낮은 경질 효율은 단백질이 1 차적인 뉴런에서 neurite 성장을 재활성화하는 방법을 결정하는 주요 장애물입니다. 우리의 프로토콜은 성공적으로 감염된 세포를 확인하기 위해 EGFP의 공동 변환에 의해이 문제를 극복. EGFP의 높은 배분률과 관심 있는 단백질은 분석의 정확성을 보장합니다.
그리고 결과적으로 면역 형광 얼룩이 필요합니다. 신경 재생 중에 중성염 자가 성장이 발생하면, 이 방법은 뇌 외상 또는 신경 퇴행성 질환에서 손상된 신경 망을 복원하기위한 새로운 표적의 식별에 적용 될 수있다. 시술을 시작하기 전에 멸균 18mm 원형 커버슬립을 12개의 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물에 넣고 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 폴리-D-Lysine 용액의 밀리미터당 5마이크로그램으로 각 커버슬립을 코팅합니다.
인큐베이션이 끝나면 폴리-D-Lysine 용액을 흡인하고 커버립을 멸균물로 헹구세요. 배아 의 날에 18, 10 센티미터 페트리 접시에 시간 임신 Sprague Dawley 쥐에서 수확 자궁을 배치하고 자궁과 양수 낭을 열기 위해 작은 해부 가위를 사용합니다. 가위를 사용하여 태반을 제거하고 집게를 사용하여 전체 배아를 차가운 PBS 포도당을 포함하는 새로운 10센티미터 페트리 접시로 옮춥니다.
가위를 사용하여 두개골의 처진 봉합사를 따라 자르고 작은 평평한 주걱을 사용하여 배아 뇌를 신선한 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 새로운 10 센티미터 페트리 접시로 옮춥니까. 2번 5번 핀셋과 해부 현미경을 사용하여 두 대뇌 반구를 소뇌와 뇌줄기에서 분리하고 수막을 제거합니다. 그런 다음 대뇌 반구에서 피질을 분리하고 신선한 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 15 밀리리터 튜브에 피질을 놓습니다.
1 차적인 피질 신경 문화의 경우, 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서, 피질은 0.05 %의 트립신 EDTA로 PBS 포도당을 대체하기 전에 섭씨 4도에서 5 분 동안 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 부드러운 태핑과 섞어서 37도의 수조에 10분간 배양하고 2분마다 부드러운 도청을 추가로 해보시면 됩니다. 인큐베이션의 끝에서, 유지 보수 매체의 네 밀리리터와 소화를 중지하고 부드러운 트리튜레이션으로 조직을 해리1 밀리리터 파이펫을 사용합니다.
원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 두 번째 원심분리를 위해 유지 보수 배지의 1밀리리터로 펠릿을 재중단한다. 12웰 플레이트에서 웰당 유지 보수 배지의 1 밀리리터에서 6.5배 10에서 4번째 생존 셀수퍼레이션으로 격리된 뉴런을 계산하고 플레이트에 대한 신선한 유지 보수 매체의 1밀리리터에서 제2 원심분리 후 형성된 펠릿을 재중단한다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 이틀 간 후 EGFP와 표적 단백질 플라스미드 DN및 2개의 별도 1.5 밀리리터 튜브에서 트랜스펙트 시약을 희석한 다음 함께 섞는다.
우물에 형질 혼합물을 추가하여 EGFP 구조를 사용하여 세포를 트랜스펙트합니다. 24 시간 후, 37섭씨 PBS로 세포를 씻고 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 인큐베이션이 끝나면 세척당 신선한 PBS로 고정 된 세포를 세 번 세척하고 샘플 당 하나의 현미경 유리 슬라이드에 최소한의 형광 장착 매체를 추가하십시오.
그런 다음 코팅된 커버립을 유리 슬라이드를 향하는 샘플로 마운팅 미디어에 조심스럽게 전달합니다. 중성성 성장을 이미지하기 위해, 상피 형광 현미경에 40X 목표를 선택하고 전환 당 적어도 40 그대로 EGFP 양성 뉴런에서 이미지를 캡처하기 시작 클릭합니다. 모든 중성염이 이미지되었을 때, NeuronJ 플러그인으로 ImageJ에서 캡처 된 이미지를 열고 세포 본체에서 성장 콘의 끝까지 각 뉴런의 가장 긴 중성염의 길이를 측정합니다.
그런 다음 소프트웨어와 함께 얻은 데이터를 분석하여 표적 단백질이 중성자 성장에 미치는 영향을 결정합니다. Cytochalasin D는 신경 성장 인자로 취급된 뉴런에서 향상된 다중염 자성장 동안 복용량 의존적인 방식으로 neurite 확장을 억제합니다. 또한, 뉴런 성장 어댑터 단백질 FE65는 비감염 뉴런에 비해 뉴라이트 아웃성장을 2배 크게 자극한다.
낮은 경질 효율에도 불구하고, 면역 형광 분석은 2 일 세포 배양의 80 % 이상이 EGFP 및 FE65와 성공적으로 공동 형과 감염 될 수 있음을 보여줍니다. EGFP 발현은 FE65가 12시간 에서 처음 검출되고 두 신호모두 최대 7일 동안 검출되는 동안 형질 전환 후 6시간 후에 검출된다. FE65 플라스미드 DNA의 다른 양을 가진 1 차적인 쥐 피질 신경의 transfection는 FE65 plasmid의 0에서 0.5 마이크로그램으로 neurite 확장에 있는 복용량 의존적인 증가를 제시합니다.
그러나, 성장에 있는 유의한 다름은 plasmid의 0.5 또는 1마이크로그램으로 전염된 뉴런에서 관찰되지 않습니다. 프로토콜을 시도할 때 배아 뇌에서 적절한 영역을 분리하는 것이 중요합니다. 이 기술은 또한 재생 의학을 위한 귀중한 공구가 있는 인간 iPSC 유래 뉴런에 있는 신경 성장의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.
