Name: construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo at JoVE.com

우리는 전자 제품에 대한 지원은 G의 qi5 및 G QS5 cDNA를, A. 슈바이처를 제공 B. 콘 클린 (캘리포니아 대학 샌프란시스코)를 감사, N. 테일러 증거 읽기 클론, 이안 Glaaser 로버트 리프킨의 심사에 대한 지원 및 TN-XXL에 대한 올리비에 Griesbeck. (; DA037170 DA029706), 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소 (NIBIB) (EB003832), 호프만 - 라 로슈 (88610A)과 &quot;신경 과학이 작품은 약물 남용에 미국 국립 연구소 (NIDA)를 통해 연구비에 의해 지원되었다 NIDA (DA007315)를 통해 남용 &quot;훈련 보조금의 마약 관련.

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저자는 공개 아무것도 없어.

CNiFERs의 생성은 광학적으로 생체 내에서 뇌의 신경 전달 물질의 방출을 측정하기위한 혁신적이고 독특한 전략을 제공합니다. CNiFERs 이상적으로 신경 전달 물질에 대한 예 extrasynaptic 해제, 볼륨 전도를 측정하기에 적합합니다. 중요한 것은, 각 CNiFER은 뇌의 신경 전달 물질의 농도의 변화 생리 광 측정을 제공하는 천연 GPCR의 특성을 가지고있다. 지금까지 CNiFERs은 아세틸 콜린을 검출 생성 된 (M1-CNiFER) (6), 도파민 (D2-CNiFER) (7)과 노르 에피네프린 (α1a-CNiFER) 7. 주에서, CNiFER는 GPCR을 통해 신호하는 신경 전달 물질 생성 할 수 있습니다. G의 Q G 단백질을 통해 GPCR 신호가 더 이상 수정이 HEK293 세포에 필요하지 않은 경우에 대해. G 통해 신호의 GPCR은 I / O는, 그러나, G의 qi5 키메라 G 단백질의 동시 발현을 필요로부부의 G의 Q / PLC 경로의 7, 10에 GPCR. 마찬가지로, G 용의를 통해 신호의 GPCR은 키메라 G QS5 G 단백질 (10)의 동시 발현이 필요합니다. 완료되면, 각 CNiFER 클론 선별되고 천연 수용체 비교 친화력들만 CNiFER 클론이 거의 또는 전혀 탈감작을 나타내고 생체 이광자 현미경 측정에 적합 신호 대 잡음비를 제공하는, 생체 내 연구에 선택됩니다. 생체 내 연구를 들어, 높은 잠재적 인 면역 반응을 최소화하는 사이클로스포린과 쥐를 치료하는 데 추천된다. 거부 반응의 가능성 또는 설치류 내로 인간 뇌 CNiFER 세포 주입으로 면역 반응이있다. 이것은 CNiFER 주입 다음, GFAP 및 MAC1 7의 발현을 조사함으로써 이전에 조사 하였다. CNiFERs은 아교 흉터를 생산하는 표시 또는 유의을 생성하지 않았다ficant MAC1 7 염색. CNiFERs를 구성에서 고려해야 할 두 가지 주요 문제가 감도와 둔감하다. EC의 50 고유 수용체에 대하여, 즉, 낮은 친 화성이 너무 높다면 그 CNiFER은 생체 내에서 신경 전달 물질의 방출을 검출하기에 충분한 민감도를 가질 수 없다. 한 가지 해결책은 클론을 rescreen 높은 친 화성이 다른 CNiFER 클론을 선택하는 것입니다. 또 다른 전략은 GPCR 활성화에 대한 EC (50)를 전환 할 수 있습니다 높은 칼슘 감도를 가질 수있다 유전자 인코딩 된 형광 칼슘 탐지기, 다른 유형을 테스트하는 것입니다. CNiFER 디자인 모듈러이므로 쉽게 GCaMP 16 유전자 인코딩 칼슘 탐지기의 다른 유형에 적응된다. 같은 수용체하지만 다른 EC (50)의와 CNiFER 클론을 분리하는 것은 내생 NEU의 검출 릴리스의 동적 범위를 확장하는 장점이 될 수있다생체 내에서 rotransmitters. CNiFER의 탈감작은 생체 내에서의 사용을 제한합니다. 최대 반응이 서서히 작용제의 각각의 펄스가 감소하는 경우, 그 수용체 탈감작 될 수있다. 이 경우, 다른 복제본을 검사하고 동일한 방식으로 대응하는지 확인. 수용체의 아미노산 서열 또는 다른 수용체 서브 타입의 사용에 대한 수정 작용제 의존 탈감작을 해결하기 위해 필요할 수있다. G 단백질 수용체 키나제 (GRKs)와 그 동료가 인산화 또는 아미노산 위치가 식별 알려진 경우, 하나 이상의 부위를 돌연변이함으로써 GPCR의 비 탈감작 변이체를 생성하는 것이 바람직 할 것이다. 탈감작 기전은 경우에 따라 각 수용체에 대해 결정되어야한다. 지금까지 CNiFERs는 두 광자 마일과 이미징 형광에 제한을 분광하는 피질 6,7의 표면 층으로 인해 이식 된(17, 18)를 croscopy. 향후 그 CNiFERs는 피질 하 뇌 영역에 이식 될 수 있도록 형광 (19)의 섬유 기반 측정과 CNiFER 기술을 적용하는 것이 가능하다.

완전히 신경 뇌에서 통신하는 방법을 이해하기 위해, 생체 내에서 신경 전달 물질의 방출을 측정하는 방법을 갖는 것이 필요하다. 생체 내에서 신경 전달 물질을 측정하기위한 몇 가지 잘 확립 된 기술이있다. 하나의 일반적으로 사용되는 기술은 캐뉼라 뇌에 삽입 뇌척수액 소량의 수집 및 고성능 액체 크로마토 그래피 및 전기 검사 1을 사용하여 분석되는 미세 투석이다. 미세 투석 프로브 몇 직경 정도의 공간 분해능을 가지며, 예를 들어 ~ 200 μm의 마이크로 프로브 직경 0.5 mm. 이 기법의 시간 해상도는, 그러나, 일반적으로 ~ 5 분 1 이상을 지속 샘플링 간격으로 느립니다. 또한, 분석은 실시간으로 제작되지 않습니다. 다른 기술은 뇌에 삽입되는 탄소 섬유 프로브를 사용하여 고속 스캐닝 순환 전압 전류 법 (FSCV)이다. FSCV 우수한 온도가구강 해상도 (초 단위), 고감도 (나노 몰), 30 μm의 5의 프로브 직경 공간 해상도. 그러나 FSCV는 탄소 전위차 프로브 (2)에 전압 특성 산화 및 환원 프로파일을 생성 송신기들로 제한된다. 신경 전달 물질을 측정하는 세 번째 기술은 유 전적으로 인코딩 된 신경 전달 물질 (NT) 바이오 센서 (3)를 통해 직접입니다. 이 방법으로 융합 단백질은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) - 기반 형광체 (4)의 쌍 또는 순열 GFP (5)에 결합 된 송신기에 대한 리간드 결합 도메인을 포함하는 생성된다. 앞의 두 방법과 달리,이 바이오 센서는 전적으로 인코딩 된 형질 전환 동물의 생산을 통해 또는 급성 세포 감염 바이러스 제제의 사용과 같은 신경 세포와 같은 숙주 세포의 표면에 발현. 현재까지 유전자 부호화 바이오 센서 만 detectin 개발되어왔다g 글루타메이트와 GABA 3-5. 이러한 기술에 대한 제한은 nM의 범위에서 낮은 감도 및 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)를 통해 신호를 예를 들어 송신기, 고전 신경 전달 물질, 신경 펩티드 및 신경 조절의 다수 검출 확대 없게되었다. 실제로, 인간 게놈에서 거의 800 GPCRs에있다. 이러한 부족을 해결하기 위해, 우리는 GPCR을 통해 신호를 어떤 신경 전달 물질의 광학적 측정 자료에 혁신적인 도구를 개발했습니다. CNiFERs (셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자)가 자극하면 [Ca를 2+ 즉이 유전자 부호화 FRET 계 칼슘 센서에 의해 검출되어, 세포 내에서의 증가를 유발 특정 GPCR을 발현하도록 유전자 클론 HEK293 세포이다 TN-XXL. 따라서 CNiFERs은 신경 전달 물질 수용체, 형광의 변화에​​ 직접 결합 실시간 광 (R)을 제공하는 변환지역의 신경 전달 물질 활동의 EAD 아웃. 특정 신경 전달 물질에 대한 고유 수용체를 이용하여, CNiFERs 화학 특이성, 친 화성 및 내생 발현 수용체의 시간적 동성을 보유한다. 지금까지, 우리는 CNiFERs 세 가지 유형, 도파민을 검출하는 M1 수용체를 이용하여 아세틸 콜린의 검출을 작성한 D2 수용체를 사용하고 α1a 수용체 6,7을 사용하여 노르 에피네프린을 검출하기위한 하나. CNiFER 기술은 GPCR의 유형은 의무가있어 쉽게 확장과 확장 성이다. 이 조브 기사에서, 우리는 설명하고 모든 응용 프로그램에 대한 생체 CNiFERs의 설계, 실현 방법, 테스트를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&amp;nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Cloning: for generating lentivirus</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon cell strainers</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 Well Plate, flat bottom, clear&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 well cell culture plates&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux black clear bottom&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation pipet tips</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Acetylcholine Chloride&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Norepinephrine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Dopamine Hydrochloride&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinephrine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&amp;nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Substance P&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Fluorescence Plate Reader &amp;amp; software</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DMEM (high glucose) with Glutamax&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Tissue culture</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Tissue culture</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Pen/Strep&amp;nbsp; antibiotics</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Tissue culture</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Puromycin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Tissue culture</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fibronectin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Tissue culture</td></tr><tr><td>CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td>Tissue culture</td></tr><tr><td>cyanoacrylate glue&amp;nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite no. 495</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>plastic paraffin film&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&amp;reg;</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Glass electrodes</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>hand held drill</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Burrs for drill</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Sterilizing bath</td><td>FST</td><td>18000-45, Hot Bead Sterilizer</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>isoflurane chamber/mask</td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>3D scope with arm</td><td>Zeiss</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>fiber optic light</td><td></td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Betadine&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>70 % (v/v) isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pads</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% (injection, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)</td><td></td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 &amp;mu;g per g rodent)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment&amp;nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Grip dental cement</td><td>Dentsply</td><td>#675571, 675572</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&amp;nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C&amp;amp;B</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>no. 0 cover glass</td><td>Fisher</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>stereotaxic frame&amp;nbsp;</td><td>Kopf</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Rectal probe and heating pad</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>optical breadboard for imaging</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (Silicone elastomer)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Suture&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18&amp;rsquo;&amp;rsquo;, 1667, 4-0</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-00</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Hot Bead Sterilizers</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-45</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Instrument Case with Silicone Mat</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>surgery and stereotaxic injection</td></tr><tr><td>2P fixed-stage fluorescence scope for &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; imaging</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>in vivo imaging</td></tr><tr><td>Multiphoton laser</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>in vivo imaging</td></tr><tr><td>Green Laser</td><td>Olympus</td><td>473 nm Laser</td><td>in vivo imaging</td></tr><tr><td>xy translational base</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>in vivo imaging</td></tr><tr><td>FRET filter cube for YFP and CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo imaging</td></tr><tr><td>10x and 40x water immersion objectives</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo imaging</td></tr><tr><td>air table</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo imaging</td></tr><tr><td>custom built light-tight cage</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo imaging</td></tr></tbody></table>

construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo

세포 기반 신경 전달 형광 설계 기자 (CNiFERs)는 신경 과학자 광학적 생체의 뇌에서 신경 전달 물질의 방출을 검출하기위한 새로운 수단을 제공한다. 특정 CNiFER 안정적 특정 G 단백질 결합 수용체, G의 Q에 커플 / 11 G 단백질 및 FRET 기반 칼슘) 검출기 (, TN-XXL를 표현하는 인간 배아 신장 세포에서 생성됩니다. 수용체의 활성화는 FRET 신호의 증가를 이끈다. CNiFER 클론은 도파민에 대한 D2R, 예를 들어, 특정 신경 전달 물질의 고유 수용체를 이용하기 때문에 CNiFERs는 nM의 감도와 초 시간 응답이 있습니다. CNiFERs 직접 뇌에 이식 생체 내에서 볼륨 전송을 측정하기에 이상적 미만 백 ㎛의 공간 해상도와 신경 전달 물질 방출을 감지 할 수 있도록하고 있습니다. CNiFERs 또한 VI 잠재적 교차 - 반응성에 대한 다른 약물을 스크리닝하는데 사용될 수있다VO. 우리는 최근의 GPCR에게 G I / O G 단백질에 그 부부를 포함 CNiFERs의 제품군을 확장했다. CNiFERs은 아세틸 콜린 (ACH), 도파민 (DA)과 노르 에피네프린 (NE)를 검출 할 수 있습니다. 어떤 GPCR이 CNiFER 소설을 생성하는데 사용될 수 있음을 감안할 때 대략 인간 게놈 800 GPCRs에 있다는 것을 우리는 설계, 실현 및 CNiFER 임의의 타입을 테스트하기 위해 여기 일반적인 방법을 설명한다.

특정 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 유전자 코드 [칼슘 2 +] 센서, TN-XXL하십시오 CNiFER 안정적 적어도 두 개의 단백질을 발현하도록 유전자 조작 된 인간 배아 신장 (HEK293) 세포에서 파생됩니다. TN-XXL은 칼슘 이온 -6,15-의 질문에 답변 시안과 노란색 형광 단백질 각각 eCFP과 황수정, 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 겪는다. 내생 G q를 G 단백질에 그 부부의 GPCR의 활성화는 [칼슘 2 +]를 PLC / IP 3 경로를 통해 TNXXL 칼슘 검출기에서 FRET의 증가로 이어지는 (그림 1) 세포질의 증가를 발생시킨다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53290/53290fig1.jpg" /> 그림 1 :. 개발 CNiFERs에 대한 계획 탑, GPCR-칼슘 2 +을 만드는 데 필요한 신호 전달 경로CNiFER 셀. 바닥, HEK293 세포를 사용 CNiFERs를 구성하는 기본 단계. 1. 형질 도입 유전자 인코딩 FRET 기반 칼슘) 검출기 ((TN-XXL)와 단계. 2 단계 즉, 형질 도입 Gα G 단백질 키메라, G의 QS5, G의 qi5, 필요한 경우. CNiFER을 만들 3. 형질 도입 독특한 GPCR 단계. 두 광자 여기 광 (빨간색)의 eCFP 방출 (시안)과 황수정 방출 (노란색)을 모두 생산, FRET을 거쳐 eCFP을 흥분. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53290/53290fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> FRET 증가는 신경 전달 물질의 농도 변화의 신속한 광학적 판독을 제공한다. 신경 전달 물질의 특정 유형에 대한 CNiFER을 개발하기 위해, 제 G 단백질의 유형을 결정하는 것을 GPCR에 결합. G의 Q는 GPCR에 -coupled를 들어, GPCR은 내생 발현 G Q의 단백질을 사용하여HEK293 세포. G 들어 I / O는 -coupled 된 GPCR하는 클론 HEK293 라인은 먼저 G q를 -PLC / IP 3 경로로 GPCR을 리디렉션 키메라 G 단백질을 표현 만들어집니다. 이것은 주로 Gα Q 시퀀스와 G I의 카복실 말단 다섯 아미노산을 포함하는 키메라 G 단백질 G의 qi5로 이루어진다. G의 qi5이 G I / O -coupled 된 GPCR과 통신하지만 G Q의 경로를 통해 신호를 위해이 다섯 아미노산은 충분하다. G의 -coupled 된 GPCR를 들어, G의 QS5 키메라 (10)를 사용한다. CNiFER를 제조하기위한 일반적인 전략이다 : 1), 2) 안정 G 단백질 키메라를 발현 HEK 세포의 렌티 바이러스 형질 도입을 이용하여, 안정적으로 광 칼슘 검출기를 발현하는 클론 HEK293 세포, 즉, TN-XXL를 만들 필요한 경우, HEK293 세포 클론 TN-사이즈를 나타내는, 3) HEK293 세포에서 안정하게 발현하는 클론을 GPCR에 만들TN-XXL 및 키메라 G 단백질을 발현하는 복제. TN-XXL 및 키메라 G 단백질을 GPCR이 부족하지만있는 클론 HEK293 라인은 &#39;제어 CNiFER&#39;역할을한다. 제어 CNiFER는 CNiFER 응답 구체적 예 D2R 아닌 내생 HEK293 세포에서 발현 다른 수용체의 활성화로 설계 수용체의 활성화에 기인 것을 확인할 필요가있다. 렌티 바이러스를 생성하기 위해, lentivector 발현 시스템이 사용되며, 예를 들어, 대상의 포장, 전달, 바이러스 표현의 안정적인 통합 게놈 DNA로 구성, 표현에 대한 책임이있는 유전 적 요소가 포함 pCDH-CMV-MCS-EF1-순수하지 않아, 유전자 서열. 바이러스 입자, 발현 및 포장 벡터의 높은 역가를 생성하는 일시적 제조자 포유류 세포 내로 공동 형질 감염되어 바이러스가 수집된다. 높은 TI를 생성 할 수 있습니다 미국의 여러 바이러스의 핵심 시설이 있습니다<html> 터 렌티 바이러스. HEK293 세포의 감염 후, 순수하지 않아 유전자가 형질 도입 된 HEK293 세포를 식별하기위한 항생제 내성을 제공한다. 클론 특정 행을 식별하기 위하여, HEK293 세포는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 시스템을 이용하여 정렬 형질. 목적은 FRET 계 칼슘 검출기의 높은 발현 수준 및 FRET을 진행하는 능력을 포함하는 클론을 분리한다. FACS 분석이 예에서, eCFP 방출 형광은 FRET 신호 (eCFP 여기 및 발광 직사각)에 대해 도시된다. 상자는 이후 96 웰 플레이트에 (그림 2) 정렬 ( &quot;문&quot;) 선택됩니다 영역 (P2와 P3)를 표시합니다. 일반적으로, 약 4 96 웰 플레이트 CNiFERs의 성공적인 생성을 선별하기에 충분하다. 이들 4 판에서 약 100 클론 형광 플레이트 리더 분석에 적합하다. 1 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지 = FO &quot;e_content <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53290/53290fig2.jpg" /> 그림 2 : FACS 분석의 예 FACS 분석 다음과 같은 출력의 샘플.. 시트린 방출의 함수로서 그래프는 eCFP 발광 ( &quot;20분의 475-A&quot;) ( &quot;FRET V-30분의 530-A&quot;), 각 셀 eCFP 여기를 사용. 지역 P2와 P3 쇼 영역은 개별 셀에 정렬, 게이트, 즉, 선택했습니다. 색상은 임의입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53290/53290fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 정렬 된 셀이 충분한 밀도로 성장 후에 작용제 활성화 다음 FRET 반응 용액 처리를 구비 한 96 웰 형광 플레이트 판독기 시스템을 사용하여 결정된다. 공부하는 클론의 수를 좁히려는 &quot;3 점&quot;작용제 곡선은 화면하는 데 사용됩니다 ~최고의 응답 100 클론을 선택 CNiFERs. 12 다른 신경 전달 물질 또는 조절제와 프로브 비특이적 반응은 약 10 개의 클론은 동족 인 작용제와 전체 용량 - 반응을 결정하여 상기 분석 및. 약물 (예, 작용제, 길항제 등)에 ACSF : 96- 웰 약물 플레이트 (플레이트 (3)의 최종 농도는 1 희석) 3 배의 농도로 제조한다. 이 예에서, 약물 플레이트는 다른 신경 전달 물질 및 펩티드 작동 제의 다양한 동종 작용제, 도파민, 잠재적 비특이적 반응 (도 3)와 D2 CNiFER 테스트 용으로 설정된다. GPCR이 부족 백본 CNiFER는 새로 만든 CNiFER의 중요한 제어 역할을합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53290/53290fig3.jpg" /> 그림 3 :. 96 웰 플레이트의 레이아웃의 예 맨의 layou의 테이블, 형광 플레이트 리더의 3 배 약물 플레이트를로드하는 다양한 신경 전달 물질과 펩타이드의 3 배 농도를 사용하는 t. 아래, 투명한 플라스틱 96 웰 약물 플레이트와 CNiFERs 시드 및 플레이트 리더로 측정 블랙 96 웰 플레이트의 예입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53290/53290fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> GPCR 자극은 TN-XXL 의한 세포 내 [칼슘] 및 검출의 상승의 결과, FRET 반응을 증가시킬 것으로 예상된다. 이러한 조건에서 FRET은 eCFP의 여기가 작은 eCFP 방출 큰 황수정 방출을 생산하도록 eCFP과 황수정이, 가까이 이동하여 생성된다. 이 예에서, 여자는 436 nm의 및 배출 필터로 설정이 eCFP 485 ± 7.5 nm의 황수정에 대한 527 ± 7.5 nm의 (그림 4)로 설정됩니다. 바 삼십 초seline 형광을 측정하고 ACSF 판에서 &quot;3 배&quot;작용제에서 다음 50 μL 각 잘 포함 된 100 μL의 ACSF에 전달된다 (1 : 3 희석). eCFP과 황수정 방출 형광 180 초마다 3.8 초를 측정한다. 배경 측정없이 셀 웰에서 촬영하고, 필요한 경우, 감산된다. 형광 강도를 정상화하기 위해 사전에 자극 기준선이다 (F (t) / F (기준)), 피크 응답은 527의 FRET 비율 (ΔR / R)을 F (t)를 사용하여 / F (기준)을 계산하기 위해 측정 nm 내지 485 nm의 채널 (식 1). 투여 량 반응 곡선은 다른 작용제의 농도의 함수로서 FRET 비율을 플롯 팅하고, EC (50) 및 힐 계수 (도 5) (식 2)를 결정하기 위해 힐 방정식에 적합하여 구성된다. 최적 CNiFER 큰 FRET 비와 동족 작용제에 적합한 EC (50)를 나타내고, 기타 neurotransmit 거의 또는 전혀 배경 응답을 나타낸다터 작용제. 대조적으로, 제어 CNiFER은 동족 작용제에 거의 반응을 보여 주어야한다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53290/53290fig4.jpg" /> 그림 4 :. 해결책 전달 시스템과 플레이트 리더 측정 작용제에 의한 FRET 응답 D2R CNiFER FRET 응답의 예. D2 CNiFERs에 (A) 도파민 (빨간색 막대)의 응용 프로그램 중 FRET 응답의 플롯, 즉, eCFP과 황수정 배출량 eCFP 여기. 그 eCFP 방출 감소를 참고 작용제 (도파민)와 레몬 방출 증가있다. (B) 뮬러 등.에서 수정 (A) 그림의 응답을 FRET 비율 (식 1)의 플롯은 2014 년 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53290/53290fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 5 :. D2 CNiFER에 대한 용량 반응 곡선의 예는 (A) (녹색 NE) 도파민 D2에 CNiFERs의 응답 (DA, 검은 색)과 노르 에피네프린에 대한 반응 곡선을 선량. 또한 D2R 부족 &quot;컨트롤&quot;CNiFERs의 응답이 도시되어있다. (B) 막대 그래프는 50 nM 내지 1 μM에서 다른 신경 전달 물질 및 변조기에 대한 FRET 비 반응을 나타낸다. 값은 ± SEM 평균입니다. 뮬러 외. 2014 년 7에서 수정 된 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53290/53290fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> CNiFER 클론 프레젠테이션 판별 더 가능 수용체 의존성에 대해 둔감 및 시간적 해상도에 대해 평가할 수있다두 개의 서로 다른 효능 펄스의 (자세한 내용은 참조 뮬러 외. 2014 년 7). CNiFER 클론을 생성하는 데, 그 다음 단계는 생체 내에서의 기능을 테스트하는 것이다. 생체 내에서의 형광을 모니터링하기 위해, 두 개의 광자 현미경을 사용하는 것이 필요하다. 시닝 두개골 창을 준비한 후 CNiFERs 유리 피펫에로드 및 피질 층의 2/3를 주입. 마우스는 (그림 6)에 얇은 두개골에 유리 커버 슬립을 부착, 및 이미징 동안 머리를 고정하는 헤드 줄을 주입하여 생체 내 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 이식 CNiFERs는 생체 내에서 실행 가능한 것을 확인하려면 작용제의 알려진 농도는 이식 부위 근처에 주입 될 수 있으며, FRET 비율은 7 결정했다. 또한 이식 CNiFERs의 활성을 확인하려면, 입력 뉴런을 자극하는 검사해야합니다. D2 CNiFER의 효과를 예를 들어피질로 투사 중뇌 도파민 신경 세포의 전기 자극 조사 하였다. 500 ㎛의 선단을 분리하는 전극을 자극하는 0.1 MΩ 텅스텐 바이폴라 (-3.2 mm의 A / P, -1.3 mm의 M / L가 -4.4 mm의 D는 / V).도 6을 흑질 주입 전기의 일례를 도시 한 다른 강도의 흑색질 자극 및 D2 CNiFERs 7 대한 FRET 비율의 증가를 관찰. D2 수용체 길항제 eticlopride (1 ㎎ / ㎏), 차단 D2 CNiFER 응답의 전신 복강 내 (IP) 주입을 참고. 도파민 재 흡수 차단이 전기적으로 유발 D2 CNiFER 응답 7 향상 한편, 코카인 주사 (15 ㎎ / ㎏)에. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53290/53290fig6.jpg" /> 그림 6 : D2 CNiFER 응답 I의 예 <str<html> Substantia 그라의 전기 자극에 따라 옹&gt; N 생체. (A) 만화는 생체 내 두 광자 이미징 및 전기 자극을 준비 머리 고정 마우스를 보여줍니다. 여기에 대 한 두 개의 광자 빛 (빨강, 820 ㎚) 및 eCFP (파란색)과 황수정 (녹색) 530 nm의 방출에 대한 475 nm의 방출. (B)는 라인 플롯 D2 CNiFER 대한 FRET 비가 흑색질의 전기 자극, 다음 피질 주입 도시 즉, D2R의 존재하에 전기 자극 다음 50~500 밀리 대한 ㎐, 및 50 내지 300 μA의 200 마이크로 초 펄스 길항제 (eticlopride) 또는 코카인. 뮬러 외. 2014 년 7에서 수정 된 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53290/53290fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> ftp_upload / 53290 / 53290table1.jpg &quot;/&gt; 표 1 : HEK293 성장 매체와 ACSF를 만들기위한 화학 물질 및 시약의 목록입니다. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/53290/53290table2.jpg" /> 표 2 : 크기가 다른 문화 판 또는 술병에서 수확 세포에 대한 볼륨.

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Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

우리는 체적 신경 전달 물질 방출의 광학 검출을위한 셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자 (CNiFERs)를 만들 수있는 프로토콜을 제시한다.

건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs)<em&gt; 생체</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

construction-cell-based-neurotransmitter-fluorescent-engineered

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

13.1K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  우리는 체적 신경 전달 물질 방출의 광학 검출을위한 셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자 (CNiFERs)를 만들 수있는 프로토콜을 제시한다. 

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In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

연구

생물학

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences. For instance, addiction to nicotine via tobacco smoking is a leading cause of premature death worldwide (World Health Organization) and is likely caused by an alteration of ion channel distribution in the brain1. Chronic nicotine exposure in both rodents and humans results in increased numbers of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in brain tissue1-3. Similarly, alterations in the glutamatergic GluN1 or GluA1 channels have been implicated in triggering sensitization to other addictive drugs such as cocaine, amphetamines and opiates4-6.

Consequently, the ability to map and quantify distribution and expression patterns of specific ion channels is critically important to understanding the mechanisms of addiction. The study of brain region-specific effects of individual drugs was advanced by the advent of techniques such as radioactive ligands. However, the low spatial resolution of radioactive ligand binding prevents the ability to quantify ligand-gated ion channels in specific subtypes of neurons. 

Genetically encoded fluorescent reporters, such as green fluorescent protein (GFP) and its many color variants, have revolutionized the field of biology7.By genetically tagging a fluorescent reporter to an endogenous protein one can visualize proteins in vivo7-10. One advantage of fluorescently tagging proteins with a probe is the elimination of antibody use, which have issues of nonspecificity and accessibility to the target protein. We have used this strategy to fluorescently label nAChRs, which enabled the study of receptor assembly using F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfected cultured cells11.More recently, we have used the knock-in approach to engineer mice with yellow fluorescent protein tagged &alpha;4 nAChR subunits (&alpha;4YFP), enabling precise quantification of the receptor ex vivo at submicrometer resolution in CNS neurons via spectral confocal microscopy12. The targeted fluorescent knock-in mutation is incorporated in the endogenous locus and under control of its native promoter, producing normal levels of expression and regulation of the receptor when compared to untagged receptors in wildtype mice. This knock-in approach can be extended to fluorescently tag other ion channels and offers a powerful approach of visualizing and quantifying receptors in the CNS.

In this paper we describe a methodology to quantify changes in nAChR expression in specific CNS neurons after exposure to chronic nicotine. Our methods include mini-osmotic pump implantation, intracardiac perfusion fixation, imaging and analysis of fluorescently tagged nicotinic receptor subunits from &alpha;4YFP knock-in mice (Fig. 1). We have optimized the fixation technique to minimize autofluorescence from fixed brain tissue.We describe in detail our imaging methodology using a spectral confocal microscope in conjunction with a linear spectral unmixing algorithm to subtract autofluoresent signal in order to accurately obtain &alpha;4YFP fluorescence signal. Finally, we show results of chronic nicotine-induced upregulation of &alpha;4YFP receptors in the medial perforant path of the hippocampus.

We have developed a novel technique of quantifying nicotinic acetylcholine receptor changes within subcellular regions of specific subtypes of CNS neurons to better understand the mechanisms of nicotine addiction by using a combination of approaches including fluorescent protein tagging of the receptor using the knock-in approach and spectral confocal imaging.

만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

신경과학

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic dysfunction occur in various neurodegenerative diseases and age-related degeneration. Investigation of the mechanisms that regulate neurite outgrowth would not only shed valuable light on brain developmental processes but also on such neurological disorders. Due to the low transfection efficiency, it is currently challenging to study the effect of a specific protein on neurite outgrowth in primary mammalian neurons. Here, we describe a simple method for the investigation of neurite outgrowth by the co-transfection of primary rat cortical neurons with EGFP and a protein of interest (POI). This method allows the identification of POI transfected neurons through the EGFP signal, and thus the effect of the POI on neurite outgrowth can be determined precisely. This EGFP-based assay provides a convenient approach for the investigation of pathways regulating neurite outgrowth.

In this report, we describe a simple protocol for studying neurite outgrowth in embryonic rat cortical neurons by co-transfecting with EGFP and the protein of interest.

1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

발생학

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs)

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