이 작품은 건강 보조금 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08 NS061039-01A2, 신경 연구 및 발견, 미시간 대학의 A. 알프레드 터 브먼 의학 연구소의 프로그램입니다. 이 작품은 형태와 당뇨병과 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소의 건강 그랜트 5P90 DK-20572 국립 연구소에 의해 자금 미시간 당뇨병 연구 및 교육 센터의 이미지 분석 코어를 사용했습니다. 저자는 통각 바이오 마커 면역 기술의 초기 개발을 지원하기 위해 인간의 피부 샘플을 자신의 관대 한 기부에 대한 로빈슨 싱글과 고든 스미스 (유타 대학) 감사드립니다.

부품 번호 : 면역 배경 염색 펀치 피부 생검의 96 - 웰 플레이트 및 예방의 준비는 인간의 과목에서 수집 및 정착액 솔루션에서 12-24 시간 (2 % 0.75 M L-라이신 솔루션 (산도 7.4)와 파라 포름 알데히드와 0.05 mM의 나트륨과 요오드)에 대한 배양하는 4 ° C에서 앞에서 8을 설명했다. 샘플은 다음 다음 설치 미디어를 최적의 절삭 온도 (월), 그라 이오 스탯에 50 μm의 두께 섹션으로 절편에 포함, 최대 1 주일에 대해 4에 20 % 글리세롤 ° C와 생리 식염수 (PBS)를 버퍼 인산염 동결 방지합니다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 하나의 96 - 웰 플레이트에서 자유 부동 면역을 받아야 피부 섹션의 최대 수를 가능한 8 피부 섹션을 위해 설계되었습니다. DAY 1 : 1. 각질층의 비 특정 면역 반응성의 예방 <ol><li> 라벨 96 - 웰 플레이트 그림 1과 같이. </lI&gt; <li> 이미지-IT 96 - 웰 플레이트의 행 1에 각 우물에 배경 염색 11,12을 차단하는 효과 FX 신호 (이미지-IT)의 150 μl를 추가합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 행 2와 3의 각 우물에 1X PBS 150 μl를 추가합니다. </li><li> 환자 당 두 개의 50 μm의 섹션을 획득 : DL에서 찍은 생검에서 한 섹션 PT에서 찍은 생검의 한 부분입니다. 접종 루프 (LeLoop)는 형태 학적 손상을 방지하기 위해 다음에 린스 하나에서 섹션을 전송하는 데 사용됩니다. 부드럽게 이미지-IT를 포함,뿐만 행 1의 개인으로, 접종 루프를 사용하여 각 50 μm의 섹션을 전송할 수 있습니다. 플랫 로커에 RT에서 30 분 동안 이미지-IT의 섹션을 품어. </li><li> RT에서 10 분 1X PBS (행 2와 3)로 두 번 절을 씻어. 세정과 플랫 로커에 잘 플레이트를 놓습니다. </li></ol> 2. 5 % BSA 차단 솔루션 1 % 세정 용액의 조제 <ol><li> 생검 섹션 이미지-IT에서 배양하는 동안 솔루션을 차단 5 %를 준비TION (5 % BSA가 완전히 용해 될 때까지 BSA, 0.3 % TX-100, 0.1 M PBS-소용돌이 솔루션). </li><li> 4 행의 각 우물에 5 % BSA 차단 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> 접종 루프를 사용하여 5 % BSA 차단 솔루션의 각 우물에 섹션을 전송합니다. 플랫 로커에 1-2 RT의 시간 동안 5 % BSA 차단 솔루션 섹션을 품어. </li></ol> 3. 차 항체의 1 % BSA 세정 용액과 희석의 준비 <ol><li> 섹션 5 % BSA 차단 솔루션 배양하는 동안, 1 % 세정 용액 (1 % BSA, 0.3 % TX-100, 0.1 M PBS-소용돌이 솔루션을 BSA가 완전히 용해 될 때까지) 준비합니다. </li><li> 섹션 5 % BSA 차단 솔루션 배양하는 동안, 1 %는 헹굼 용액에 기본 항체를 희석. <ol><li> 여덟 절 (8 × 150 μL가 = 1,200 μL) 1,200 μL의 총이 필요합니다. 차 항체는 1,500 μL (20 % 추가 볼륨에 대한)에 만들어집니다. </li><li> 차 항체의 희석 : PGP, 1:500, TRK,1:500 1 %의 BSA는 솔루션을 세척. </li></ol></li></ol> 4. 일차 항체의 단면 생검의 배양 <ol><li> 96 - 웰 플레이트의 지정 우물 (5 행)로 희석 일차 항체 150 μl를 추가합니다. </li><li> 지정된 일차 항체 우물 (5 행)에 5 % 차단 용액 (4 행)에서 섹션을 전송합니다. </li><li> 건조 및 빛의 노출되지 않도록 파라 필름 (parafilm) 및 알루미늄 호일로 96 - 웰 플레이트를 밀봉하십시오. </li><li> 플랫 로커에 96 - 웰 플레이트 4에서 O / N ° C를 품어. </li></ol> DAY 2 : 5. 1 % BSA 세정 용액에 생검을 씻어 <ol><li> 각 행 6도, 7, 8에 1 % BSA 세정 용액 150 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 1 시간마다 1 %의 BSA 세정 용액 (행 6, 7, 8)에 절을 세 번 씻어. 세정과 플랫 로커에 알루미늄 호일과 장소에 잘 플레이트를 커버. </li></ol> 6. 차 항체의 희석 &lt;OL&gt; <li> 섹션 (행 8) 1 % BSA 세정 용액의 마지막 헹굼 배양하는 동안, 1 % BSA 세정 용액에 이차 항체를 희석 : <ol><li> 여덟 절 (8 × 150 μL가 = 1,200 μL) 1,200 μL의 총이 필요합니다. 이차 항체는 1,500 μL (20 % 추가 볼륨에 대한)에 만들어집니다. </li><li> 차 항체의 희석 : 1 % BSA 세정 용액의 TRK (알렉사 플 루어 647 당나귀 방지 염소, 1:250)에 대한 PGP (알렉사 플 루어 488 당나귀 안티 - 토끼, 1:250)에 대한. </li></ol></li></ol> 7. 이차 항체의 단면 생검의 배양 <ol><li> 96 - 웰 플레이트 자신의 지정된 우물 (행 9)에 희석 차 항체 150 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 이차 항체에 1 % BSA 차단 용액 (행 8) (9 행)에서 섹션을 전송합니다. </li><li> 건조 및 빛의 노출되지 않도록 파라 필름 (parafilm) 및 알루미늄 호일로 96 - 웰 플레이트를 밀봉하십시오. </li><li> 지정된 이차 항체 O의 섹션을 품어4시 / N ° 플랫 로커에 C. </li></ol> 8. 1 % BSA 세정 용액에 생검을 씻어 <ol><li> 행 10, 11, 12의 각도에 1 % BSA 세정 용액 150 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 1 시간마다 1 %의 BSA 세정 용액 (행 10, 11, 12)에 절을 세 번 씻어. 세정과 플랫 로커에 알루미늄 호일과 장소에 잘 플레이트를 커버. </li></ol> 9. 현미경 슬라이드 및 설치 단면 생검의 준비 <ol><li> 생검 섹션 1 % BSA 세정 용액 (행 12)의 마지막 헹굼에 배양하는 동안, 현미경 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 한 번에 하나의 슬라이드에 1 % BSA 세정 용액 50 μl를 놓습니다. </li><li> 1 % BSA 세정 용액 (행 12)에서 섹션을 제거하고, 지정된 현미경 슬라이드에 1 % BSA 세정 용액의 50 μL 드롭 놓습니다. 섹션의 위치를​​ 최적화 한 후, 예방 조치, bulbed 유리 피펫과 초과 1 % BSA 세정 용액을 제거시료에 닿지 않도록한다. </li></ol> 참고 : 섹션에 접혀 있지 않은지 확인하십시오, 표본 현미경 슬라이드의 표면에 평평해야합니다. <ol start="4"><li> 장소 1 하락 현미경 슬라이드에 조직 검사 가까운 DAPI와 시약을 장착 골드 antifade을 연장. 22x22 mm 현미경 유리 coverslip을을 부드럽게 생검에 배치하고의 드롭 DAPI의 드롭 골드 antifade 시약을 연장. 각 섹션에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 어둠 속에서 RT에서 O / N 현미경 슬라이드를 건조 시키십시오. </li></ol> 참고 : 피펫 팁을 사용하여 공기 방울을 제거합니다. 골드 antifade 시약을 연장 멀리 초과 닦아냅니다. 파트 B : 공 촛점 이미징 10. 공 촛점 이미징 <ol><li> 40X 기름 침지 (1.3 NA) 목적 및 FluoView 버전 5.0 소프트웨어와 함께 줌 두 번에 촛점 현미경 스캐닝 올림푸스 FluoView 500 레이저를 사용하여 이미지를 형광 신호. </리&gt; <li> 각각 543 nm의 헬륨 네온 녹색 레이저 633 nm의 헬륨 네온 레드 레이저를 자극하는 알렉사 플 루어 488와 알렉사 플 루어 647을 사용합니다. 알렉사 플 루어 488 신호가 빨간색 LUT에 의해 테이블​​ 위로 녹색보기 (LUT)와 알렉사 플 루어 647으로 표시됩니다. </li><li> 신호를 강화하기 위하여 400 μM에서 각각의 검출기 공 촛점 조리개를 설정합니다. 순차적 검사는 신호 분리를 극대화하기 위해 1,024 X 1,024 해상도로 촬영해야합니다. </li><li> 칼만 평균화 (두 프레임)와 1.2 μm의 Z-스텝 간격 (FluoView 소프트웨어에 의해 계산 된 최적의 스캔 장치에 따라)를 사용하여 입체 Z 시리즈를 캡처합니다. </li></ol> 파트 C : 입체 시각화 및 애니메이션 11. 세 가지 차원 (3D) 시각화 및 애니메이션 <ol><li> Imaris 64 소프트웨어에서 오픈 Fluoview 파일 (버전 7.3, 비트 플레인 AG) 3D 이미지 세트를 시각화합니다. </li><li> 조정으로 신경 특정 신호의 선명도를 향상시킬 필요가 표시됩니다. </li><li> SU를 생성피부 표피 경계를 시각화 할 수 rface. 경계를 그리려면 그리기 모드에서 윤곽 도구를 사용합니다. </li><li> 기본 형광 신호를 확인하기 위해 경계 반투명 표면을 할당합니다. </li><li> 3D 영화의 스냅 샷 이미지를 생성하는 3D 형광 신호의 정지 이미지를 캡처합니다. </li><li> 3D 영화를 만들기 위해 애니메이션 기능을 사용합니다. 이미지는 (그림 2, 3, 4) 개별적으로 병합 된 각 신호를 표시하는 360도 여러 번 회전 할 수 있습니다. 초당 15 프레임의 애니메이션을 200 프레임으로 구성된 영화를 만들려면 애니메이션을 설정합니다. 원시 AVI 파일로 각각의 동영상을 저장할 수 있습니다. </li><li> VirtualDub 프로그램 소프트웨어 (버전 1.9.4)를 사용하여 최종 AVI 동영상을 압축합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies.">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li><li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor/p38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes.">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li><li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li><li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies.">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+among+pain,+sensory+loss,+and+small+nerve+fibers+in+diabetes.">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies.">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li><li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다 수 있습니다.

IENFD의 측정은 널리 말초 신경 병증 13,14의 정도를 결정하는 데 사용되었다. 현재 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜은 표피의 기저막을 통과 신경 섬유의 밀도를 측정, 그것은 고려 축삭 분기 및 / 또는 신경의 형태 학적 변화를 고려하지 않습니다. 또한, 현재 IENFD 분석 PN 15 고통의 존재와 IENFD 상관 관계를 보여되지 않았습니다. 우리는 이전에 통각 IENFD의 ?...

현재, 작은 섬유 신경 병증 3, 6-8를 진단하는 데 사용할 수있는 피부 펀치 생검에서 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 의사에 대한 일반적인 방법입니다. 생검은 말초 다리 (DL), 외측 복사뼈 위 10cm, 그리고 근위부 허벅지 (PT), 전방 장골 척추 9 아래 20cm에서 가져옵니다. 모든 IENF는 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬의 연결 마커 10-12을 사용하여 레이블이 표시됩니다. 현재, 그것은 표준 사용하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 방법 브라이트 현미경 6 PGP 염색에 의해 결정 IENFD.입니다 또한 여러 연구 그룹은 PGP 면역 7-9에 대한 면역 형광 프로토콜을 사용했습니다. 작은 섬유 신경 병증은 일반적으로 신경 병증 성 통증과 연관됩니다. 또한 통증 처리를위한 필수 IENF의 역할을 이해하기 위해, 우리는 고통을 생성 섬유와 공동 레이블을 총 IENF하는 기술을 개발했다. Nocicep특히 Aδ TIVE IENF 및 C 섬유는, PGP와 IENF의 공동 레이블과 통각 마커, 트로포 마이 오신 수용체 키나제 A (TRK) 5를 통해 공부하실 수 있습니다. TRK A는 통각의 발전을 위해 필수적인 신경 성장 인자에 대한 높은 친화력 수용체이다. TRK 긍정적 인 통각 신경 섬유는 peptidergic 섬유 것을 표현 물질 P (SP) 및 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP). 이전 로리아와 동료 PN, 10 통각 마커와 협력 라벨 PGP 양성 IENF를 연구하는 두 배 레테르를 붙이는 기술을 적용했다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 TRK 양성 IENF하지만 TRK-음 IENF는 고통스러운 당뇨병 성 신경 병증 5의 동물 모델에서 발현이되었다는 것을 보여 주었다. 이 공동 라벨링 기술은 IENFD 및 PN과 관련된 형태 학적 변화를 연구 할 수있는 능력을 합계하는 통각 IENFD의 ​​정량을 비교하는 기능을 제공합니다. 통각 IENF 및 안돼요을 시각화 할 수있는 능력통각 IENFD에 총 IENFD의 ​​재 정량화 PN과 관련된 통증의 정도에 목표 고통의 존재에 대한 증거, 그리고 아마도 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 동물 모델의 피부에 적용됩니다. 이전의 연구에 비해, 현재의 프로토콜은 2D 이미지 분석에서 발생할 수있는 오류를 방지 할 수있는 기회를 만들고, 3D 이미지 분석을위한 방법을 설명합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

피부 펀치 생검은 일반적으로 말초 신경 병증 1,2의 진단 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 데 사용됩니다. 현재, 그것은 말초 다리 (DL) 및 길이에 따라 polyneuropathies 3의 평가를위한 근위 허벅지 (PT)에서 3mm 피부 생검을 수집하는 것이 일반적 관행이다. 그러나 IENFs의 다각적 인 특성으로 인해, 2 차원 (2D) 영상의 분석을 통해 신경 구조를 중복 검사하는 도전이다. 또한, 입체 (3D) 영상이 딜레마에 대한 더 나은 솔루션을 제공 할 수 있습니다. 현재 보고서에서, 우리는 고통스러운 신경 병증 (PN)을 연구하는 3D 이미지를 적용하는 방법을 제시한다. IENFs를 확인하기 위해 피부 샘플은 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬 신경 세포 마커의 면역 형광 분석을 위해 처리됩니다. 현재, 그것은 IENFD을 억제하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 표준 방법입니다브라이트 현미경 4를 사용하여 PGP의 면역 조직 화학 염색에 의해 채굴. 현재의 연구에서는, 우리는 PGP를 사용하여 총 IENFD를 식별하기 위해 이중 면역 형광 분석을 적용하고, 통각 IENF, 신경 성장 인자 5 (TRK), 높은 친화력 수용체 트로포 마이 오신 수용체 키나제 인식 항체의 사용을 통해. PGP와 TRK 항체 공동 염색 IENF의 장점은 명확 PGP 양성, 통각 섬유를 염색 PN의 연구를 혜택을 제공합니다. 이 형광 신호는 PN과 관련된 IENF의 통각 IENFD 형태 학적 변화를 확인하기 위해 정량화 할 수있다. 형광 이미지는 공 촛점 현미경에 의해 인수 및 3D 분석을 위해 처리됩니다. 3 차원 영상은 더 PN과 관련된 형태 학적 변화를 분석하는 회전 능력을 제공합니다. 함께 촬영, 형광 공동 염색, 공 촛점 이미징 및 3D 분석은 명확 PN​​의 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다.

우리는 PN 환자에서 PT와 DL 피부 생검에서 IENF의 형태를 연구하는 현재의 프로토콜을 적용했다. 피부는 3 과목에서 PN과 관련된 pathomorphology을 보여 유타 대학에서 수집되었다. 주제는 다음과 같습니다 : 사례 1 : 제 2 형 당뇨병 (: 15 달; 통증 점수 : 지속 시간 51)의 PN의 역사를 가진 51 세 남자 사례 2 : PN의 역사를 가진 56 세 남성 및 사례 3 : 제 2 형 당뇨병 (: 42 달; 통증 점수 : 지속 시간 46)의 PN의 역사?...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies at JoVE.com

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K 조회수.  University of Michigan. 고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

비디오: Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

연구

의학

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Objective Nociceptive Assessment in Ventilated ICU Patients: A Feasibility Study Using Pupillometry and the Nociceptive Flexion Reflex

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and long-term consequences of unresolved pain or excessive analgosedation, adequate nociceptive monitoring remains challenging in non-communicative, critically ill adults. In the intensive care unit (ICU), routine nociceptive evaluation is carried out by the attending nurse using the Behavior Pain Scale (BPS) in mechanically ventilated patients. This assessment is limited by medication use (e.g., neuromuscular blocking agents) and the inherent subjective character of nociceptive evaluation by third parties.
Here, we describe the use of two nociceptive reflex testing devices as tools for objective pain evaluation: the pupillary dilation reflex (PDR) and nociception flexion reflex (NFR). These measurement tools are non-invasive and well tolerated, providing clinicians and researchers with objective information regarding two different nociceptive processing pathways: (1)&#160;the pain-related autonomic reactivity&#160;and (2) the ascending component of the somatosensory system. The use of PDR and NFR measurements are currently limited to specialized pain clinics and research institutions because of impressions that these are technically demanding or time-consuming procedures, or even because of a lack of knowledge regarding their existence.
By focusing on the two abovementioned nociceptive reflex assessments, this study evaluated their feasibility as a physiological pain measurement method in daily practice. Pursuing novel technologies for evaluating the analgesia level in unconscious patients may further improve individual pharmacological treatment and patient related outcome measures. Therefore, future research must include large well-designed clinical trials in a real-life environment.

Pain assessment in anesthetized patients who cannot communicate with the outside world in any way remains challenging despite the development of innovative objective pain evaluation tools. In this project, the pupillary dilation reflex and the nociception flexion reflex are assessed in critically ill, mechanically ventilated adult patients.

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

복잡 한 대동맥 변칙의 3 차원 인쇄

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

유도 근관 치료: 근관 접근 공동의 3차원 계획 및 템플릿 지원 준비

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...