of each scan to a common stereotaxic space (also called standard space or a standardized brain template). Described here is an open-access, standardized method for infarct segmentation and registration for the purpose of LSM, as well as a detailed and hands-on walkthrough based on exemplary cases. A comprehensive tutorial for the manual segmentation of brain infarcts on CT scans and DWI or FLAIR MRI sequences is provided, including criteria for infarct identification and pitfalls for different scan types. The registration software provides multiple registration schemes that can be used for processing of CT and MRI data with heterogeneous acquisition parameters. A tutorial on using this registration software and performing visual quality checks and manual corrections (which are needed in some cases) is provided. This approach provides researchers with a framework for the entire process of brain image processing required to perform an LSM study, from gathering of the data to final quality checks of the results.

Provided here is a practical tutorial for an open-access, standardized image processing pipeline for the purpose of lesion-symptom mapping. A step-by-step walkthrough is provided for each processing step, from manual infarct segmentation on CT/MRI to subsequent registration to standard space, along with practical recommendations and illustrations with exemplary cases.

병변 증상 매핑을 위한 MRI 또는 CT에 대한 뇌 경색 세분화 및 등록

In lesion-symptom mapping (LSM), brain function is inferred by relating the location of acquired brain lesions to behavioral or cognitive symptoms in a ...

행동분석학

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

공 초점 광학 이미징에 의해 로즈 벵갈 Photothrombosis<em&gt; 생체</em&gt; : 단일 선박 스트로크의 모델

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

쥐의 척수 손상의 모델로 초점 국소 빈혈을 Photothrombosis는 유도

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

신경과학

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, there remain limited therapeutic options for stroke patients. Therefore, more research is needed for pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity, and regeneration. Given the inability of in vitro models to reproduce the complexity of the brain, experimental stroke models are essential for the analysis and subsequent evaluation of novel drug targets for these mechanisms. In addition, detailed standardized models for all procedures are urgently needed to overcome the so-called replication crisis. As an effort within the ImmunoStroke research consortium, a standardized photothrombotic mouse model using an intraperitoneal injection of Rose Bengal and the illumination of the intact skull with a 561 nm laser is described. This model allows the performance of stroke in mice with allocation to any cortical region of the brain without invasive surgery; thus, enabling the study of stroke in various areas of the brain. In this video, the surgical methods of stroke induction in the photothrombotic model along with&#160;histological analysis are demonstrated.

Described here is the photothrombotic stroke model, where a stroke is produced through the intact skull by inducing permanent microvascular occlusion using laser illumination after administration of a photosensitive dye.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 포심 피질 병변

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes and are defined as the sudden blockage of a vessel supplying blood to the brain. Within minutes of the blockage, cells begin to die and result in irreparable tissue damage. Current therapeutic treatments focus on clot removal or lysis to allow for the reperfusion and prevent more severe brain damage. Although transient brain plasticity may salvage some of the damaged tissue over time, significant fractions of patients are left with neurological deficits that will never resolve. There is a lack of therapeutic options to treat neurological deficits caused by stroke, emphasizing the need to develop new strategies to treat this growing patient population. Injectable biomaterials are currently being designed to enhance brain plasticity and improve endogenous repair through the delivery of active agents or stem cells. One method to test these approaches is to utilize a rodent stroke model, inject the biomaterial into the stroke core, and assess repair. Knowing the precise location of the stroke core is imperative for the accurate treatment after stroke, therefore, a stroke model that results in a predictable stroke location is preferable to avoid the need for imaging prior to injection. The following protocol will cover how to induce a photothrombotic stroke, how to inject a hydrogel in a controlled and precise manner, and how to extract and cryosection the brain while keeping the biomaterial intact. In addition, we will highlight how these same hydrogel materials can be used for the co-delivery of stem cells. This protocol can be generalized to the use of other injectable biomaterials into the stroke core.

Stroke is a global issue with minimal treatment options and no current clinical therapy for regenerating the lost brain tissue. Here we describe methods for creating precise photothrombotic stroke in the motor cortex of rodents and subsequent injection of hydrogel biomaterials to study their effects on tissue regeneration after stroke.

하이드로겔 생체 재료 비계의 주입 뇌졸중 후 뇌에

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

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