Name: isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
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국립 보건원 (DC에 NIH R15 NS067536-01A1), 국립 Vulvodynia 협회 (DC에 수상), 그리고 매 켈리 스터 대학교는이 작업을 지원했다. 인증 기관은 아놀드와 로벨 베크 재단 자금 매 켈리 스터 대학교 베크 학자 프로그램에서 교제를 받았다. BTF 및 TM은 JDRF 2-2011-662 지원합니다. 우리는 기술적 조언 박사 제이슨 Schenkel 박사 줄리아 루이스 감사, 그들의 도움과 지원에 대한 Chatterjea 랩의 모든 현재의 전 멤버.

주 : 통상적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수와 보관 8~12주 세 여자 ND4 스위스 웹스터 마우스는, 이러한 연구에 사용 하였다 (B13S1)에 사용되는 실험 프로토콜은 매 켈리 스터 대학교의 IACUC에 의해 승인되었다.. 옥사 졸론 1. 과민성 및 도전 <ol><li> 날 0 <ol><li> 4 L 뚜껑 유리 항아리의 하단에 메쉬 아래에 배치 흡수성 수건에 3 ㎖ 이소 플루 란을 추가하여 마취 챔버를 준비합니다. 피사체가 충분히 마취 때까지 여기에서 사용 ND4 암컷 마우스를 들어, 챔버 내의 시간은 30 ~ 60 초이고; 마우스 변형이 사용을위한 마취 관리를 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 각 마취 마우스의 뒷면을 면도하고 동물 머리 트리머를 사용하여 측면에. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 무수 에탄올로 -4-에 톡시 -2- 페닐 -2- 옥사 졸린 -5- 온 (옥스)의 2 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다. </li><li> 간단히 마취1.1.1에서 설명하고 약 20 μL 각의 여러 직렬 응용 프로그램에서 다시 면도 2 % 황소의 100 μl를 적용 할 이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스. 건조 할 수있는 솔루션을 직렬 응용 프로그램 사이에 5 ~ 10 초를 기다립니다. </li><li> 다시 이외의 지역에 2 % 황소 솔루션을 유출 방지 및 응용 프로그램 사이에 건조 할 수있는 솔루션을 기다려야주의하십시오. </li></ol></li><li> 일 5-7 <ol><li> 절대 에탄올 (황소)의 1 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다. </li><li> 부드럽지만 확실히 위를 향하도록 복부와 목, 꼬리베이스의 목덜미에 마우스를 고정하고 목은 약간 (복강 내 주사에 대한 파악과 유사) 아래로 기울어 여러 직렬 응용 프로그램에서 면도 측면에 1 % 황소의 100 μl를 적용 상술 한 바와 같이 시간을 복용 후 피부를 건조. </li><li> 대조군 마우스를 들어, 면도 플랜에 무수 에탄올 차량의 100 μL를 적용케이. </li></ol></li></ol> 2. 옆구리 피부 수확 <ol><li> 이산화탄소 흡입을 사용하여 쥐를 안락사, 조심스럽게 10cm 수술 용 가위로 측면 피부 (~ 피부의 25mm X 25mm)의 원하는 영역을 절제. </li><li> 깨끗한, 날카로운 칼날을 사용하여 수술, 플랭크 피부에서 과다 지방 및 결합 조직을 얻어 긁어. </li><li> 칼슘 또는 마그네슘, 5mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA),없이, 페놀 레드 10 ㎖ RT HBSS를 [함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 3 마우스의 옆구리 피부의 3 개 배치 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)]. </li></ol> 3. 사전 소화 조직 세탁기 <ol><li> 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브. </li><li> 인큐베이션 기간의 끝에서 10 초 동안 격렬하게 소용돌이. </li><li> 70 μm의 통하여 튜브의 내용을 변형여과기는 세척 버퍼를 무시하고 조직을 수집합니다. 단일 여과기는 생물 처리 그룹 내 전체 과정에 걸쳐 재사용 할 수있다. </li><li> 집게의 쌍을 사용하여, (전술 한 바와 같이 EDTA, HEPES, 및 FBS 함유) 신선 RT HBSS 매체 10 ㎖를 함유하는 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 여과기에서 플랭크 피부 옮긴다. </li><li> 조직 조각이 평균 면적의 약 2.2 mm X 2.2 mm가되도록 튜브 내로 침지 외과 해부 위 12.5 cm 쌍과, 플랭크 피부의 각 부분을 말하다. </li><li> 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브. </li><li> 배양의 마지막에 10 초 동안 격렬하게 소용돌이 </li></ol> 피부 4. 콜라게나 소화 <ol><li> , 70 ㎛의 여과기를 통하여 튜브의 내용물을 걸러 모아 새로운 50 ml를 함유하는 원뿔형 튜브에 10 ㎖ FRE 플랭크 피부 편을 전송할SH, RT HBSS 미디어가 0.7 mg을 보충 / 디를 콜라게나 ㎖로 </li><li> 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 소화 매체 피부 절편을 함유하는 장소 튜브. </li><li> 배양의 말에 적극적으로 10 초 동안 튜브의 소용돌이 내용. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 여과기를 통해 튜브의 필터 내용; 소화 조직을 함유하는 관류를 유지하고 스트레이너 버리고 피부 파편의 측면. </li><li> 350g에서 5 분간 HBSS 매체 원심 50ml에 플로우 스루를 세척하고 상등액을 가만히 따르다. </li></ol> 5. 밀도 구배 원심 분리 <ol><li> 혈청 피펫을 사용하여, 각각의 샘플에 대한 새로운 15ml의 원뿔형 튜브로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 3 ㎖ RT 67 % 밀도 구배 원심 분리 배지를 추가한다. </li><li> 페놀 레드와 HBSS에 5 ml의 RT 44 % 밀도 기울기 원심 분리 미디어 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 신사LY 층 혈청 피펫을 사용하여 67 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 샘플의 상부에 세포를 포함하는 44 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 5 ㎖. 가장 느린 속도에 피펫을 설정하고, 원뿔 튜브의 벽을 따라 피펫을 배치해야합니다. , 동요하지 않도록주의 중단, 또는 기울기를 반전. </li><li> 가장 낮은 설정으로 설정 가속, 원심 분리기 균형있는 것을 확인하고, 실온에서 20 분 동안 931 XG에 그라데이션을 브레이크를 해제하고, 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 조심스럽게 원심 분리기에서 그라디언트를 제거하고 부드럽게 똑바로 튜브를 들고 실험실 벤치에 운반 할 것. 5 ㎖ 플라스틱 전달 피펫을 사용하여, 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 44 % 및 67 %의 밀도 구배 원심 분리 및 전송 매체의 계면에 전지 층을 제거한다. 인터페이스가 표시되지 않는 경우, 단순히 67 % -44 %의 경계에서 액체의 약 2 mL를 제거합니다. </li><li> INTE으로부터 세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 채우기2 % 1X 빙냉 PBS에서 FBS, 350 XG에서 5 분 동안 원심 분리 세포 및 상등액을 가만히 따르다와 rface. 주 : 소화 단계가 37 ℃이며, 밀도 구배 원심 분리 배지를 RT 단계에 있기 때문에 이것은 세포가 냉각 될 수 있음은 처음 / 감기 있었다. 셀 (1)에 재현 탁 될 수있다 : 1 트리 판 블루 희석 수 및 생존력 정보이 시점에서 얻을 수있다. </li></ol> 6. 차단 및 염색 유세포 분석 <ol><li> 블록 FcγRII / 비특이적 항체 염색을 방지하기 위해 세포상의 수용체 III. 접합 결합하는 CD16 / 32 (2.4G2)에 대한 항체와 블록 FcγRII / III 수용체의 100 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, 1을 포함하는 2 % FBS와 PBS에 항체 마스터 믹스를 확인합니다. </li><li> CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b를 (M1 / 70)의 CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (대한 항체의 적절한 마스터 믹스와 차단 된 세포를 품어 30-F11) CD45R(RA3-6B2), CD62L는 (MEL-14), 및 LY-6G / LY-6C (GR-1) (RB6-8C5)뿐만 아니라 화려한 바이올렛 (510) 라이브 / 죽은 얼룩은 죽은 세포를 식별합니다. 희석 제조업체에서 권장하거나 이전에 연구자들에 의해 최적화 된 모든 항체를 사용합니다. (100) 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, (1) 모든 항체를 사용합니다. </li><li> 2 % FBS와 50 μL 1X PBS 염색 버퍼에 세포에 resuspend을 씻으십시오. 형광 데이터는 유세포에 취득 될 때까지 얼음 상에 유지한다. 주 : 보정 파라미터 형광 데이터의 취득 전에 림프 조직 및 (CD4 또는 CD8과 같은) 공통의 세포 표면 항원에 미리 최적화하는 것이 중요하다. </li><li> 분석 계측법 하류 흐름 세포의 수를 증가 염색 된 세포의 전체 샘플들로부터 데이터를 수집한다. </li></ol> 7. 다음과 같은 단계를 수행하는 표준 방법을 사용하여 유동 세포 계측법 데이터 분석 <ol><li> 앞으로 분산의 림프구 지역에 우선, 게이트측면 산란 (지역) 음모에 의해 (지역). </li><li> 그런 다음, 이중선을 분석 방지하기 위해 측면 분산 (폭)에 의해 전방 산란 (폭)를 사용하여 하나의 셀을 선택합니다. 이것은 또한 사이드 산란 플롯에 의해 가로 전방 산란 높이로 달성 될 수있다. </li><li> 이어서, 혈통 게이트 (는 CD11b, CD11c 양성 및 CD45R / B220) -negative 및 CD3 양성 이벤트 제외하는 대 식세포, 수지상 세포와 B 세포를 각각과 목표인지를 한정은 T 세포 구획 분석 이 여기로, T 세포에 침투 평가한다. </li><li> 다음, 라이브 / 죽은 얼룩을 제외 살아있는 세포에 문입니다. </li><li> 마지막으로, 관심의 세포 인구에 게이트 (대표 결과 섹션 참조). </li></ol>

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이러한 아토피 성 피부염이나 건선과 같은 피부 질환의 설치류 모델에서 피부에 상주하는 백혈구의 변화를 특성화하는 염증 세포의 유입과 질병 병리 사이의 기계적 연결을 이해하는데 중요하다. 여기에서 우리는 대부분의 생물 의학 연구 실험실에서 발견되는 기본 장비로 피부 조직에서 백혈구를 분리하는 경제적 인 방법을 설명합니다. 이 상대적으로 빠른 기술은 실험실 벤치에서 시간에 손?...

접촉 성 피부염, 습진, 건선, 봉와직염, 비 흑색 종 피부암에 곰팡이 감염 및 농양에 이르기까지 피부 상태는 전세계 50 가장 널리 퍼진 질병들로 발견되었고 2010 1 치명적 질병의 네 번째 선도적 인 글로벌 원인. 따라서, 다양한 피부 병변을 기본 분자 및 세포 메커니즘의 조사 연구에 필요한 활성 영역입니다. 설치류 모델은 아토피 성 피부염 (2), (3), 건선, 또는 포도상 구균 감염 4 같은 염증성 피부 질환의 이해에 도움이 현저하게되어왔다. 마우스 피부 조직의 효소 적 소화, 저렴하고 효율적이며 간단한 프로토콜 나은 피부 질환의 병태 생리를 이해 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 세포의 제제를 제공 할 수있다. 여기서, 간단하고 경제적 인 방법은 마우스 피부 효소에 대해 기재되어 다이제스트조직 및 세포 배양, 생체 대체 전송에 사용할 수있는 피부 침투 백혈구의 분리, 유세포 분석 및 분류 또는 유전자 발현 연구를 흐른다. 이 절차의 목적은 통상적으로 전체적인 맞춤 시약 키트 및 기계적 dissociators와 연관된 비용을 최소화하면서 높은 세포 생존율과 피부 백혈구 침윤의 단일 세포 현탁액을 제조하는 공정이다. 기존의 피부 조직 해리 방법 5-7 낮은 세포 생존 및 표면 마커의 무결성 결과, 또는 사용자 정의 효소 키트와 고가의 조직 해리 기계 8-11 필요할 수 있습니다. 마우스 귀 피부 조직의 소화가 합리적으로, 12 ~ 13 유행 높은 각화 피부 조직을 소화하는 동안 (예를 들면 측면에서) 비 세포 파편 많은 양의 오염 된 세포 준비가 발생할 수 있습니다. 최근의 연구에서, 자이드와 동료가 2.5 mg을 90 분 동안 마우스 측면 피부를 소화 / ㎖ 디스 파제, FOLLO3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 (7)에 의해 45 분 결혼. 또 다른 연구에서, 이들 연구자들은 트립신 / EDTA, 콜라겐 III의 사용을 포함하는, 2.5 시간의 조합으로 여러 소화 배양을 사용하고, (5) 디스 파제. 다른 제조업체의 트립신으로 처리 잴 포유 동물 세포에서 14-15 세포 표면 단백질의 무결성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 트립신의 사용은 피부 효소 소화에 권장되지 않는다. 또한, 디스 파제는 CD4 및 CD8α T 세포의 증식 능력에 심각한 영향을 미칠 수 및 CD62L (16)와 같은 일반적인 T 세포 활성화 마커를 포함, 최소 20 분자의 표면 풍요 로움에 영향을 미칩니다. 다른 프로토콜은 소화 매체 (6)에 RPMI 1640을 사용합니다. 그러나, RPMI에 Mg2 +, Ca2 + 등의 존재는 광범위한 세포 응집 (17)가 발생할 수있다. 조직 분리를위한 이상적인 프로토콜은 높은 세포 생존 능력, 낮은 목표로한다세포 응집, 최소한의 손상의 수준은 표면 단백질을 세포합니다. 고품질 림프절 간질 세포 제제는 짧은 효소 배양, 칼슘 및 마그네슘이없는 배지 2+ 프로토콜을 사용하여 수행하고, 트립신을 피하고 18 디스 파제되었다. 그러나, 이러한 유형의 프로토콜은 전체 마우스 피부의 해리에 대해 확립되지 않았다. 여기에서, 프로토콜은, 해리 분리 및 알레르겐 - 도전 마우스 옆구리 피부에서 피부 백혈구 침윤을 풍부하게 기재되어있다. 간략하게, 절제된 피부 소화 조직을 연화 초과 각질이나 지방 조직을 제거하기 위해 1 시간 동안 10 % 소 태아 혈청 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)로 미리 배양된다. 이것은 0.7 mg을 함께 30 분간 효소 분해 단계 뒤에 / ㎖의 콜라게나 D. 콜라게나 D 그것을 만드는 최소 세포 표면 마커의 농도에 대한 영향, 및 시험관 (16, 18)에서 T 세포 증식에는 영향을주지표면 단백질의 특성을 포함하는 애플리케이션에 매우 적합하다. 효소 분해 후, 불연속 밀도 구배 원심 분리는 단일 세포 현탁액으로부터 상피 세포 및 잔해를 제거하고, 조혈 세포 농축 하였다. 중요한 것은,이 절차는 비싼 열 기반 자기 세포 분리 시약 및 티슈 기계 8-11 해리를 방지하고 기본 생의학 연구소에 위치한 재료 및 장비로 수행 될 수있다. 여기에서이 프로토콜 (19 각색) 이전에 감응 ND4 스위스 쥐 합텐 옥사 졸론 (황소)와 측면 피부에서 도전 세번 백혈구를 분리하는데 사용 하였다. 세포는 파라 메트릭 멀티 - 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 이 기술은 최소한의 파편과 계측법 영향 SK에 T 림프구와 호중구의 침윤을 측정하기 위해 파라 메트릭 다중 흐름으로 분석 하였다 격리 림프구의&gt; 95 %의 생존율을 가진 세포 현탁액을 수득에서.

<table><tbody><tr><td>HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>HEPES, &amp;ge;99.5% (titration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8.5-9.5 (25&amp;deg;C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&amp;nbsp;</td><td>Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td></tr><tr><td>4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Dissolve in 100% EtOH at 50&amp;deg;C for 15 minutes on a rotating plate.</td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD3&amp;epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD8&amp;alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Viability dye for flow cytometry</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Cell analyzer (18 parameters)</td></tr><tr><td>Collagenase D from &lt;I&gt;Clostridium histolyticum&lt;/I&gt;</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&amp;nbsp; Store immediately at -20&amp;deg;C for up to six months.</td></tr><tr><td>ND4 Swiss female mice</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#039;s IACUC guidelines.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

콜라게나 D 미디어 처리 대조군과 비교시 비장 세포는 T 세포상의 CD4 및 CD8 α 비슷한 수준의 치료를 보여 먼저, T 세포의 서브 세트에 리니지 및 활성화 마커의 주파수 및 풍부 표면에 콜라게나 D의 잠재적 효과는 대조군으로 차 림프 조직을 사용하여 평가 하였다. ?...

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Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K 조회수.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

발생학

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Murine Dermal Lymphatic Capillaries에서 내피 세포 분리

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

저자 스포트라이트: Magnetic Bead-Based Isolation of murine Dermal Lymphatic Endothelial Cells

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

요약

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브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)