Os Institutos Nacionais de Saúde (NIH R15 NS067536-01A1 para DC), a Associação Nacional Vulvodynia (prêmio para DC), e Macalester College apoiaram este trabalho. CB recebeu uma bolsa do Macalester College Beckman Scholars Programa, financiado pela Fundação Arnold e Mabel Beckman. BTF e TM são suportados por JDRF 2-2011-662. Agradecemos ao Dr. Jason Schenkel e Juliana Dr. Lewis para o conselho técnico, e todos os membros atuais e antigos do laboratório Chatterjea pela sua ajuda e apoio.

Nota: os ratos 8-12 semanas de idade do sexo feminino ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água, foram utilizados para estes estudos O protocolo experimental utilizado (B13S1) foi aprovado pelo IACUC do Macalester College.. 1. Sensibilização e Desafio com Oxazolona <ol><li> Dia 0 <ol><li> Prepare a câmara de anestesia por adição de 3 ml de isoflurano para toalhas absorventes colocados por baixo da malha na parte inferior de um frasco de 4 L com tampa de vidro. Para os ratinhos fêmea ND4 usado aqui, o tempo na câmara é de 30-60 segundos até que o sujeito está adequadamente anestesiados; otimizar a administração do anestésico para a cepa do mouse está sendo usado. </li><li> Raspar as costas de cada rato anestesiado e flanquear usando um aparador de pêlos do animal. </li></ol></li><li> Dia 1 <ol><li> Adicione uma solução a 2% de 4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa. </li><li> Resumidamente anestesiarcamundongos, usando anestesia isoflurano, conforme descrito no ponto 1.1.1 e aplique 100 l de 2% Ox ao raspou de volta em várias aplicações em série de cerca de 20 mL cada. Espera 5-10 seg entre aplicações em série para que a solução seque. </li><li> Tome cuidado para não derramar a solução 2% boi em outras regiões do que a parte de trás, e esperar que a solução para secar entre as aplicações. </li></ol></li><li> Dias 5-7 <ol><li> Adicione uma solução de 1% (OX) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa. </li><li> Gentil mas firmemente imobilizar o mouse na nuca do pescoço e base do rabo com abdômen virado para cima e pescoço ligeiramente inclinada para baixo (semelhante a uma espera por uma injecção intraperitoneal) e aplicam-se 100 ul de 1% do boi para o flanco raspada em várias aplicações em série e tendo o tempo necessário para secar a pele depois como descrito acima. </li><li> Para ratinhos de controlo, aplicar 100 ml de etanol absoluto veículo para o flan raspadak. </li></ol></li></ol> 2. Flanco Pele Colheita <ol><li> Eutanásia ratinhos utilizando dióxido de carbono inalação, e excisar cuidadosamente a área desejada da pele do flanco (~ 25 mm x 25 mm de pele) com 10 cm tesouras cirúrgicas. </li><li> Usando uma lâmina cirúrgica limpo, afiado, raspar o excesso de gordura e tecido conjuntivo da pele do flanco. </li><li> Colocar 3 pedaços de pele do flanco de 3 ratinhos em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de HBSS RT [com vermelho de fenol, sem cálcio ou magnésio, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinoetanossulfónico (HEPES), e 10% de soro fetal de bovino (FBS)]. </li></ol> 3. Pré-lavagem de tecidos digestão <ol><li> Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final do período de incubação. </li><li> Coe o conteúdo do tubo por meio de um 70 uMfiltro para descartar o tampão de lavagem e recolher o tecido. Um único filtro pode ser reutilizada durante todo o procedimento dentro de um grupo de tratamento biológico. </li><li> Utilizando um par de pinças, transferir a pele do flanco do filtro para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de fresco, meios RT (HBSS contendo EDTA, HEPES, e FBS como descrito acima). </li><li> Com um par de 12,5 cm de tesouras de dissecção cirúrgica imersos no interior do tubo, mediu cada pedaço de pele do flanco de modo a que o pedaço de tecido média é de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm na área. </li><li> Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação </li></ol> 4. A digestão de colagenase da pele <ol><li> Coe o conteúdo do tubo através de um filtro de 70 | iM, recolher e transferir os pedaços de pele do flanco para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de freSH, meios RT HBSS suplementado com 0,7 mg / ml de colagenase D. </li><li> Colocar o tubo contendo o meio de digestão e fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Conteúdo vórtice de tubo vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação. </li><li> Filtrar o conteúdo de tubo através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml; manter o fluxo através contendo o tecido digerido e descartar o filtro e flanquear os restos da pele. </li><li> Lavar o fluxo de passagem em 50 ml de meio HBSS, centrifuga-se durante 5 min a 350 g, e decanta-se o sobrenadante. </li></ol> 5. centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Usando uma pipeta serológica, adicionar 3 ml de RT 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação em 1X tampão fosfato salino (PBS) para um novo tubo de 15 ml para cada amostra. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de RT 44% de densidade de meios de centrifugação em gradiente em HBSS com vermelho de fenol. </li><li> CavalheiroLY camada de 5 ml da centrifugação em gradiente de densidade media de 44%, contendo as células na parte superior da centrifugação em gradiente de densidade de amostra media de 67%, utilizando uma pipeta serológica. Certifique-se de definir a pipeta para a velocidade mais lenta, e coloque a pipeta ao longo da parede do tubo cônico. Tenha cuidado para não agitar, perturbar, ou inverter o gradiente. </li><li> Definir aceleração para a configuração mais baixa, desengatar o travão de, e centrifugar o gradiente a 931 xg durante 20 min à temperatura ambiente para garantir que a centrífuga é equilibrada. </li><li> Após a centrifugação, retirar cuidadosamente o gradiente da centrífuga, e transportar gentilmente para a bancada do laboratório segurando o tubo na posição vertical. Usando uma pipeta de 5 ml de transferência de plástico, remover a camada de células na interface dos 44% e 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação e transferência para um novo tubo de 15 ml. Se a interface não é visível, basta remover cerca de 2 ml de líquido a 67% a -44% do limite. </li><li> Encha o tubo cônico contendo células do interface com FBS a 2% em 1X PBS gelado, as células de centrifugação durante 5 minutos a 350 xg, e decanta-se o sobrenadante. Nota: Esta é a primeira vez que as células podem ser arrefecido / mantido frio desde passos de digestão são a 37 ° C e os passos de centrifugação de gradiente de densidade media são à TA. As células podem ser ressuspendidas numa solução 1: 1 de tripano azul e contagens de diluição e informação viabilidade pode ser obtido neste ponto. </li></ol> 6. Bloqueio e coloração para análise de citometria de fluxo <ol><li> Bloco FcyRII / receptores em células III para evitar coloração não específica de anticorpos. Para as experiências aqui descritas, tornar misturas principais de anticorpo em PBS com 2% de FBS contendo 1: 100 de diluição do anticorpo não conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para se ligar e bloquear os receptores FcyRII / III. </li><li> Incubar as células bloqueadas com misturas principais adequados de anticorpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8u (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), bem como violeta brilhante 510 ao vivo / morto mancha para identificar as células mortas. Use todos os anticorpos, quer a diluição recomendada pelos fabricantes ou previamente otimizado por pesquisadores. Para as experiências aqui descritas, utilizar todos os anticorpos de 1: 100 de diluição. </li><li> Lave as células e ressuspender em 50 ul de tampão de coloração 1X PBS com 2% de FBS. Manter em gelo até que os dados de fluorescência pode ser adquirido num citómetro de fluxo. Nota: É importante ter parâmetros de compensação pré-optimizada com o tecido linfóide e um antigénio da superfície celular comum (como CD4 ou CD8) antes da aquisição de dados de fluorescência. </li><li> Para aumentar o número de células por citometria de fluxo a jusante análise, a aquisição de dados a partir de amostras inteiras de células coradas. </li></ol> 7. Analisar Citometria de Fluxo de dados usando métodos padrão para realizar a passos descritos abaixo <ol><li> Primeiro, portão na região de linfócitos da dispersão para a frente(área) por dispersão lateral (área) enredo. </li><li> Em seguida, selecione as células individuais usando a dispersão para a frente (largura) por dispersão lateral (largura), para evitar analisando parelhas. Isto também pode ser conseguido com uma altura de dispersão para a frente pela altura dispersão lateral trama. </li><li> Então, portão na linhagem (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negative e CD3-positivo eventos, para excluir macrófagos, células células dendríticas, e B, respectivamente, e confine análises para compartimento de células T, se o objetivo é, como é aqui, para avaliar as células T infiltrantes. </li><li> Em seguida, portão em células vivas que excluem a vivo / morto mancha. </li><li> Finalmente, portão à população de células de interesse (ver secção resultados representante). </li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros ou outros para divulgar.

Caracterização alterações em leucócitos-pele residente em modelos de roedores de doenças da pele tais como dermatite atópica ou psoríase é importante para a compreensão de ligações mecânicas entre o influxo de células inflamatórias e a patologia da doença. Aqui nós descrevemos uma técnica econômica para isolar leucócitos de tecido da pele com equipamento básico encontrado na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica. Esta técnica relativamente rápida evita a utilização de máquinas de dissociação de tecidos caros e tubos personalizados e reagentes, ajudando a conservar os recursos, minimizando hands-on tempo na bancada do laboratório. Enzimático suave digerir e separação de gradiente descontínuo remover a maioria das células e detritos epiteliais, e as células isoladas podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo a análise de citometria de fluxo, separação de células, a transferência, a cultura de células e em ensaios de estimulação in vitro. Digestão enzimática com colagenase D não tem efeito sobre T superfície celular integridade marcador, e presera viabilidade celular ves. Este protocolo pode ser facilmente modificado para processar tecidos de outras regiões de flanco. Os passos mais críticos neste processo são 1) cuidadosamente remover qualquer adiposo e tecido conjuntivo durante a colheita da pele, 2) manipulação e tecido processamento rapidamente para maximizar a infiltração rendimento de célula enquanto minimiza a morte celular, 3) camadas suavemente o gradiente, e 4) cuidadosamente extracção da interface do gradiente. Antes de iniciar um experimento em grande escala é importante para a prática de densidade gradiente de centrifugação e remoção de camadas media interface. Pode-se praticar a colheita de células de um gradiente de densidade descontínuo, por trituração todo um baço murino através de um filtro de 70 | iM em tampão de coloração 1X PBS e realizando o gradiente de densidade, tal como descrito acima na etapa 5. É muito mais fácil de ver e extrai-se o interface entre o 44% mídia gradiente de densidade de centrifugação e os media 67% de densidade de gradiente usando splenocytes, devido ao grande número de células imunes presentes. Quando trabalhando com um gradiente de densidade, de bolhas deve ser evitada durante a pipetagem, e perturbações do inclinação deve ser minimizado. O tubo cónico que contém o gradiente devem ser manuseados com cuidado, mantido verticalmente em todos os momentos. Soluções de mídia centrifugação de gradiente de densidade deve estar sempre à RT, pipetas serológicos definidos para a velocidade mais lenta possível libertação, a centrífuga mantida a RT, definida como baixa aceleração com o travão desengatado, e cuidadosamente equilibrado antes de girar. Quando se trabalha com preparações para a pele que produzem pequenas quantidades de leucócitos infiltrantes, as células não são sempre visíveis na interface do gradiente. Assim, é importante fazer a centrifugação em gradiente de densidade media de 44% com HBSS contendo vermelho de fenol de modo que a interface pode ser facilmente visualizado, mesmo quando uma camada de células não pode ser discernido. Além disso, é importante ser gentil, mas rápida ao extrair, lavageme processar o tecido da pele para evitar a morte de células antes de a pele é colocada nos meios de HBSS. Se a viabilidade celular é baixa pureza ou, mais curto (~ 20 min) tempos de digestão, as concentrações ligeiramente mais baixas de colagenase D (~ 0,5 mg / ml), ou picagem do tecido mais finamente pode ser útil. Como sobre-digestão e degradação de tecidos pode contribuir para a morte da célula, investigadores terá de optimizar o tempo de digestão mínima que fornece um tamanho suficientemente grande amostra de células 17. O processo provavelmente vai exigir várias rodadas de otimização nas mãos de investigadores individuais de padronizar a técnica. Nível de actividade de colagenase D também podem variar entre os lotes de fabrico e adaptações tempo de digestão terá de ser feita para cada lote de enzima utilizada. Durante a otimização, é importante para as suspensões de células de referência (por exemplo mancha baço) purificados com e sem digestão enzimática com um passo vivo / morto mancha confiável, bem como célula imunológica linEAGE marcadores (por exemplo, CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, etc.) para certificar-se que as populações de células e marcadores de superfície de interesse são preservados durante o processo de digestão do tecido. Se possível, é útil para executar optimizações num citómetro de fluxo que pode medir a frente e a largura ou altura de dispersão lateral, bem como área, para excluir os agregados celulares. Por último, as suspensões de células devem ser examinadas sob o microscópio de luz para a avaliação visual de viabilidade e morfologia celular geral. As células pode ser contado manualmente, utilizando 0,4% de corante azul de tripano exclusão sob um microscópio de luz ou num citómetro de fluxo usando esferas de contagem. Para estudos que necessitam de quantificação mais rigorosa de tipos de células específicas no tecido excisado, os investigadores podem pesar ou medir o volume de fragmentos de tecido antes e após a digestão, e usar a extensão da digestão para estimar com mais precisão o número de subconjuntos de células presentes no ser tecidos analisada. Uma limitação do presenteprotocolo é que é especificamente adaptada para a purificação de células do sistema imunológico. Se se está interessado em isolamento, purificação e análise de outra população celular (por exemplo, pele células epiteliais), o gradiente de densidade com a configuração e a digestão enzimática protocolo ambos provavelmente necessidade de ser modificado e optimizado para melhor isolar as células de interesse. No entanto, este protocolo permite o isolamento e purificação de ambos os subconjuntos de células linfóides e mielóides e pode assim ser adaptado para a maioria das aplicações imunológicas. Outra limitação é que este procedimento não pode ser utilizado para diferenciar entre as populações de células que se infiltram na derme contra a epiderme da pele. Para alcançar este nível de diferenciação, este protocolo teria que ser ainda adaptado com passos adicionais para separar enzimaticamente da derme e epiderme, antes de ou em vez dos passos descritos aqui. Aqui, as amostras são reunidas a partir de 3 ~ ratinhos para facilitar a múltiplos parâmetros de análise de citometria de fluxo o que torna difícildetectar variabilidade entre repetições biológicas. No entanto, dependendo da aplicação a jusante de escolha, este protocolo pode ser facilmente modificado para produzir e utilizar amostras de sujeitos individuais. Finalmente, o protocolo apresentado aqui para jovens, os ratos fêmeas ND4 podem precisar de ser modificados para ratinhos de diferentes idades, sexo ou estirpes de acordo com as necessidades dos investigadores. Em resumo, esta combinação de digestão enzimática suave e separação descontínua de gradiente proporciona um método simples, eficaz e económico para a purificação a partir de células imunes lesões inflamatórias da pele em ratos. Ele pode ser usado e adaptado amplamente através de uma variada gama de modelos de roedores de patologias da pele como uma ferramenta conveniente para avaliar a infiltração imune e isolar uma população pura, de leucócitos viável para aplicações a jusante.

Doenças da pele que variam de dermatite de contato, eczema, psoríase, celulite, infecções fúngicas e abcessos para cânceres de pele não-melanoma foram encontrados para estar entre as 50 doenças mais prevalentes em todo o mundo, ea quarta causa líder global de doenças não fatais em 2010 1. Por conseguinte, a investigação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes diversas patologias da pele é uma área de investigação activa e necessário. Modelos de roedores têm sido notavelmente útil na compreensão de condições inflamatórias da pele tais como dermatite atópica 2, 3 psoríase, ou infecção por Staphylococcus aureus 4. Protocolos de baixo custo, eficiente, simples e de digestão enzimática dos tecidos da pele do rato podem proporcionar preparações de células que podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante para melhor compreender a fisiopatologia de doenças de pele. Aqui, um método simples e econômica é descrito por digestão enzimática da pele do ratode tecido e isolamento de leucócitos que se infiltram na pele que pode ser utilizado para cultura de células, in vivo, a transferência adoptiva, análise de citometria de fluxo e classificação ou estudos de expressão de genes. O objetivo geral deste procedimento é para preparar uma suspensão única célula de leucócitos infiltrantes da pele com a viabilidade celular elevada, minimizando os custos tipicamente associados a custom kits de reagentes e dissociadores mecânicos. Métodos existentes de dissociação do tecido da pele 5-7 pode resultar em baixa viabilidade celular e da superfície integridade marcador, ou requerem kits de enzimas personalizadas e caras máquinas de dissociação tecido 8-11. Enquanto a digestão do tecido da pele da orelha rato é razoavelmente prevalente 12-13, digerindo o tecido da pele altamente queratinizadas (por exemplo, a partir do flanco) pode resultar em preparações de células contaminadas com grandes quantidades de detritos não celular. Em um estudo recente, Zaid e colegas digerido rato pele flanco, durante 90 minutos em 2,5 mg / ml dispase, folloconduzida por 45 min em 3 mg / ml de colagenase 7. Em outro estudo, estes investigadores usaram várias incubações com uma digestão combinada de 2,5 horas, incluindo a utilização de tripsina / EDTA, colagenase III, e dispase 5. A utilização de tripsina não é recomendado para a digestão enzimática da pele, como o tratamento com tripsina a partir de diferentes fabricantes, tem sido demonstrado que afecta de forma mensurável a integridade de proteínas da superfície celular em células de mamífero 14-15. Além disso, dispase pode ter efeitos significativos sobre a capacidade proliferativa das células CD4 e CD8u T e afetar a abundância de superfície de pelo menos 20 moléculas, incluindo T comum marcadores de ativação celular, como CD62L 16. Outros protocolos usar RPMI 1640 no meio de digestão 6. No entanto, a presença de Mg 2+ e Ca 2+ em RPMI pode causar agregação extensiva de células 17. Um protocolo ideal para a dissociação do tecido deve apontar para a viabilidade celular elevada, baixoníveis de agregação das células, e o mínimo de danos para a célula proteínas de superfície. Alta qualidade preparações de células do linfonodo estromal ter sido realizado com protocolos que utilizam incubações enzimáticas mais curtos, Ca 2+ e Mg 2+ meios de comunicação livres e evitar tripsina e dispase 18. No entanto, não foram estabelecidas protocolos deste tipo para a dissociação da pele inteira do rato. Aqui, é descrito um protocolo para dissociar, isolar e enriquecer leucócitos infiltrantes de pele desafiados com alergénio pele de ratinho flanco. Resumidamente, pele excisada é pré-incubada em Solução de Sal Equilibrada de Hank (HBSS) com 10% de soro fetal bovino durante 1 h para amaciar o tecido para a digestão e remover qualquer excesso de pele ou tecido gordo morto. Isto é seguido por um passo de 30 min de digestão enzimática com 0,7 mg / mL de colagenase D. colagenase D tem efeitos mínimos sobre a densidade de marcadores da superfície celular, e nenhum efeito sobre a proliferação de células T in vitro, 16,18, tornando-altamente adequados para aplicações que envolvem a caracterização de proteínas de superfície. A seguir à digestão enzimática, centrifugação descontínua de gradiente de densidade foi utilizada para remover as células epiteliais e os detritos a partir da suspensão de célula única e para enriquecer células hematopoiéticas. Importante, este procedimento evita os reagentes caros de separação baseados em colunas de células magnético e máquinas de dissociação de tecido 8-11, e pode ser realizada com equipamento e materiais encontrada num laboratório de investigação biomédica de base. Aqui este protocolo foi utilizado para isolar leucócitos de pele flanco desafiados três vezes com o hapteno de oxazolona (OX) em ratos previamente sensibilizados ND4 suíços (adaptado a partir de 19). As células foram analisadas utilizando citometria de fluxo multi-paramétrico. Esta técnica proporcionou uma suspensão de células com detritos mínima e&gt; 95% de viabilidade de linfócitos isolados que foram analisadas por fluxo multiparamétrica de citometria de medir a infiltração de linfócitos T e de neutrófilos para o SK afectadadentro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1213">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">55021C</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">EDTA disodium salt solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E7889</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td>
			<td style="width:179px;">MidSci</td>
			<td style="width:181px;">S01520HI</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Percoll, pH 8.5-9.5 (25&#176;C)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P1644</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Trimmer Combo Kit</td>
			<td style="width:179px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:181px;">CL9990-1201&#160;</td>
			<td style="width:396px;">Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E0753-10G</td>
			<td style="width:396px;">Dissolve in 100% EtOH at 50&#176;C for 15 minutes on a rotating plate.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">70-0161</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:457px;">anti-CD3e-BV650 (145-2C11)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">564378</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">47-0042-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD8a-BV785 (53-6.7)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">100749</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0112-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0114-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD44-BV711 (IM7)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">563971</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45-FITC (30-F11)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">35-0451-U025</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0452-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">104431</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">108407</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">Ghost Dye-BV510</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">13-0870-T100</td>
			<td style="width:396px;">Viability dye for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">LSR Fortessa</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td style="width:396px;">Cell analyzer (18 parameters)</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:457px;">Collagenase D from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:179px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:181px;">11088858001</td>
			<td style="width:396px;">Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&#160; Store immediately at -20&#176;C for up to six months.</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:457px;">ND4 Swiss female mice</td>
			<td style="width:179px;">Harlan</td>
			<td style="width:181px;">0-32</td>
			<td style="width:396px;">8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#39;s IACUC guidelines.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

A colagenase D tratada esplenócitos mostram níveis semelhantes de CD4 e CD8 α em células T, quando comparado com controlos tratados com media Em primeiro lugar, quaisquer efeitos potenciais de colagenase D sobre a frequência e abundância de superfície de linhagem e de ativação marcadores em subpopulações de células T foram avaliados utilizando tecido linfóide secundário como um controle. Uma suspensão de esplenócitos de ratos foi obtido ND4 e lavou-se durante 1 h com meio HBSS. Em seguida, metade das células submetidas a 0,7 mg / ml de colagenase D (tal como descrito na secção 4 acima). As restantes células foram ressuspensas em meio de controlo HBSS. Em seguida, ambas as frações esplenócitos foram processadas utilizando um gradiente de centrifugação de densidade, conforme descrito na Seção 5 acima. As células foram então coradas com anticorpos contra CD4 e CD8a superfície, e analisadas no citómetro de fluxo. Único, vivo, CD45 +, não-T linhagem - (B220 - CD11b -CD11c -), as células foram CD3ɛ + fechado para a análise, para excluir as células B, macrófagos, células dendríticas. Proteínas CD4 e CD8a foram igualmente detectado na superfície dos esplenócitos que tinha sido submetido a colagenase digestão D e os que não tinham sido expostos a enzimas com aproximadamente 60% ​​de CD4 + CD8a - células e 30% de CD4 - células CD8a + detectada quer com o tratamento ( Figura 1A). Portanto, colagenase D digest não afetou a freqüência relativa de CD4 e CD8u. As intensidades de superfície CD4 e CD8a unidades de fluorescência média geométrica (gMFI) nestes subconjuntos também foram comparáveis ​​entre os dois tratamentos; valores gMFI para CD4 foram 2,271 para tratados com enzima e 2243 para esplenócitos de controlo, respectivamente, e os valores gMFI para CD8a foram 536 para tratados com enzima e 520 para esplenócitos de controlo. Tratamento enzimático também não teve qualquer efeito sobre a densidade da superfície de marcadores de activação de células T CD44 ou CD62L nas células T CD4 + (Figura 1B). Valores de intensidade de fluorescência média geométrica para CD44 foram 669 para tratados com enzima e 654 para esplenócitos de controlo; valores gMFI para CD62L foram tratados com 1,523 para a enzima e 1517 para esplenócitos de controlo. Como digestão com colagenase D preserva a integridade de proteínas de superfície em células isoladas, o protocolo aqui descrito pode ser utilizado com confiança, para a análise de citometria de fluxo a jusante. Digestão com enzimas de purificação e gradiente de pele flanco células resulta em alta viabilidade celular Rendimento celular e viabilidade por cento da suspensão de células obtida acima foram avaliados utilizando exclusão com azul de tripano de corante 20. Este protocolo separação digestão e gradiente rendeu cerca de 250 células imunes viáveis ​​por mm 2 de tecido flanco em camundongos Ox-desafiados e cerca de 4 células imunes viáveis ​​por mm 2 de tecido em camundongos desafiados com veículoque foram previamente sensibilizados com Ox (Tabela 1). Digestão com enzimas de purificação e gradiente de pele flanco células resulta na recuperação robusta de células imunitárias Em seguida, a extensão de infiltração imune na pele foi determinada através da análise da abundância de proteínas de superfície de CD45 em células isoladas a partir do flanco de Ox-desafiado e ratinhos de controlo para avaliar a recuperação de células do sistema imunológico que se infiltram pele usando os métodos descritos aqui. CD45 é um marcador de linhagem hematopoiética pan-21. 95% de baixo para a frente e de lado de dispersão, as células individuais (gating não mostrado) em ratinhos desafiados-boi e 71% destas células nos controlos desafiados com veículo eram CD45 + células vivo (Figura 2). Foi detectado um aumento de ~ 67 vezes na infiltração de células CD45 + imunes na pele do flanco seguinte 3 desafios diárias boi, utilizando o processo aqui descrito (Tabela 1). Três desafios flanco boi resultar em infiltração acentuada de células T e neutrófilos A nossa técnica produziu uma população de células a partir da pele do flanco que poderia ser usado para detectar uma grande variedade de células mielóides e linfóides subconjuntos tais como Gr-1 + 22 neutrófilos, células T CD4 + e células T CD8a. Observamos ~ 6 vezes, 7 vezes ~, e ~ aumentos de 73 vezes na neutrófilos, células T CD4 + e células T CD8a, respectivamente, na sequência de 3 Ox desafios diários (Tabela 1). Foram calculados os aumentos multiplicando o número total de células viáveis ​​(exclusão de azul de contadas utilizando Trypan) por a percentagem de o fragmento de célula imune determinado para fora da porta de células viáveis ​​durante a análise de citometria de fluxo. Em seguida, dividiu o número de células viáveis ​​totais imunes, as células CD8a + Gr-1 +, CD4 +, ou nos ratinhos tratados com Ox pelos números correspondentes para os ratos de controlo do veículo, dandodobrar aumentos nos subgrupos de linfócitos. Gr-1 + neutrófilos representaram 42% de, CD45 + B220 único vivo - CD11b - CD11c - células em ratinhos tratados-boi e 10% desta população em ratinhos tratados com EtOH (Figura 2B). Em ratinhos tratados com boi, ~ 52% de células T CD3 + bloqueadas foram CD8a + e ~ 34% eram CD4 +, enquanto que em controlos de veículo, ~ 9% de células T foram CD8a + e 57% eram células CD4 + (Figura 2C) . Portanto, com a técnica descrita aqui, pele alérgica e não alérgica flanco pode ser processado para produzir suspensões de células individuais adequadas para alta-resolução caracterização de citometria de fluxo de infiltração de células imunes subconjuntos. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Células subconjuntos de pele do rato flanco </td><td> Ox / Ox (3) </td><td> Ox / EtOH (3) </td><td> Dobre Expansão (Ox / EThanol) </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> por mm 2 de tecido </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 262.7 </td><td> 5.3 </td><td> 49,3 </td></tr><tr><td> As células CD45 + imunes </td><td> 250,7 </td><td> 3.8 </td><td> 66,7 </td></tr><tr><td> CD4 + CD8 - </td><td> 6.5 </td><td> 0,9 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> As células CD8 + - CD4 </td><td> 10,6 </td><td> 0,1 </td><td> 72,9 </td></tr><tr><td> Os neutrófilos </td><td> 8.6 </td><td> 1,5 </td><td> 5.6 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. rendimentos celulares de pele flanco alérgica em camundongos fêmeas ND4. As células viáveis ​​isoladas da pele do flanco foram contadas utilizando exclusão com azul de tripano, e normalizado para células de tecido / mm 2, com base na área da pele isolada e o número de ratinhos agrupados por tissue preparação. Calculou-se a produção total de células imunes com base na detecção do antigénio CD45 hematopoiético na superfície da célula, e os rendimentos de subconjuntos de linfócitos com base em marcadores de superfície específica da linhagem. Em seguida, dividiu o número de células em ratinhos tratados-Ox pelos números de ratos de controlo do veículo, dando-nos dobrar aumentos nos subgrupos de linfócitos. Os dados apresentados representam dados combinados 2-3 ratos por tratamento, e são representativos de duas experiências independentes. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig1.jpg" /> Figura 1. enzima de digestão e purificação de gradiente de esplenócitos preservar subpopulações de linfócitos e marcadores de activação de células. Os esplenócitos lavada durante 1 h com meio HBSS, incubadas ou com colagenase D ou apenas meio HBSS e purificado utilizando um gradiente de densidade para remover detritos e células vermelhas do sangue. As células T foram identificadas como ao vivo, CD45 +, linhagem (B220, CD11b, CD11c) &lt;sup&gt; - e CD3ɛ +. Frequência de células CD4 e células T CD8a não se alterou após a digestão enzimática (A). Densidade de superfície de CD44 e CD62L em células T CD4 + não se alterou após a digestão enzimática (B). Os dados apresentados representam dados agrupados 2-3 ratos por tratamento de um único experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53638/53638fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig2.jpg" /> Figura 2. digestão com enzimas de purificação e gradiente de células da pele revelam infiltração imune distinta no controlo vs. desafiados de alergénio pele de ratinho flanco. Três desafios flanco Ox produzir um aumento de ~ 67 vezes em células imunitárias infiltrantes da pele em ratinhos previamente sensibilizados (ND4 suíços A). Três desafios do boi também provoked um aumento de ~ 6 vezes na Gr-1 + neutrófilos (B), e ~ 73- e ~ aumento de 7 vezes de células CD8a + e CD4 +, respectivamente (C). CD45 + células do sistema imunológico ao vivo são fechados a partir de células de dispersão de solteiro, de baixa para a frente e laterais; neutrófilos e células T fechado de B220 - CD11b - CD11c - células individuais ao vivo. As contagens foram realizadas usando um 1: 1 Trypan azul diluição após a separação em gradiente de densidade. Os dados mostrados representa dados agrupados 2-3 ratos em cada grupo de tratamento, e são representativos de duas experiências independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53638/53638fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K visualizações.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

Vídeo: Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...