우리의 방법은 마우스 배아 줄기 세포에서 심장 필드 특정 심장 전구 세포를 생성하는 것을 목표로합니다. 이 심장 필드 기자 줄기 세포주는 선천성 심장 질환의 기본 메커니즘의 높은 처리량 연구를 허용, 유전 및 약리학적 조작에 복막하는 시스템을 제공. 몇몇 챔버 특정 선천성 심장 병이 있습니다.
시험관 내 심장 발생을 재구성함으로써, 이 프로토콜은 질병 기계장치 연구와 미래의 재생 치료의 개발을 허용합니다. 이 프로토콜은 심장 발달 도중 다른 챔버의 심장 전구 세포가 어떻게 지정되는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 2i 배지에서 0.1%젤라틴 코팅 T25 플라스크에서 형질전환 마우스 배아 줄기 세포를 성장시킴으로써 시작한다.
세포가 70~80%에 도달하면 PBS로 배양을 헹구고 플라스크당 트립신 1밀리리터를 추가하여 3분간 섭씨 37도에서 단일 세포로 배양을 전파합니다. 세포가 분리되면 DMEM에서 4밀리리터 10 FBS로 반응을 중화시키고 적절한 방법으로 세포를 계산합니다. 신선한 중간 농도당 5개의 세포에 약 3배 10으로 세포를 희석시키고, 원심분리에 의해 세포를 수집한다.
그런 다음 새로운 0.1 %의 젤라틴 코팅 T25 플라스크에 투석하기위한 신선한 2i 매체의 5 밀리리터로 펠릿을 다시 중단합니다. 심장 스페로이드로부터 CPC 생성을 위해, 분리된 형질전환 마우스 배아 줄기세포 샘플 중 6개에서 2.5배 10회 원심분리를 수집하고, SFD 배지의 25밀리리터에서 세포를 재보설한다. 세포 현탁액을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양용 150x 25mm 멸균 플레이트에 48시간 동안 플레이트를 넣습니다.
인큐베이션이 끝나면 심장 구체를 원적 튜브로 수집합니다. 스페로이드의 선택적 분리를 용이하게 하고 단일 세포를 피하기 위해 원심분리에 의한 스페로이드를 침전한다. 활성제 A의 밀리리터 당 1나노그램과 뼈 형태유전학 단백질 4의 밀리리터당 1.5 나노그램으로 보충된 신선한 SFD 배지의 25 밀리리터에서 스페로이드를 재중단합니다.
세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양용을 위해 동일한 배양 판에 스페로이드를 다시 플레이트로 다시 플레이트합니다. 다음 날, 원심 분리에 의해 심장 스페로이드의 모든 을 회수. 초저 부착, 세포 배양 인큐베이터에서 75센티미터 제곱 플라스크로 도금을 위한 신선한 SFD 배지 25밀리리터에서 분화된 배아 체를 48시간 동안 재중단한다.
형광 기자를 사용하여 심장 필드 특정 CPC의 격리를 위해, 원심분리에 의해 배아 체를 수집하고 3분 동안 섭씨 37도에서 트립신 1밀리리터로 3D 배양을 해리시한다. 인큐베이션의 끝에서, 세포를 해리하고 DMEM에서 10 %의 FBS의 4 밀리리터로 반응을 중화하기 위해 파이펫팅하여 잘 섞는다. 70 마이크로미터 여과기 위에 혼합물을 전달하여 비해리된 배아 체를 제거하고 원심분리에 의해 여과된 세포를 퇴적시한다.
형광 기자 발현으로 CPC를 정렬하려면 500 마이크로리터 FACS 솔루션의 펠릿을 다시 중단하고 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 얼음 위에 5 밀리리터 폴리스티렌 라운드 하단 튜브로 필터링합니다. 그런 다음 세포를 정렬하여 FACS에 의해 RFP 및 GFP 발현 세포를 분리하여 FBS의 1 밀리리터로 세포를 수집합니다. 표면 단백질 Cxcr4 발현에 기초하여 제1 심장필드 CC와 제2 심장필드 CPC를 분리하기 위해, 형광-컨쥬게이트 항 Cxcr4 항체로 보충된 PBS의 10%FBS의 300마이크로리터에서 단일 마우스 배아 줄기 세포 RFP 발현 심장 전구 세포를 재중단한다.
실온에서 5 분 후, 세척 당 신선하고 차가운 PBS의 1 ~ 2 밀리리터에 세포를 세 번 씻으시면. 마지막 세척 후, FACS 용액의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 5 밀리리터, 둥근 바닥 튜브로 40 마이크로 미터 여과기를 통해 세포를 필터링합니다. 그런 다음 Cxcr4 발식으로 세포를 정렬하여 Cxcr4 양성 및 부정적인 집단을 얼음에 튜브 당 1 밀리리터를 포함하는 개별 튜브로 수집합니다.
FACS 절연, 심장 필드 별 심장 전구 세포를 재배양하기 위해, 원심분리에 의해 정렬 된 세포를 수집하고 SFD 배지에서 펠릿을 다시 중단. 그런 다음 0.1%젤라틴 코팅, 384웰 플레이트에서 잘 4개의 세포에 약 3회 10회 종자한다. 세포 사멸이 정렬 후 지적되는 경우 각 웰에 10 마이크로 몰러 ROCK 억제제를 추가하십시오.
문화의 이틀 후, 자발적인 구타를 관찰한다. 도금 된 CPC의 능력을 분석하여 심근세포로 분화하기 위해, 12일째에 트립신과 분화하여 단일 심근세포를 분리하고 세포를 4% 파라포름알데히드로 재보종한다. 실온에서 30 분 후, 원심 분리에 의해 고정 된 세포를 수집하고 초과 고정을 제거하기 위해 PBS에서 펠릿을 세척합니다.
다음으로, PBS에서 10%FBS에서 세포를 재보중단하고, 마우스 안티트로포닌 T 항체로 세포 샘플의 절반을 배양하고 샘플의 나머지 절반을 음수 대조군으로 사용한다. 실온에서 30 분 후, 신선한 PBS에서 세포를 두 번 세척하고 적절한 이차 항체로 보충 된 10 %의 FBS 플러스 PBS로 샘플을 다시 중단하십시오. 실온에서 30분 간 배양한 후, 세척당 신선한 PBS로 세포를 두 번 세척하고 튜브당 PBS 200 마이크로리터로 세포를 재보종하여 유동 세포계에 대한 분석을 한다.
약 132시간의 분화 후, Tbx1-RFP 및 Hcn4-GFP 심장 전구 세포는 형광 현미경 검사법에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, GFP와 RFP 세포 둘 다 거의 같은 시간에 나타나고, 전구 세포의 2개의 인구는 상호 보완적인 패턴에서 근접하고 전형적으로 확장하는 것을 계속합니다. 액티비틴 A와 뼈 형태유전학 단백질 4의 농도를 조정하면 첫 번째 심장장 과 제2 심장 전구 의 백분율을 변경합니다.
유사하게, RFP 기자 마우스 배아 줄기 세포줄을 사용하여, 132시간의 분화 후, RFP 양성 심장 전구세포가 나타난다. Cxcr4, RFP 양성, Cxcr4 양성 및 RFP 양성에 대한 면역 염색 후 Cxcr4-음수 세포를 분리할 수 있습니다. 12일째에 심장 트로포닌 T에 대한 면역 염색은 첫 번째 심장필드 세포가 주로 심낭으로 분화한다는 것을 확인합니다.
유사하게, RFP 양성, Cxcr4-음성 심장 전구 세포에서 유래한 세포는 Cxcr4 단 양성 심장 전구 세포에 비해 훨씬 더 높은 비율로 심근구를 초래합니다. 때때로, 마우스 배아 줄기 세포는 효율적으로 분화하고 심장 필드 특정 심장 선조 세포의 아주 낮은 수를 형성하는 데 실패합니다. 사이토카인의 첨가의 타이밍, 농도 및 일관성과 세포의 수는 챔버 별 심장 전구 세포의 성공적인 생성에 매우 중요합니다.
이 절차에 따라, 조사자는 그들의 사양 및 기능에 추가 통찰력을 얻기 위하여 심장 전구 세포의 다른 인구의 생리적 특성을 분석할 수 있습니다.
