이 작품 신경과 연구는 프로그램 NS061039 01A2 건강 보조금 K08의 국가 학회에 의해 지원 되었다 &#38; 발견, 그리고 미시간 대학에서 A. Alfred Taubman 의료 연구 연구소. 이 작품은 형태학 및 이미지 분석 핵심 미시간 당뇨병 연구 센터, 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신 장병에서 5 P 90 DK-20572 건강 그랜트의 국가 학회에 의해 투자의 사용. 저자는 인간의 피부 샘플의 그들의 관대 한 기부에 대 한 제이 로빈슨 싱글톤과 A. 고 든 스미스 (유타 대학) 감사 하 고 싶습니다.

피부 펀치 생체 검사 (솔트 레이크 시티, 유타) 유타 대학 당뇨병 센터에서 큰 지역 사회 기반의 1 차 진료소 네트워크에서 모집 된 과목에서 얻은 했다. 이 연구는 미시간 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었고 헬싱키의 선언의 신조를 준수. 테스트 하기 전에 각 주제에서 동의 얻어 작성.
 1. 형광 Immunohistochemistry <ol><li>intraepidermal 신경 섬유 immunohistochemistry 위한 준비 펀치 생 검: <ol><li>수행 3mm 피부 biopsies 의료 여 직원을 1.5에서 전체 생 장소 mL 잠 &#39; s 통 솔루션 (2 %paraformaldehyde, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4에에서 0.3% 포화 picric 산) 4 ° C 하룻밤에.</li>
		<li>16-24 h 또는 샘플 싱크 때까지 4 ° C에서 30% 자당의 솔루션 샘플 PBS에 린스.</li>
		<li>최적의 절삭 온도에 소스 샘플 화합물 (10 월)는 cryomold를 사용 하 여. 금형에서 아래로 향하게 하는 표 피와 전체 3mm 생을 놓고 약 2 mL 10 월 동결 건조 얼음에 형의 몰드를 채울 합니다. 저장소 사용 하 여 준비까지-80 ° C에.</li>
		<li>잘라 50 µ m 두께 cryostat를 사용 하 여 횡단면 고 180 µ L 부동 액 스토리지 솔루션을 사용 하 여 잘 (30% 에틸렌 글리콜, PBS에서 30% 글리세롤) 당 96 잘 접시의 개별 우물에 저장 합니다. 다음 방향 96 잘 접시의 8 우물입니다. 서로 떨어져 200-300 µ m에서 각 생 사이트 섹션 얼룩.</li>
	</ol></li></ol> 1 일: <ol start="2"> <li>지층 corneum의 일반적인 라벨 끄다: <ol><li>레이블 96 잘 접시 그림 1에서 보듯이.</li>
		<li>피펫으로 150 µ L 줄이기 위해 각 우물에 이차 항 체 34 , 35의 일반적인 바인딩 재고 신호 증강 솔루션의. 전송 섹션 inoculating 루프를 사용 하 여 신호 증강 솔루션으로. 
		참고: 조직 손상 또는 찢 어 조직 섹션을 피하기 위해 함께 작업 하는 동안 주의. 플랫 로커에 실 온에서 30 분 동안 신호 증강 솔루션에서 유지.</li>
		<li>준비 린스 각 우물에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 150 µ L을 추가 하 여 행 2와 3 96 잘 접시의 우물.</li>
		<li>신중 하 게 행 2와 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 린스 섹션 전송.</li>
		<li>린스 (3 행) 실 온에서 10 분에 대 한 1 x PBS에 두 번째 시간.</li>
	</ol></li> <li>5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 솔루션 준비: <ol><li>준비 5 %BSA 포함 하는 솔루션을 차단 하는 5%와 0.3% 트리톤 X 100 (TX-100) 0.1 M PBS (표 1 참조) 섹션 동안에 잠복기는 신호 증강 해결책입니다. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.</li>
		<li>각 우물에 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 4 행에 차단 우물 준비.</li>
		<li>솔루션을 차단 하는 5 %BSA 개별 우물으로 섹션을 전송 하 고 섹션 평면 로커에 실 온에서 1-2 h에 대 한 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 품 어.</li>
	</ol></li> <li>1 %BSA 솔루션 및 주요 항 체의 희석을 rinsing 준비: <ol><li>TX-100 0.1 M PBS (표 2 참조) 동안 섹션 준비 1 %rinsing 솔루션 1 %BSA 0.3%를 포함 하는 5 %BSA 차단 솔루션에서 잠복기. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.</li>
		<li>섹션 5 %BSA 차단 솔루션에 잠복기는 하는 동안 1% BSA rinsing 솔루션에서 기본 항 체 희석.
		<ol><li>1500 µ L의 1 차적인 항 체 솔루션을 만들고 각 추가 행 5에서 잘.</li>
			<li>희석 주 항 체: 신경 관련 레이블, 토끼 polyclonal 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5)를 사용 하 여 1:1, 000에. 미토 콘 드리 아-특정 라벨을 사용 하 여, 단일 클로 널 항 pyruvate 효소 E2/E3bp 항 체 (PDH) 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 1: 100에서 마우스.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>준비 1 차 항 체: <ol><li>피펫으로 150 µ L 각 1 차적인 항 체의 잘에 96 잘 접시의 5 행.</li>
		<li>루프 도구를 사용 하 여 1 차적인 항 체를 포함 하는 5 행에 차단 솔루션 (4 행)에서 전송 섹션.</li>
		<li>단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 parafilm으로 접시 포장.</li>
		<li>1 시간 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 º C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol></li></ol> 주 2: <ol start="6"> <li>린스 샘플: <ol><li>행 6, 7, 8 각 우물에 솔루션을 rinsing 1 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 준비 린스 우물.</li>
		<li>첫 1% BSA rinsing 솔루션 (6 행)에 섹션을 전송 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 린스 섹션 1 %BSA 실 온에서 7과 1 시간에 8 행에 솔루션을 rinsing에 잠복기에 의해 두 번 더 반복.</li>
	</ol></li> <li>1 %BSA 솔루션을 rinsing에 이차 항 체 희석: <ol><li>이차 항 체 솔루션 섹션 1 %BSA 솔루션 (8 행)을 rinsing의 마지막 린스에 잠복기는 하는 동안 만들 1500 µ L.</li>
		<li>이차 항 체 희석: PGP9.5 (녹색 형광 활용된 염소 안티 토끼 항 체, 1:1000), 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 PDH (레드 형광 활용된 염소 반대로 마우스, 1:1, 000)에 대 한 대 한.</li>
	</ol></li> <li>준비 이차 항 체: <ol><li>96 잘 접시의 9 행으로 이차 항 체의 피펫으로 150 µ L.</li>
		<li>부드럽게 이차 항 체 웰 스 (행 9)에 해결책 (8 행)을 rinsing 1 %BSA 섹션을 전송.</li>
		<li>사용 parafilm 랩 단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 접시. 커버 알루미늄 호 일. 1 시간에 대 한 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 ˚C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol></li></ol> 제 3 일: <ol start="9"> <li>준비는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 여 1 x PBS 청소: <ol><li>피펫으로 150 µ L의 행 10, 11 및 12에 1 x PBS를 필터링.</li>
		<li>행 10 샘플을 전송 하 고 실 온에서 1 h 1 x PBS에 씻어. 커버 알루미늄 호 일로 96 잘 접시 고 린스 동안 플랫 로커에 놓습니다. 반복 필터링 PBS 린스 2 x 1 번 더 각 행 11 및 12에에서 실 온에서 1 h.</li>
	</ol></li> <li>현미경 슬라이드 조직 단면도 장착을 위한 준비: <ol><li>장소 50 µ L의 필터링 슬라이드 1 x PBS.</li>
		<li>50으로 1 x PBS (행 12)에서 전송 섹션 µ L 드롭. 신중 하 게 조직 전개 하 고 부드럽게 유리 슬라이드에 병합 하 여 PBS의 드롭에 섹션을 배치 합니다. 유리 피 펫을 장착 시 약 희석을 피하기 위해 초과 PBS를 제거 합니다. 섹션 유리 전구를 만지지 마십시오.</li>
		<li>피펫으로 1-2 방울 DAPI를 포함 하는 사용 하 여 현미경 슬라이드 섹션 위에 직접 장착 시 약의 관리 섹션의 방향을 방해 하지. 부드럽게 섹션 50 mm x 24 mm #1.5 현미경 유리 coverslip 장소.</li>
		<li>고는 coverslip 배치 하면서 형성 된 기포는 coverslip 가장자리에서 과잉 액체를 닦아. 새 슬라이드를 준비 하 고 장착 홍보를 반복각 섹션에 대 한 ocess.</li>
		<li>치료/건조 실 온에서 어두운 하룻밤에 슬라이드를 삽입 하 여 설치 미디어. 슬라이드 4 ° C 또는-20 ° C (2 주 이상) 장기 저장을 위한 단기 (1-2 주)에 대 한 전송. 
		주: 부정적인 컨트롤 단계 1.4.2.2에서에서 PGP9.5 또는 PDH에 대 한 1 차 항 체를 생략 하 고 신경이 나 표 피에서 미토 콘 드리 아의 구별할 수 없는 라벨 표시. 컨트롤이 수행한 긍정적인는 PDH에 대 한 항 체 그것을 증명 하기 위해 레이블이 모든 미토 콘 드리 아 (데이터 표시 되지 않음). 녹색 형광 단백질 (GFP) 신호 레이블 미토 콘 드리 아를 잠재로 불리고 그리고 다음 고정 되었고 PDH 항 체와 붉은 형광 스테인드 교양된 기본 마우스 지 루트 ganglion 신경에 긍정적인 컨트롤 수행 이차 항 체입니다. GFP를 표현 했다 모든 미토 콘 드리 아 공동 PDH immunohistochemistry (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 레드 라벨으로 분류 했다.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal 영상 <ol><li>confocal 영상 수행: <ol><li>수집 이미지는 거꾸로 한 현미경에 기름 침수 (1.25 숫자 조리개 (없음)) 목표 X 40 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여.
		<ol><li>각 초점면에서 순차적으로 형광 신호 취득: 핵: 여기 λ = 405 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 420-480 nm 신경 섬유: 여기 λ = 488 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 505-560 nm Mitoch ondria: 여기 λ = 543 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 606-670 nm</li></ol></li> <li>현미경 소프트웨어에 다음과 같은 검색 매개 변수를 입력: 2 프레임 평균 및 2.2;의 확대와 함께 600 Hz의 스캔 속도 12 비트 강도 해상도 (4096 회색 수준)입니다.
		<ol><li>설정 최적화 측면 검사용 현미경 소프트웨어 (스캔 해상도 1024 x 1024 =) 및 축 해상도/광학 단면 (confocal 조리개 z 단계 크기 210의 = 1 공기 단위 (AU) nm). 
			참고: 결과 XYZ 해상도 172.2 x 30-50 µ m x 176.1 µ m x 176.1 µ m의 이미지 크기와 172.2 nm x 210 nm nm.</li>
		</ol></li> <li>신경 신호 (그린 형광)에 대 한 실시간 검색을 활성화 하 고 찾아서 설정 상단 z-초점 조정 조직 섹션 내에서 신경 신호를 포함 하는 현미경 소프트웨어에 초점 비행기를 내립니다. 총 z 범위는 일반적으로 30-50 µ m 50 µ m 조직 섹션.</li>
		<li>표 피는 가로 또는 세로로 위치에 이미지 라이브 검색 중 현미경 소프트웨어 검색 필드를 회전.</li>
		<li>별도로 각 신호를 스캔 하 고 검출기 (광 전 증폭 관 관, PMT) 조정 전압 및 오프셋 어떤 이상과 포화 픽셀에서 최소화/제거. 
		참고: 위의 매개 변수 검사 시간이 걸릴 z 조각 수에 따라 약 20-40 분.</li>
	</ol></li></ol> 3. 3D 시각화 및 분석의 미토 콘 드리 아 내에서 인간 Intraepidermal 신경 섬유 <ol><li>3D 표 피 분리: <ol><li>원본 이미지를 복제 하 고 최대 강도 사용 하 여 식별 하 고 표 피를 분리 하는 이미지의 (초점 보기 확장) 프로젝션.</li>
		<li>결 석 지층 corneum 피부 등의 원치 않는 영역을 제거 하려면 표 피의 위쪽과 아래쪽 가장자리를 따라 추적 도구 관심의 영역을 사용 intraepidermal 신경 섬유의. 이 선택 영역을 자르기.</li>
	</ol></li> <li>신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호에 사용 deconvolution: 참고: Deconvolution 형광 신호 무결성을 복원 하는 데 도움이. 이미지에 그들의 원래 소스에서 신호를 확산 하는 얼마나 많은 결정 하는 형광 신호를 사용 하기 때문에이 프로토콜에서 사용 하는 복원 장 님 deconvolution 이라고 (지점 확산 기능). 프로세스는 그것의 원래 위치에 다시 확산 신호를 재할당 함으로써 신호 해상도를 향상 시킵니다.
	<ol><li>계산 지점 확산 기능 (PSF) 녹색 형광 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 다음 매개 변수: <ol><li>설정 계산된 PSF confocal. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기 1 공기 단위 (거리)를 설정 합니다. 설정된 레이저 여기 파장 488 nm 및 방출 파장 515 nm.</li>
		</ol></li> <li>PSF 빨간 형광 미토 콘 드리 아 신호 (레드 형광)에 대 한 다음 매개 변수 계산: <ol><li>세트 confocal PSF 계산. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기를 1로 설정 AU. 617 543 nm 및 방출 파장을 설정된 레이저 여기 파장 nm.</li>
		</ol></li> <li>Deconvolution 해당 PSFs를 사용 하 여 신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호는 위에 나열 된 최적화와 반복 복원 기능 설정 100% 자신감 10 사이클의 반복 제한.</li>
	</ol></li> <li>신경 특정 표면 작성: <ol><li>사용은 &#34; 서피스를 생성 &#34; 도구 deconvolved 녹색 형광 보조 라벨에 PGP9.5의에서 신경의 단단한 표면을 식별 신경.</li>
		<li>Uncheck는 &#34; 부드러운 &#34; 기능을 사용 하 여 절대 강도 기능 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 상당히 밝은 배경 형광 보다.</li>
		<li>절대 강도 기능 사용 하 여 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 크게 배경 형광 보다 밝은. 정확 하 게 식별 하는 신경을 충분히 낮은 임계값 설정.</li>
		<li>필터 작은, 비 신경 표면 밖으로 크기에 따라. 
		참고: 필요한 경우 수동으로 편집 내 추가 비 신경 서피스는 &#34; 편집 &#34; 여러 개체를 강조 하기 위해 제어 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭.</li>
	</ol></li> <li>격리 신경 특정 형광 미토 콘 드리 아 신호: <ol><li>볼 신경 표면의 편집 탭을 선택 하는 &#34; 마스크 속성 &#34; 기능. 단계 3.3에서에서 만든 신경 표면은 keratinocytes와 관련 된 미토 콘 드리 아 신호에서 그 신경 내의 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 됩니다.</li>
		<li>로 &#34; 마스크 모든 &#39; 엽니다 단추는 &#34; 마스크 채널 &#34; 창, 풀 다운 메뉴 아래에서 deconvolved 레드-형광 신호를 선택 &#34; 채널 선택 &#34; 미토 콘 드리 아 신호.</li>
		<li>확인 표시를 넣어 하 고 상자에 클릭 합니다 &#34; 마스크를 적용 하기 전에 중복 채널 &#34; 옵션.</li>
		<li>클릭 라디오 버튼의 앞에 &#34; 일정 내부/외부 &#34; 확인 표시를 넣어 하 고 마스크 설정 상자에서 클릭 옵션은 &#34; 설정에 외면 복 &#34; 옵션 및 입력 값에 대 한 0.00. 확인을 클릭 버튼을 만들 신경 표면 내 미토 콘 드리 아 신호를 나타내는 새로운 채널.</li>
	</ol></li> <li>미토 콘 드리 아-특정 표면 작성: <ol><li>사용은 &#34; 서피스를 생성 &#34; 도구를 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호를의 새로 만든된 형광 채널에서는 미토 콘 드리 아의 단단한 표면 3.4 단계.</li>
		<li>Uncheck는 &#34; 부드러운 &#34; 기능 및 선택은 &#34; 배경 빼기 &#34; 임계값을 설정 하는 기능. 이 기능은 미토 콘 드리 아 신호 주변 지역 대비를 사용 하 여 배경에서 미토 콘 드리 아를 식별.</li>
		<li>세트 미토 콘 드리 아를 정확 하 게 식별 하 게 충분히 낮은 임계값 값입니다. 이 예제에서 더 낮은 임계값 2000 16 비트 (65536) 규모에 대 한 설정 했다.</li>
		<li>필터 크기에 따라 미토 콘 드리 아 표면. 이 예제에서는 1.0 복 복 제한 설정, 최저는 제한 가능 합니다. 필요한 경우 수동으로 내 미토 콘 드리 아 비 표면에 밖으로 편집 된 &#34; 편집 &#34; 여러 개체를 선택 하려면 CONTROL 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭. 
		참고: 때때로, 소프트웨어가 만들어집니다 구별할 수 형광 미토 콘 드리 아 신호 연결 되지 않은 표면. 이러한 경우에, 그것은 그들을 제거할 수 있는 &#34; 편집 &#34; 탭</li>
	</ol></li> <li>수출 분석에 대 한 형태학 값 계산: <ol><li>신경 및에서 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 값을 내보내기는 &#34; 통계 &#34; 전자 스프레드시트 소프트웨어와 추가 분석을 위해 탭.</li>
		<li>신경 및 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 값을 내보낼.</li>
		<li>개별 신경 섬유에 각 이미지의 수를 세 고 전자 스프레드시트에 값을 기록.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 전자 스프레드시트에서 분석에 대 한 다음 잠재적인 값 계산: <ol><li>모든 신경 표면 위한 볼륨 합계.</li>
			<li>필터 보다 0.02 µ m 3와 빈의 볼륨 아래 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 밖으로 표면 크기. 예를 들어 0.02-같은 저장소를 사용 하 여 0.04 0.04-0.08, 0.08-0.16, 0.16-0.32, 0.32-0.64, 0.64-1.28 1.28-2.56, 2.56 µ m 3 보다 큰. 
			참고: 0.02 µ m 3 mitonchodria 36 , , 37 38의 이전 게시 된 볼륨에 따라 미토 콘 드리 아 볼륨의 하한값 설정.</li>
			<li>쓰레기통 (0.02-2.56 µ m 3 이상)를 통해 각 빈 내 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 수와 표면의 총 수를 계산.</li>
			<li>신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 각 빈에서의 비율을 계산합니다. 수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 표면의 총 수로 나눈 빈 당.</li>
			<li>모든 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 합계.</li>
			<li>모든 미토 콘 드 리아 표면 볼륨의 합으로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 미토 콘 드리 아 신호 신경의 비율을 계산.</li>
			<li>모든 미토 콘 드 리아 표면 수로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 신경 볼륨 당 미토 콘 드리 아의 수를 계산.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

아니 충돌의 관심 선언.

이 프로토콜은 분리, 계량 및 크기와 인간의 피부 생 검에서 3d에서 IENFs 내 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 분석 설계 되었습니다. 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부동성 형광 immunohistochemistry는 얼룩 답사 연구44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석 하 고 설계 되었습니다. 이 절차는 confocal 현미경 이미지 및...

미토 콘 드리 아 세포 에너지, 칼슘, 그리고 괴 규제, apoptotic 세포 죽음1,2,3버퍼링 생산을 포함 하는 중요 한 세포 기능을 제공 합니다. 신 경계는 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 뉴런 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 형태로 세포 에너지의 높은 수준의 생성 제안 몸4 에 비해 높은 신진 대사 속도 있다. 많은 신경 기능 ATP5,6시 냅 스 특히 의존 하는 증거 문서. 따라서, 신경 세포 내 미토 콘 드리 아의 유통이 중요 합니다.
정보를 많이 보여주었다는 인신 매매와 신경 미토 콘 드리 아의 도킹 지난 10 년 동안은 매우 통제. 모터 단백질 신경 통해 특정 세포 구획을 미토 콘 드리 아를 배포에서 포함 된다. 뉴런 프로젝트 축 삭과 dendrites soma에서 멀리 떨어져 있기 때문에 미토 콘 드리 아의 인신 매매 하는 것이 특히 중요 합니다. Kinesin 모터 단백질 주로 직접 (소마)에서 참가자 다 모터 단백질 직접 (소마) 쪽으로 역행 운동7,,89 동안 microtubules 따라 미토 콘 드리 아의 매매 , 10. 같은 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 존재와 미토 콘 드리 아 밀매11,,1213의 방향에 영향을 주는 충 동 전도 셀룰러 신호가 있다.
미토 콘 드리 아, 수송 이외에 미토 콘 드리 아 노드의 Ranvier, 시 냅 스8,14, 등의 높은 에너지 요구를 있는 특정 세포 구획을 지역화 하려면 특수 단백질 17. 사실, 축 삭 내의 미토 콘 드리 아의 대다수는 비 운동9,13,18. Syntaphilin 앵커 걸 골격19-21을 다른 단백질 앵커 미토 콘 드리 아 동안 축 삭을 따라 microtubules에 미토 콘 드리 아 같은 특수 단백질. 성장 인자와 같은 칼슘 이온의 미토 콘 드리 아 운동 어디 그들은 필요한21,,2223지역에 지역화를 지원 하기 위해 보고 되었다.
함께 찍은, 밀매 하 고 미토 콘 드리 아의 도킹 뉴런의 적절 한 기능을 위해 생명 이다. 이 지원 중단 미토 콘 드 리아 인신 매매에 연결 되었습니다 Alzheimer의 질병, 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, Huntington의 질병, 유전 경련을 포함 하 여 여러 신경학 상 조건 paraparesis, 그리고 광섬유 위축15,,2425,26,27. 최근 연구 결과 당뇨병 신경 병, 당뇨병28,,2930,31과 관련 된 감각 손실에 대 한 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 병 리에 집중 했다 ,,3233. 가설은 당뇨병 피부 신경 결말의 감각 계획 내의 미토 콘 드리 아의 배포 변경입니다. 따라서, 기술은 시각화 하 고 계량 미토 콘 드리 아 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs), 지 루트 신경 절 감각 afferents의 원심 끝에 내에서 개발 되었다. 기술을 결합 하 여 특정 미토 콘 드리 아와 신경 섬유 라벨의 형광 immunohistochemistry confocal 현미경 검사 법부터 z-시리즈 수집 관련 신경의 분포를 측정 하기 위해 강력한 3 차원 이미지 분석 소프트웨어와 신호 미토 콘 드리 아에서 인간의 피부 펀치 생 검이이 목표를 달성 하기 위해.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:267px;">2% Zamboni&#39;s Fixative</td>
			<td style="width:200px;">Newcomer Supply, Middleton, WI&#160;</td>
			<td style="width:199px;">1459A</td>
			<td style="width:363px;">2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">BP399-4</td>
			<td style="width:363px;">To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:267px;">Image-iT FX Signal Enhancer</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">I36933</td>
			<td style="width:363px;">enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:267px;">Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td style="width:200px;">Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td>
			<td style="width:199px;">14730-1-AP</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:267px;">Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)</td>
			<td style="width:200px;">abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:199px;">ab110333</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as PDH</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11034</td>
			<td style="width:363px;">red-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">A-11032</td>
			<td style="width:363px;">green-fluorescent conjugated secondaryantibody</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:267px;">Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">A7906-100</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as BSA</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:267px;">Triton X- 100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:199px;">T9284</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as TX-100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:267px;">0.22 &#181;m Filter</td>
			<td style="width:200px;">EMD Millipore, Billerica 
			MA</td>
			<td style="width:199px;">MILLEX GP SLGP 033NS</td>
			<td style="width:363px;">0.22 &#181;m Millipore filter</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">13-374-10</td>
			<td style="width:363px;">Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:267px;">Non-calibrated Loop</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">22-032092</td>
			<td style="width:363px;">inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">96-well Assay Plate</td>
			<td style="width:200px;">Corning Incorporated, Corning, NY</td>
			<td style="width:199px;">3603</td>
			<td style="width:363px;">96-well flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">P-36931</td>
			<td style="width:363px;">DAPI staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:267px;">Microscope Cover Glass 50 x 24 mm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-544E</td>
			<td style="width:363px;">Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:199px;">12-550-15</td>
			<td style="width:363px;">Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:267px;">Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td style="width:200px;">Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">SP5</td>
			<td style="width:363px;">Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Volocity x64 Software&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Perkin Elmer, Waltham , MA</td>
			<td style="width:199px;">version 4.4.0</td>
			<td style="width:363px;">Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:267px;">Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td>
			<td style="width:200px;">Bitplane, Concord, MA</td>
			<td style="width:199px;">version 7.7.1</td>
			<td style="width:363px;">Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:267px;">Excel</td>
			<td style="width:200px;">Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td style="width:199px;">version Office 2013</td>
			<td style="width:363px;">Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:267px;">Optimum Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:200px;">Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td style="width:363px;">abbreviated as OCT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Leica Cryostat</td>
			<td style="width:200px;">Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:199px;">CM1850</td>
			<td style="width:363px;">Cryostat for cutting 50 &#181;m sections</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:267px;">CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:200px;">ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td>
			<td style="width:199px;">C10600</td>
			<td style="width:363px;">Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging and analysis of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers

이 프로토콜의 목표 intraepidermal 신경 섬유 내에서 미토 콘 드리 아 연구입니다. 따라서, 3D 이미징 및 분석 기술은 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하 여 평가 하는 감각 신경의 말 초에 있는 미토 콘 드리 아의 질병 유발 변경 개발 되었다. 프로토콜 형광 immunohistochemistry, confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 분석 기법을 결합 합니다. 상세한 매개 변수는 이러한 기술을 사용 하 여 신경 특정 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 구체적인 예를 제공 하기 위해 절차를 통해 정의 됩니다. 항 체 신경 라벨을 사용 했다 하 고 피부의 조직 섹션에서 미토 콘 드리 아 신호 펀치 생 검는 각각 신경 및 미토 콘 드리 아 녹색과 적색 형광 신호를 시각화 하는 간접 면역 형광에 의해 그 뒤를 이었다. 부터 Z-시리즈 이미지 confocal 현미경 검사 법으로 인수 했다 고 3D 분석 소프트웨어 처리 하 고 신호를 분석 하는 데 사용 되었다. 그것은 정확한 매개 변수, 설명에 따라 필요가 없습니다 하지만 얼룩, 수집 및 분석 단계를 통해 선택 하는 것 들과 일치 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜의 힘 그것은 다양 한 상황에 적용 한 형광 신호를 사용 하 여 그렇지 않으면 불가능 한 것을 혼자 공부 하는 다른 신호를 분리 하는 곳입니다.

시각화 및 인간 IENFs 내 미토 콘 드리 아의 정량화
형광 immunohistochemistry 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 시각화를 인간의 피부 생 검으로 여러 신호 동시 라벨에 대 한 수 있습니다. 96 잘 접시 immunohistochemistry 절차의 단계를 구성 하는 편리한 방법입니다. 그림 1 는이 구성 계정에 대 한 솔루?...

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Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

three-dimensional-imaging-analysis-mitochondria-within-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K 조회수.  University of Michigan Medical School. 이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

비디오: Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

연구

신경과학

Three Dimensional Vestibular Ocular Reflex Testing Using a Six Degrees of Freedom Motion Platform

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the vestibular organ results in mild to severe equilibrium problems, such as vertigo, dizziness, oscillopsia, gait unsteadiness nausea and/or vomiting. A good and frequently used measure to quantify gaze stabilization is the gain, which is defined as the magnitude of compensatory eye movements with respect to imposed head movements. To test vestibular function more fully one has to realize that 3D VOR ideally generates compensatory ocular rotations not only with a magnitude (gain) equal and opposite to the head rotation but also about an axis that is co-linear with the head rotation axis (alignment). Abnormal vestibular function thus results in changes in gain and changes in alignment of the 3D VOR response.
Here we describe a method to measure 3D VOR using whole body rotation on a 6DF motion platform. Although the method also allows testing translation VOR responses 1, we limit ourselves to a discussion of the method to measure 3D angular VOR. In addition, we restrict ourselves here to description of data collected in healthy subjects in response to angular sinusoidal and impulse stimulation.
Subjects are sitting upright and receive whole-body small amplitude sinusoidal and constant acceleration impulses. Sinusoidal stimuli (f = 1 Hz, A = 4&deg;) were delivered about the vertical axis and about axes in the horizontal plane varying between roll and pitch at increments of 22.5&deg; in azimuth. Impulses were delivered in yaw, roll and pitch and in the vertical canal planes. Eye movements were measured using the scleral search coil technique 2. Search coil signals were sampled at a frequency of 1 kHz.
The input-output ratio (gain) and misalignment (co-linearity) of the 3D VOR were calculated from the eye coil signals 3.
Gain and co-linearity of 3D VOR depended on the orientation of the stimulus axis. Systematic deviations were found in particular during horizontal axis stimulation. In the light the eye rotation axis was properly aligned with the stimulus axis at orientations 0&deg; and 90&deg; azimuth, but gradually deviated more and more towards 45&deg; azimuth.
The systematic deviations in misalignment for intermediate axes can be explained by a low gain for torsion (X-axis or roll-axis rotation) and a high gain for vertical eye movements (Y-axis or pitch-axis rotation (see Figure 2). Because intermediate axis stimulation leads a compensatory response based on vector summation of the individual eye rotation components, the net response axis will deviate because the gain for X- and Y-axis are different.
In darkness the gain of all eye rotation components had lower values. The result was that the misalignment in darkness and for impulses had different peaks and troughs than in the light: its minimum value was reached for pitch axis stimulation and its maximum for roll axis stimulation.
Case Presentation
Nine subjects participated in the experiment. All subjects gave their informed consent. The experimental procedure was approved by the Medical Ethics Committee of Erasmus University Medical Center and adhered to the Declaration of Helsinki for research involving human subjects.
Six subjects served as controls. Three subjects had a unilateral vestibular impairment due to a vestibular schwannoma. The age of control subjects (six males and three females) ranged from 22 to 55 years. None of the controls had visual or vestibular complaints due to neurological, cardio vascular and ophthalmic disorders.
The age of the patients with schwannoma varied between 44 and 64 years (two males and one female). All schwannoma subjects were under medical surveillance and/or had received treatment by a multidisciplinary team consisting of an othorhinolaryngologist and a neurosurgeon of the Erasmus University Medical Center. Tested patients all had a right side vestibular schwannoma and underwent a wait and watch policy (Table 1; subjects N1-N3) after being diagnosed with vestibular schwannoma. Their tumors had been stabile for over 8-10 years on magnetic resonance imaging.

A method is described to measure three-dimensional vestibulo ocular reflexes (3D VOR) in humans using a six degrees of freedom (6DF) motion simulator. The gain and misalignment of the 3D angular VOR provide a direct measure of the quality of vestibular function. Representative data on healthy subjects are provided

자유 모션 플랫폼의 여섯도를 사용하여 세 가지 차원 전정 안구 반사 테스트

The vestibular organ is a sensor that measures angular and linear accelerations with six degrees of freedom (6DF). Complete or partial defects in the ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

뇌 구조의 3차원 형상 모델링 및 분석

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...