우리는 레트로 바이러스 입자의 생산을 위해 피닉스 GP 포장 세포주를 제공하기 위해 스탠포드 대학에서 박사 게리 놀란에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 TD 토마토를 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학에서 박사 로저 첸 감사합니다. 우리는 또한 자신의 서비스와 도움을 샌디에고 주립 대학 유동 세포 계측법 핵심 시설에게 감사의 말씀을 전합니다.

포유 동물 세포, 유전자 바코드에 대한 바이러스 생산 및 형질 도입 1. 준비 <ol><li> 10cm 접시에 플레이트 2.5 × 10 6 부착 세포 (또는 주위 50-60%의 컨 플루) 둘 베코의 수정 독수리 중간 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FCS)에 Transfection 하루 전날. 이러한 피닉스 GP (게리 놀란, 스탠포드 대학에서 일종의 선물)와 같은 선택의 레트로 바이러스 생산 사용 포장 세포 라인. 주 : 패키징 세포주는 안정적 트랜스 레트로 바이러스 입자 형성 용 개그 단백질 및 폴을 나타낸다. 확인 세포가 이전에 형질에, 건강하고 단층의 판에 부착 해드립니다. </li><li> 24 시간 후, DNA 형질 전환 혼합물을 제조한다. <ol><li> 무 혈청 DMEM 125 ㎕를 3 μg의 구내염 바이러스 봉투 당 단백질 벡터 (PCI-VSVG)과이자의 형광 단백질 유전자를 운반하는 전이 벡터의 3 μg의를 추가합니다. 2 ㎎ / ㎖ (혼합 및 폴리 에틸 이민의 15 μl를 추가). </li><li> 실온에서 15 분간 인큐베이션하고, 혼합물을 적가 셀에 추가한다. 주 : 폴리 에틸 이민은 폴리 플렉스의 형성을위한 형질 전환 시약으로서 균질 DNA 혼합물에 첨가 하였다. 다른 형광 단백질 마커를 운반하는 바이러스 입자를 얻기 위해, 원하는 마커 각각 독립적 형질 전환을 수행한다. 레트로 바이러스 전달 벡터의 길이가 약 7킬로바이트이고 대략 10 KB 이상 포장 될 수 없다는 것을 기억하라. </li></ol></li><li> 37 ° C에서 접시를 품어. 대신에 30 ° C, 32 ° C에서 바이러스 생산 도시 판을 증가시키기 위해. 참고 : 24 시간 후 형질 매체는 신선한 미디어 7 ㎖로 대체 될 수 있으며, 이러한 세포의 건강을 향상시킬 수 있지만, 그 상청 바이러스 양을 감소시킬 수있다. </li><li> 48 시간 게시물 형질은 0.45 μM 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 필터를 뜨는 포함하는 바이러스 입자 필터를 수집합니다. 전달을 위해 갓 수집 된 바이러스 상층 액을 사용합니다. O 번째erwise C ° -80 분량 씩 뜨는을 유지하고 동결 - 해동을 피하십시오. 바이러스 역가가 각각의 동결 - 융해 사이클 아마 최대 50 % 감소한다는 것을 기억. </li><li> 이전에 선택 24 시간 접시 세포주 전달하기 위해 부착하는 경우, 즉시 전달 비 부착 경우 전. 2.0 × 10 5-3.0 (여기에 허 7.5.1 및 HEK 293T) × 10 (5) 부착 세포 또는 5.0 × 10 (5) 종자 1 × 6 비 부착 세포 (여기 SupT1) 당 잘 6 웰 플레이트. 참고 : 세포가 형질 도입시 약 60 %의 포화 상태를 달성 할 수 있도록 세포의 수는, 특히 부착 세포에 대한 있도록 전달하기 전에 접종하는 교정해야합니다. </li><li> 시드 세포에 5 ㎍ / ㎖의 폴리 브렌 (hexadimethrene 브로마이드)를 추가 한 후 약 20~40% 감염 (여기에 2 ㎖) 얻기 위해 이전에 수집 된 바이러스 상층 액을 추가합니다. 참고 : 정렬이 어떤 subpopulat를 증폭 할 수로 MOI이나 감염의 비율이 대부분 임의세포의 이온. 분명히, 감염의 높은 속도는 완화 및 증폭 과정을 가속화. </li><li> 32 ° C에서 120 분 1,500 XG에 매달려 버킷 로터에서 원심 분리하여 세포를 형질 도입. 배양 전에 신선한 매체와 비 부착 세포를 재현 탁. 부착 세포의 경우, 신선한 미디어 24 시간 후 전달로 교체. 주 : 흘리 방지하기 위해 파라 필름으로 원심 분리하기 전에 판을 밀봉하는 것이 좋습니다. 유전자 바코드 셀 다이버 시티를 증가시키기 위해, (단계 1.4로부터 구입) 상이한 형광 단백질을 운반하는 바이러스 입자로 세포를 형질 도입. 형광 마커를 선택할 때, 그들은 장비와 호환되어 있는지 확인하고는 구별 형광 매개 변수가 있습니다. </li></ol> 유전자 바코드 세포의 2. 선택과 증폭 <ol><li> 전달의 비율 속도를 정량화하는 유동 세포 계측법에 의해 적어도 72 시간 게시물 전달을 형질 포유 동물 세포 분석. 음성 대조군으로 비교 비 형질 도입 된 세포주를 사용합니다. 주 : 정렬은, 개별 바코드 세포 집단, 초기 전달의 높은 퍼센트 비율을 정제하는 데 사용될 필요하지 동안 증폭 과정을 빠르게한다. </li><li> 관심의 단백질을 발현 세포를 얻기 위해 선택의 셀 소터를 이용한다. <ol><li> 이러한 목적을 위해, 게이트들이 적절 우측 채널에 설정되도록. <ol><li> 그래서 음성 대조군과 동일한 나이브 세포 라인을 사용하고 음극 형광 인구 각 축에서 10 세 이하의 값이되도록 파라미터 / 채널 전압 설정을 수행한다. 각각의 형광 채널에 대한 음성 대조군의 위에 표시 이벤트로 긍정적 인 형광 게이팅 결정합니다. </li></ol></li><li> 각 악기는 다를 수 있음을 인식하고 게이팅을 결정하기위한 올바른 전압은 모든 특급에 필수적 양성 및 음성 컨트롤을 만들고 그에 따라 조정되어야한다erimental 설정. <ol><li> 이 실험 장치에서 형광 검출 TD를 토마토에 대한 eGFP는 대한 FITC 채널 (502 장거리 패스 필터에 의해 진행 30분의 530 대역 통과 필터), PE 채널 (556 장거리 패스 필터에 의해 진행 42분의 585 대역 통과 필터)를 사용 E2 크림슨, 그리고 APC 채널 (20분의 660 밴드 패스 필터). 참고 : E2 크림슨은 633 nm의 레이저에 의해 흥분되는 동안 488 nm의 레이저 eGFP는 및 TD 토마토 흥분. </li></ol></li></ol></li><li> 100 % FCS 1 ㎖와 정렬에 15 ML 원뿔 튜브. 참고 : 하나 직접 개별 클론 (아래 참조)의 종류를 진행할 수있는 형광 세포 집단을 분류하는 과정은 의무적으로하지 않습니다. 선택 형광을 기반으로 꽉 인구를 정​​렬하면 개별 클론의 미래 선택을위한 백업 인구를 보장합니다. 각각의 세포는 항상 세포의 많은 인구 쉽게 냉동 한 후 해동 이후 단계에서 증폭 될 수있다 성장하기 어려운 있음을 알아 두셔야합니다. </li><li> SP5 분 32 ° C에서 524g에 매달려 버킷 로터 원심 분리기에 정렬 된 인구 아래에서 셀을 펠렛. 신선한 미디어 1 ㎖에 재현 탁하고, 그 세포 컨 플루 적어도 이틀 동안 성장과 분열을 허용하도록 60 % 미만 정도로 세포 플레이트 재. <ol><li> 예를 들어, 6 웰 플레이트에 웰 당 미디어 2 ㎖에서 약 3 × 10 5 세포와 6cm ​​판에서 미디어 2 ㎖에 2 × 10 6 세포에서 플레이트 부착 세포. 미부착 세포 부착 및 세포에 대해 RPMI DMEM을 사용하여 (또는 임의의 특정 매체 필요한 경우). 증폭을 할 수 있도록 몇 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 도금 세포를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 3. 다른 강렬에서 유전자 바코드 세포의 클론 인구를 얻습니다 <ol><li> 원래 형질 세포 클론 인구를 확보 (1.7 단계) 또는 정렬 된 인구에서 (단계 2.3). 참고 :이 모든 세포 사이에 형광 단백질의 발현과 같거나 유사한 수준을 보장합니다집단 내의 S (40 %의 평균 형광 강도에서 작은 CV와 타이트한 인구). <ol><li> 그 목적을 위해, 자동화 된 셀 증착 부 (ACDU) 96 웰 플레이트로 정렬 단셀. 관심의 인구에 따라 정렬 게이트를 설정합니다. 확인 게이트는 서로 다른 형광 강도에 셀을 선택할 때 구별 인구를 얻기 위해 떨어져 적어도 하나의 로그 스케일을 설정합니다. 여기에 표시된 절차, 단계 2.2에 설명 된대로 설정 실험 세포 계측법 같은 흐름을 사용합니다. </li></ol></li><li> 약 2 주 동안 37 ℃의 배양기에서 개별 클론을 증폭. 증폭 과정을 통해 성장하는 인구가 하나 이상의 개별 셀들에서 발생되지 않도록 현미경으로 세포를 분석한다. 참고 : 정렬은 평​​균에 잘 당 하나의 셀을 배치합니다, 일부 우물에서 모든 셀이 없을 수 있지만, 다른 사람들이 하나 이상있을 수 있음을 기억하십시오. <ol><li> 포 있도록하려면pulation는, 플레이트와 매우 부드러운하고 피펫으로 우물을 방해 결코 하나의 셀에서 발생한다. 현미경, 잘 잘하여 판을 준수하십시오. 참고 : 각각의 세포는 항상 그들이 쉽게 알아볼 수있을 것입니다 분할하기 시작하면, 확인하는 것이 어려울 수도있다. </li><li> 가장자리를 따라 종종 세포 &#39;덩어리&#39;그주의하십시오. 여러 클론 인구 관찰 할 수있는 그 우물을 버리고 하나 꽉 인구를 가지고 그 사람들을 유지. 참고 :이 증폭에 큰 접시에 사람들을 전송하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 유동 세포 계측법에 의해 이들을 분석하여 클론의 개체군을 추정 화면. 실험 장치 세포 계측법 같은 흐름을 이용하여 음성 대조군에 비교. <ol><li> 샘플의 일부만을 분석하고 백업으로 나머지를 유지합니다. 평균 강도 및 인구의 압박감을 기반으로 가장 뚜렷하게 별도의 인구를 선택합니다. 필요에 따라 증폭 또는에서 주식을 동결더 이상 시간 또는 액체 질소의 짧은 기간 동안 -80 ° C에서 20 % 글리세롤과 미디어를 동결. 참고 : &#39;진정한&#39;클론 인구가 아주 꽉 형광 패턴을 가져야한다는 것을 기억하십시오. </li></ol></li></ol> 4. (HTS)을 높은 처리량 검진에 대한 다중화 기능을 확인하십시오 <ol><li> 상기 다중화 된 포맷으로 이용 될 수있는 필요한만큼 뚜렷한 클론 개체군 수확기. 구별 흡수 / 방출 스펙트럼 및 / 또는 다른 강도와 클론을 선택합니다. 96- 웰 플레이트 형식 HTS 적합되는 사용되는 경우, 200 μL에 50,000 세포를 웰 당 종자. 참고 : 세포의 수는 추정치이며, 세포 유형에 따라 변경 될 수 있으며이 부착인지 여부 있음을 알아 두셔야합니다. </li><li> 독립적 인 형광 확립 된 세포주의 각각이 서로 구별 될 수 있도록 유동 세포 계측법을 사용하여 샘​​플을 분석. 분석에 앞서 음의 준비단일 색상 컨트롤이 매개 변수와 보정 값을 설정합니다. 참고 : 분명히을 가능하게 혼합 된 인구를 구분하는 매개 변수를 설정하면 더 다중화 형식으로 사용합니다. </li></ol> 5. 선택의 생물학적 응용 프로그램에 대한 유전자 바코드 세포주를 적응 <ol><li> Stolp 외., 2013 (59)에서 여기에 기술 된 바와 같이 원하는 분석 소자를 포함하는 바이러스 입자 유전자 바코드 확립 된 세포주를 형질 도입. 선택의 추가적인 분석은 형광과 구별 채널을 점유한다는 것을 기억하고, 따라서 적절한 바코드 세포주에 전달하여야한다. 주 : 각 바코드 세포주는 다른 분석을 품을 수있다. </li><li> 분석 요소를 포함 할 것들에 대한 정렬 유전자 형광 바코드 세포. 참고 : 분석 요소는 F (융합 또는 내부 리보솜 항목 사이트를 통해) 태그 또는 형광 단백질에 결합 설계 할 수있다또는 간단 검출 서부 블로 팅, 세포 계측법 또는 현미경 흐름. 이 프로토콜에 사용 된 시스템은 혼자 HA 항원의 표면 발현에 의존, 또는 추가 FLAG 에피토프 식. <ol><li> HA 및 APC-형광 결합 된 항체와 분석을 포함하는 클론 인구를 얼룩. 그리고 안티 - 플래그와 FITC - 복합 항체 염색 클론 인구를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 분석을 다시 추적하기 위해 분석 또는 &#39;디코드&#39;고유 유전자 바코드 세포주가 구별 될 수있는 적절한 채널 인구. 여기서, TD 토마토 검출 PE 채널에서 분석함으로써, 기판의 특성을 디코딩. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 두 잘 확립 된 절차가 결합되었습니다; 레트로 바이러스 및 기술을 이용하여 유세포 형광 단백질의 검출을 통해 유전 공학. 고유 세포주의 제조 계 형광 단백질 유전자 바코드 다중화 애플리케이션 견고하고 간단한 방법을 제공한다. 레트로 바이러스 유전자 조작 기술을 통해 세포 바코드를 생성하는 초기 긴 과정이지만, 한 번, 셀 물질의 신뢰성 있고 안정된 소스를 설립 얻게한다. 이 기?...

이러한 형광 분광법, 형광 현미경 및 유동 세포 계측법 같은 기술은, 모두 형광에 의존 속성은 널리, 생화학 생물 의학, 화학 응용 프로그램에서 악용. 형광 극한 또는 라벨링을 통해 단백질 발현 패턴과 프로필, 세포의 운명, 단백질 결합 및 생물학적 기능 1-9의 분석을 위해 이용하고,되었는지 생체 분자 상호 작용 및 구조 변화의 검출을위한 형광 / 포스터 공명 에너지 전이를 통한 10-13. 빅토리아 (Aequorea victoria) 녹색 형광 단백질 (GFP) (14)의 분리 이후, 다른 자포 동물, 특히 산호로부터 추가 천연 형광 단백질의 발견은, 크게 구별 여기 / 발광 스펙트럼을 가진 기존의 형광 단백질의 수가 증가하고있다. 이 함께 유전자 15-19의 돌연변이의 도입으로, 근래전자는 또한 자신의 연구를위한 세포 계측법 및 기타 형광 기반 기술 흐름, 현미경을 이용 과학자 사용할 수 형광 단백질의 진정한 표를 획득, 가능성을 확장했다. 이와 병행하여, 독립적이지만, 레트로 바이러스 기술의 개발이 크게 포유 동물 세포에서 20-23 이소성 유전 정보의 발현 안정성을 촉진했다. 그것은이 기술은 세포 및 조직 유형의 24-28 넓은 수로 29-31 또는 형질 전환 동물의 생산을위한 형광 단백질 유전자를 전송하기 위해 사용되었는지 따라서 놀라운 일이 아니다. 레트로 바이러스의 성질에 따라, 자궁외 형광 단백질의 유전 정보는 셀 (32)의 게놈 내에 도입되고, 셀에 대한 &#39;형광 ever&#39;된다. 이 속성은 세포 운명의 추적을 허용, 또는 세포 집단 내에서 단일 셀의했다. 지금 형광 세포 따라서 아퀴있다자신의 biosignature 빨간색과 바코드로 정의 할 수 있습니다. 독특한 biosignature 다른 세포를 식별하고, 중요한 것은 유 전적으로 구별 흡수 / 방출 스펙트럼과 다른 형광 단백질을 표현하기 위해 조작 된 세포를 구분합니다. 이러한 다 능성 33 향해 리 프로그래밍 인자 트래킹 생물학적 응용 핵소체 지역화 34 해명 용 subnuclear 요인 분석, 전사 연구 35 또는 신경 네트워크 구조 (36)의 연구 뉴런의 유전 표지 용 형광 리포터 플라스미드의 구성 같은 실험 장치에 대해 서로 다른 형광 단백질 유전자를 악용 한 그 많은 단지 네 가지 예입니다. 계측법 대체로 이러한 유전자 발현, 세포주기, 아폽토시스 같은 단일 세포 수준에서의 생물학적 과정의 분석을 위해 이용하고, 포스 포릴 통해 시그널링 된 흐름포유 동물 세포에 형광 단백질 유전자의 ATION 37-43 국지적 인 안정 표현은 더 셀 분석 38,44과 리간드 - 수용체 상호 작용 45 유동 세포 계측법의 유틸리티를 강화했다. 강화 된 기능은 세포 계측법 높은 처리량과 높은 콘텐츠가 46 스크리닝 널리 활용 방법이 될 흐름을 허용했다. 몇 플레이트 리더 시스템, 영상 및 유동 세포 계측법 수 fluorometers과 로봇 기술의 현재 확장 수에도 불구하고, 악용이 향상된 기술력을 들어갈 수있는 실험 설계의 부족있을 것 같습니다. 빠르고 안정적​​ 간단하고 강력한 세포 기반 방법들이 대폭 더 높은 처리 능력을 향상 다중화 애플리케이션 필요하다. 다중화 형식의 엔지니어링 세포 기반 분석은 높은 처리량 검사 39,47-50의 능력을 향상시킬 수있는 곳은 신약 개발 분야에서 특히 그러하다 </sup&gt;. 그것은 하나의 샘플에서 동시 분석을 허용하는 멀티플렉싱, 더 높은 처리 능력 (51 ~ 54)을 향상시킨다. 형광 바코드 유전 우아한 다중화를 허용 할뿐만 아니라, 일단 설계 시간을 소비하는 다른 프로토콜의 필요성을 회피, 항체, 구슬 얼룩 39,52,55 수반 비용을 감소시키고, 고 필요한 화면 수를 감소시킬뿐만 아니라 처리 응용 프로그램. 우리는 최근 생물학적 응용 프로그램에 대한, 이전에 다른 임상 적으로 널리 변종 (58) HIV-1 단백질 분해 효소 활동 56,57을 모니터하기 위해 개발 된 분석을 표현함으로써 형광 유전자 바코드를 통해 멀티플렉싱을 어떻게 향상시킬 수 있는지 레트로 바이러스 기술을 설명했다. 방법론은 선택한 유전자 형광 바코드 세포를 증폭하고 뚜렷한 형광 단백질 및 / 또는 상이한 형광 intensit 발현 클론 개체군의 패널을 제조하는 방법을하는 방법에 초점을보다 설명하게 설명한다이거 야. 자신의 형광 특성에 따라 구별 세포 집단의 패널은 또한 다른 생물학적 문제를 해결 세포 기반 분석과 함께 이용 될 수있다 다중화 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 예를 들어 59로, 이전에 실험실에서 개발 된 세포 기반 분석의 한 베어링 바코드 세포의 패널을 설계하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 유전자 전달을위한 잘 확립 된 레트로 바이러스 / 렌티 기술, 형광 단백질의 값 또는 60,48 유세포의 어플리케이션을 나타 내기위한 것은 아니고, 오히려 다중 애플리케이션을 위해 세 개의 조합의 강화 능력을 보여주는.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

다중화 형광 유전자 개별 클론 집단이 생성되면 만 달성 될 수 생물학적 응용을 목적으로 세포를 바코드. 바코드 인구가 최소한의 스펙트럼 오버랩 명확 별개의 형광 특성이있을 때 다중 가장 효과적입니다. 포유류 SupT1 세포의 클론 집단으로도 1에 도시 된 예와 mCherry 아노 형광 단백질 (CFP)와 바코드 세포 용이 개별 형광 특성을 잃지 않고 동시에 분석 할 수 있음을 나타낸다. 이 행렬...

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.2K 조회수.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

연구

생물학

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

파우더 샘플의 절대 양자 수율 측정

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.